李季蓉 楊紅 劉曉輝 姜慧明 李林翰

摘要：采用蘇丹黑B染色法從大連龍湖濕土壤中地分離獲得5株可產(chǎn)油真菌。經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，分別是土曲霉（Aspergillus terreus）、淡紫擬青霉（Paecilomyces lilacinus）、氈狀枝頂孢（Acremonium kiliense）、朱黃青霉（Penicillium minioluteuin）、橘黃青霉（Penicillium aurantiogriseurn）。采用酸熱法破碎細(xì)胞、甲醇—氯仿法進(jìn)行了油脂的提取并計(jì)算，確定其中土曲霉產(chǎn)油率最高，產(chǎn)油率為47.6%。

關(guān)鍵詞：濕地;篩選;產(chǎn)油真菌

中圖分類號(hào)：Q939 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-9944（2019）22-0180-03

1 引言

隨著全球社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人類對(duì)自然資源的開(kāi)發(fā)利用，石化資源已經(jīng)成為關(guān)系到各國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要資源[1]，包括微生物油脂資源在內(nèi)的生物能源開(kāi)發(fā)已經(jīng)成為世界各國(guó)的研究熱點(diǎn)[2～4]。微生物生長(zhǎng)具有生長(zhǎng)周期短、可再生、易發(fā)酵培養(yǎng)等特點(diǎn)而備受關(guān)注，早期國(guó)外研究者就從灰綠青霉（Penicillium glaucum）抱子中抽提出7%的脂肪[5]，截至目前已有部分微生物的油脂產(chǎn)物已在食品領(lǐng)域得以應(yīng)用[6]。本文通過(guò)從濕地土壤環(huán)境中分離獲得不同種類真菌菌株中篩選出具有產(chǎn)油能力的絲狀真菌，并對(duì)其產(chǎn)油率進(jìn)行測(cè)定，為微生物能源開(kāi)發(fā)提供重要生物資源。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料

樣品采集：通過(guò)5點(diǎn)取樣法從大連龍湖濕地土壤中取樣，將采集的樣品裝到無(wú)菌的離心管（50mL）中帶回實(shí)驗(yàn)室，4℃冰箱保存，48h內(nèi)分離完畢。

試驗(yàn)中使用的主要試劑：孟加拉紅培養(yǎng)基粉（MEA）;馬鈴薯土豆瓊脂培養(yǎng)基粉（PDA）;限氮培養(yǎng)基：葡萄糖40g，硫酸銨2g，磷酸二氫鉀7g，磷酸氫鈉2g，酵母粉1g，硫酸鎂1.5g，1000mL水;蘇丹黑B、甲醇、氯仿等。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 真菌菌株的分離純化

采用稀釋分離法在MEA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～10d，盡可能多地分離獲得可培養(yǎng)的絲狀真菌，再用PDA培養(yǎng)基對(duì)各個(gè)菌株進(jìn)行純化培養(yǎng)。

2.2.2 產(chǎn)油絲狀真菌篩選及油脂提取

將分離純化的種菌株接人限氮培養(yǎng)基內(nèi)，于28℃180r/min的恒溫?fù)u床上培養(yǎng)5d后，收集菌體以備用。將離心后得到的菌球用濾紙過(guò)濾后輕壓風(fēng)干，取菌體浸于蘇丹黑B染液中10min，再用95%酒精漂洗，至使濾紙呈現(xiàn)白色，觀察菌體顏色，若帶有藍(lán)黑色則說(shuō)明帶有脂類物質(zhì)。記錄菌株代號(hào)及菌體染色顏色程度。

2.2.3 油脂提取及產(chǎn)油率的計(jì)算

產(chǎn)油菌株在限氮培養(yǎng)基中培養(yǎng)7d，采用酸熱法將真菌細(xì)胞破碎[7]。破碎的真菌細(xì)胞液利用甲醇一氯仿法抽提油脂，液體中加入10ml，甲醇和10ml.氯仿，充分震蕩后于常溫，5000r/min下離心10min，取出下層氯仿層，向其中加入等體積的0.1%的氯化鈉溶液，混勻，離心，取出氯仿層。將氯仿層溶液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸去除氯仿，于105℃烘1h，冷卻后即得油脂，稱重。

產(chǎn)油率=油脂質(zhì)量/菌體干質(zhì)量×100

2.2.4 產(chǎn)油真菌的鑒定

觀察真菌菌落顏色、生長(zhǎng)速度、質(zhì)地等特征，同時(shí)顯微鏡下觀察真菌抱子形狀、顏色、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、菌絲分隔等特征，查閱相關(guān)真菌鑒定文獻(xiàn)，對(duì)產(chǎn)油真菌進(jìn)行形態(tài)分類地位鑒定。

3 結(jié)果與討論

3.1 濕地真菌分離及產(chǎn)油真菌的初篩

通過(guò)稀釋培養(yǎng)法從采集的樣品中共分離純化出35個(gè)菌株，經(jīng)限氮培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)后，菌體經(jīng)蘇丹黑B然后烘干后，得到5株產(chǎn)生深色脂類物質(zhì)的真菌，菌株標(biāo)號(hào)分別為Y-1，Y-5，Y-8，Y-13，Y-19，具體染色結(jié)果如圖1～5。

3.2 5株產(chǎn)油真菌產(chǎn)油率比較

如圖6所示，5株真菌產(chǎn)油率差別較大，其中土曲霉產(chǎn)油率最高47.6%，其次是朱黃青霉22%。淡紫擬青霉、氈狀枝頂抱和橘黃青霉產(chǎn)油率分別為17.6%、14.5%，而橘黃青霉產(chǎn)油率最低，僅為6.1%。

3.3 5株產(chǎn)油真菌的形態(tài)鑒定

經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察鑒定，5株可產(chǎn)油真菌分為是Y-8土曲霉（Aspergillus terreus），Y～19淡紫擬青霉（Paecilomyces lilacinus）、Y-5氈狀枝頂抱（Acremoni-um kiliense）、Y-13朱黃青霉（Penicilliumminiolute-um）、Y-1橘黃青霉（Penicillium aurantiogriseum），如圖7。

本文從濕地土壤中分離獲得的1株產(chǎn)油率較高的絲狀真菌土曲霉（Aspergillus terreus），為微生物油脂資源開(kāi)發(fā)提供重要菌種資源，同時(shí)也將對(duì)該菌株的發(fā)酵優(yōu)化條件及產(chǎn)油機(jī)理展開(kāi)進(jìn)一步深入研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]王萍，張銀波，江木蘭，等.多不飽和脂肪酸的研究進(jìn)展[J].中國(guó)油脂，2008，33（12）：42～46.

[2]林粵順，景旭東，周紅軍，等.微生物油脂研究進(jìn)展[J].仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，28（3）：66～70.

[3]易紹金，鄭義平.產(chǎn)油微生物的研究及其應(yīng)用[J].中外能源，2006（2）：90～94.

[4]Patricia S，Berndha R.Rainer K， et al.A sensitive，viable colonystaining method using Nile red fordirect screening of bacteria thataccumulate polyhydroxyalkanoic acids and other lipid storage com-pounds[J].ArchMicrobiol，1999（171）：73～80.

[5]Hockenhaull D T D.Progress in industrial microbiology[J].Hey-wood of Company LTD，1959（1）：191～208.

[6]黃建忠，施巧琴，周曉蘭，等.深黃被抱霉高產(chǎn)脂變株的選育及其發(fā)酵的研究[J].微生物學(xué)通報(bào)，1998（4）：187～191.

[7]林義，鐘添華，駱祝華，等.尼羅紅染色法篩選產(chǎn)油酵母及定量檢測(cè)胞內(nèi)油脂含量的研究[J].微生物學(xué)通報(bào)，2012，39（1）：125～137.

收稿日期：2019-10-31

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)青年基金項(xiàng)目（編號(hào)：31800007）;大連民族大學(xué)創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（編號(hào)：201812026063）

作者簡(jiǎn)介：李季蓉（1997-），女，大連民族大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院學(xué)生。

通訊作者：楊紅（1978-），女，副教授，博士，研究方向?yàn)檎婢诸悺?/p>