賈明珠

摘 要：本研究選用在黃淮麥區(qū)大面積推廣的八種小麥作為實(shí)驗材料，測定幼苗在熱脅迫后的質(zhì)膜透性、存活率等耐熱生理指標(biāo)。采用細(xì)胞膜熱穩(wěn)定性檢測方法，測量出相對電導(dǎo)率，分析質(zhì)膜透性差異的顯著性。通過cDNA凝膠電泳檢查提取基因的完整性，熱激相關(guān)基因的實(shí)時熒光定量表達(dá)分析法，對熱激關(guān)鍵基因及蛋白進(jìn)行定量分析。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中麥175、煙農(nóng)19、良星99和石優(yōu)17等新品種在熱脅迫后的質(zhì)膜透性相對比較小，熱穩(wěn)定性比較好，熱脅迫后存活率比較高，熱激相關(guān)基因HSP70的表達(dá)水平也比較高，表現(xiàn)出相對耐熱性。本研究的數(shù)據(jù)及結(jié)果，為黃淮麥區(qū)小麥耐熱機(jī)理和耐熱品種的培育提供了一定的理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：黃淮麥區(qū)小麥;熱休克蛋白;質(zhì)膜透性;耐熱性

中圖分類號：S512.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1671-2064（2019）21-0186-05

1 研究背景

小麥?zhǔn)俏覈匾募Z食作物，在糧食安全中具有非常重要的作用。隨著全球氣候變暖和人口的增長，研究和培育耐熱高產(chǎn)的農(nóng)作物新品種是當(dāng)前一個十分重要的課題。黃淮麥區(qū)小麥近年來經(jīng)常性受到干旱、高溫的影響，致使小麥種子干癟，造成產(chǎn)量嚴(yán)重下降[1-2]。研究表明，高溫脅迫對小麥的生長發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)均產(chǎn)生不利影響[3]。高溫時，植物可以通過熱激反應(yīng)產(chǎn)生熱激蛋白來保護(hù)植物，可以降低高溫的傷害，也可以被稱作高溫脅迫或者高溫鍛煉，可以使植物獲得耐熱性，從而更好地適應(yīng)高溫環(huán)境。

細(xì)胞或生物體（或離體培養(yǎng)的細(xì)胞）受到熱激條件影響，伴隨著正常蛋白質(zhì)的合成被抑制，新合成的一類遺傳上高度保守的特異蛋白質(zhì)被誘導(dǎo)且表達(dá)，稱為熱激蛋白（Heat Shock Proteins，HSPs）。熱激蛋白的積累是生物對于高溫的基本響應(yīng)，在高于植物正常生長溫度刺激下，HSP會被誘導(dǎo)合成，這個反應(yīng)從細(xì)菌到人類都存在，普遍存在于整個生物界。根據(jù)分子量（kD）的大小，熱激蛋白分為3類：HSP110s、HSP90s、HSP70s、HSP60s和小分子熱激蛋白。在應(yīng)激條件下，高等植物產(chǎn)生高分子量的熱休克蛋白（范圍在70000～100000之間），主要有HSP100s、HSP90s、HSP70s它們在熱脅迫下被顯著誘導(dǎo)。熱激蛋白通常分布在細(xì)胞壁、葉綠體、核糖體和線粒體中，這些組織都是高溫傳感器分布的部位。在正常生理狀態(tài)下，熱激蛋白主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，應(yīng)激狀態(tài)時，熱激蛋白迅速進(jìn)入細(xì)胞核和核仁行使功能。

HSP70家族包括4種高度保守的蛋白：HSP70、HSC70、GRP75和GRP78，這些蛋白具有多重功能。有研究者認(rèn)為HSP70可作為感溫計，細(xì)胞可以通過它感受特定的代謝失調(diào)。高溫時，植物可以通過熱激反應(yīng)產(chǎn)生熱激蛋白來在保護(hù)植物，以降低高溫的傷害。高粱（Sorghum bicolor）中HSP90基因在熱脅迫30～60min時，定量表達(dá)水平達(dá)到最高。小球藻HSP70B在熱脅迫2h后增加最明顯。HSPs的合成水平與植物生長的溫度密切相關(guān)，誘導(dǎo)合成HSP的理想條件是比正常溫度高出10℃的熱機(jī)處理。

細(xì)胞膜系統(tǒng)是熱損傷和抗熱的中心，細(xì)胞膜的熱穩(wěn)定性反應(yīng)了植物耐熱能力的大小。其原理是因為在高溫條件下細(xì)胞膜蛋白變性，膜脂液相化，膜透性增大，導(dǎo)致電解質(zhì)大量外滲，從而表現(xiàn)出熱損害。因此，認(rèn)為可以測定葉片外滲電導(dǎo)率來確定高溫的傷害。隨著脅迫溫度的升高，細(xì)胞膜透性均呈增加趨勢，因此細(xì)胞膜的熱穩(wěn)定性可以作為抗熱性指標(biāo)。本研究以目前黃淮麥區(qū)正在推廣的8個小麥品種（系）為材料，對耐高溫抗逆性進(jìn)行了探討，為小麥耐熱機(jī)理的研究和耐熱品種的培育提供了一定的理論基礎(chǔ)。

2 材料、儀器與實(shí)驗方法

2.1 實(shí)驗材料及種植

本實(shí)驗選用的小麥品種農(nóng)大212（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院選育）、中麥175（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所選育）、有濟(jì)麥22號（山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所選育）、中優(yōu)206、煙農(nóng)19（煙臺市農(nóng)科院小麥研究所選育）、新麥26（河南省新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育）、石優(yōu)17（河北石家莊市農(nóng)林科學(xué)院選育）、良星99（山東德州市良星種子研究所選育），都是目前華北地區(qū)生產(chǎn)上大面積種植的優(yōu)良品種。每個小麥品種選飽滿、大小一致的籽粒各80粒，經(jīng)0.3%的雙氧水處理過夜后，均勻播種到裝有營養(yǎng)土的8×8cm的小花盆中，每盆種20粒。置光照培養(yǎng)室內(nèi)（光16：暗8小時）培養(yǎng)10天，備用。

2.2 實(shí)驗儀器

分光光度計ScanDrop，PCR擴(kuò)增分析儀（powerCycler），化學(xué)發(fā)光凝膠電泳分析儀azurec300，qRT-PCR定量分析（Qtower2.2），TDS-3/TEMP，超凈純水機(jī)，光照培養(yǎng)箱。

2.3 實(shí)驗方法

2.3.1 質(zhì)膜透性（細(xì)胞膜熱穩(wěn)定性）測定

（1）取小麥幼苗葉片（10天齡），分為三份，用去離子水沖洗數(shù)次，使用醫(yī)療消毒剪刀將麥苗剪成1厘米長左右，分裝入編號的試管內(nèi)。加入去離子水10ml，用錫紙包住試管口，放在49±1℃水浴鍋中處理40min，取出后，室溫靜置20h。

（2）將試管內(nèi)浸泡液輕輕搖勻，靜置，測定電導(dǎo)率為T1。

（3）將試管口包好后放入120℃高溫滅菌鍋處理15min。

（4）取出試管后輕輕搖勻靜置，測定電導(dǎo)率為T2。

（5）由RI=T1/T2算出相對電導(dǎo)率，分析品種間質(zhì)膜透性差異。

2.3.2 幼苗存活率測定

（1）取10d未處理的小麥植株，計數(shù)每盆中的小麥苗數(shù)量。

（2）在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)20h，恒溫后，取出樣苗計存活數(shù)量，計算存活率。

2.3.3 小麥幼苗RNA的提取與純化

（1）實(shí)驗器材的處理：玻璃器皿經(jīng)180℃高溫處理6小時以上，研缽經(jīng)燃燒處理，消除RNA酶污染。

（2）藥品的處理：氯仿、異戊醇、乙醇等試劑要專用。

（3）其它器材如槍頭、離心管，其它試劑如超純水、醋酸鈉等，均需經(jīng)1‰DEPC水37℃處理過夜。

2.3.4 RNA的提取

在小麥幼苗進(jìn)行45℃處理的0、4、8、20小時，及恢復(fù)7天時，每盆分別剪取少量葉片，液氮速凍，用于RNA的提取。

（1）將上述小麥幼苗葉片在液氮中研磨成粉末，研磨過程中保持粉末的冷凍狀態(tài)。將0.1g左右的粉末轉(zhuǎn)移到2mL的離心管中。

（2）加入1ml Trizol試劑（RNA提取液，北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品），震蕩混勻，靜止5分鐘，再加入200μL氯仿，震蕩混勻。

（3）在4℃，12000rpm條件下離心10分鐘。

（4）轉(zhuǎn)移600μL上清至另一新的2mL離心管中，注意小心不要取到中間物質(zhì)。

（5）加入600μL氯仿，震蕩混勻。4℃，12000rpm離心10分鐘。

（6）將450μL上清轉(zhuǎn)移至一個新的1.5mL離心管中，加入300μL的冰異丙醇，混勻，-20℃放置30分鐘。

（7）4℃，12000rpm離心15分鐘;棄上清，用1mL70%的乙醇（用DEPC水配制）漂洗RNA沉淀。

（8）在4℃，9000rpm條件下離心5分鐘;棄上清，自然晾干（注意不要使RNA徹底干燥，否則很難溶解）。

（9）將RNA用50μL DEPC滅菌水溶解;用分光光度計檢測RNA的質(zhì)量和濃度，A260/A280比值在1.8～2.0之間;取2μlRNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測其完整性。

2.3.5 RNA的純化

（1）每一個離心管中分別加入以下試劑，輕輕混勻（若是從-80℃冰箱中取出RNA，需要先融化，混勻后才使用）：

RNA ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? xμL

10×DNase I buffer ? ? ? ? ? ?10μL

DNase ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 10μL

DEPC 水 ? ? ? ? ? ? ? ? ?（80-x）μL

RNAsin（40 U/μL） ? ? ? ? ? ?1μL

Total ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?100μL

（2）于37℃水浴30分鐘;反應(yīng)體系中加入300μLDEPC滅菌水;

（3）加入等體積的酚：氯仿（1：1），（200μL氯仿+200μL水飽和酚），冰上劇烈混勻10分鐘，盡量避免分層，靜置10分鐘;

（4）條件4℃ 15000g離心10分鐘;

（5）取上清350μL，加入1/10體積的3M乙酸鈉（pH5.2），混勻，然后，加入2倍體積的無水乙醇，混勻;-80℃放置1小時以上;

（6）于4℃ 15000g離心15分鐘;棄上清，用1mL70%的乙醇（DEPC水配制）洗滌沉淀，離心;晾干沉淀（3-5分鐘）;

（7）加入30μLDEPC滅菌水溶解;

（8）紫外分光光度計檢測RNA濃度，將其配成1ug/μL的工作液;

（9）取2μL RNA進(jìn)行電泳檢測其完整性。

2.3.6 RNA的反轉(zhuǎn)錄（cDNA第一鏈合成）與cDNA質(zhì)量檢測

（1）取一離心管（200μL），分別加入以下試劑：

總RNA ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?2μg

M13apn（10μM） ? ? ? ? ? ? 4μL

DEPC處理的雙蒸水 ? ? ? ? （11-X）μL

Total ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?15μL

（2）輕輕混勻，70℃水浴5分鐘;

（3）冰上冷卻5分鐘;

（4）加入以下試劑，反應(yīng)總體積為25 μL：

5×RT-buffer ? ? ? ? ? ? ? ? ?5μL

dNTPs（25 mM） ? ? ? ? ? ? ? ? 1μL

RNAsin（40 U/μL） ? ? ? ? ? ? 1μL

M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶 ? ? ? ? ? ? ? 1μL

ddH2O ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?2μL

Total ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 10μL

（5）用移液器輕輕吸打混勻，37℃溫浴90分鐘;

（6）于70℃溫浴15分鐘，滅活反轉(zhuǎn)錄酶活性;

（7）將合成產(chǎn)物稀釋5倍，即為工作液;

（8）用引物Tubulin2（5-ACCGCCAGCTCTTCCACCCT-3）和Tubulin3（5-TCACTGGGGCATA GGAGGAA-3）做PCR，檢測反轉(zhuǎn)錄效果。

2.3.7 PCR反應(yīng)體系

LA Taq的反應(yīng)體系：

LA Taq （5 U/μL） ? ? ? ? ? ?0.2μL

10 × bufferⅡ（Mg） ? ? ? ? ? ? ? 2μL

dNTP （2 mM） ? ? ? ? ? ? ? ? ? 4μL

上游引物（4 μM） ? ? ? ? ? ? ? ?2μL

下游引物（4 μM） ? ? ? ? ? ? ? ?2μL

ddH2O ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 9μL

模板DNA ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 1μL

反應(yīng)體系為 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 20μL

普通Taq酶的反應(yīng)體系：

Taq（2.5U/μL）0.2μL

10×buffer ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?2μL

dNTP（2mM） ? ? ? ? ? ? ? ? ?2μL

上游引物（4μM） ? ? ? ? ? ? ? 1μL

下游引物（4μM） ? ? ? ? ? ? ? 1μL

ddH2O ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 13μL

模板DNA ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 1μL

反應(yīng)體系 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 20μL

以上體系可以根據(jù)實(shí)際情況做適當(dāng)調(diào)整。

PCR反應(yīng)過程

95℃ ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?3-4min

95℃ ? ? ? ? 30sec

55-65℃ ? ? ? ? 40sec ? ?35個循環(huán)

72℃ ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?1-2min

72℃ ? ? ? ? ? 10min

15℃ ? ? ? ? ? 5min

2.3.8 小麥幼苗熱激相關(guān)基因的表達(dá)分析

以合成的cDNA為模板，以小麥Ta4045（ubiquinol-cytochrome C reductase iron-sulfur subunit）為內(nèi)參基因，用hsf05、hsf06、hsf10、hsp16、hsp70及hsp90基因特異正向、反向引物在德國analytikjena qRT-PCR定量分析（Qtower2.2）進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR，檢測不同處理時間熱激相關(guān)基因的表達(dá)模式。

3 實(shí)驗結(jié)果與分析

3.1 比較恒溫培養(yǎng)不同時間后小麥的形態(tài)差異

中麥175、石優(yōu)17、良星99、煙農(nóng)19和農(nóng)大212等5個品種在經(jīng)過恒溫培養(yǎng)22h、44h的熱激處理后，麥苗長勢比較穩(wěn)定，麥葉蔥綠，表現(xiàn)出較高的耐熱性能。中優(yōu)206、新麥26和濟(jì)麥22在經(jīng)過長達(dá)22h、44h的熱激處理后，麥葉有枯黃現(xiàn)象，出現(xiàn)萎蔫，從麥葉外形上表現(xiàn)出耐熱性較差。

3.2 質(zhì)膜透性檢測

為了明確本實(shí)驗8個小麥品種幼苗的耐熱性，我們測定了其幼苗葉片在熱激處理后的電導(dǎo)率，電導(dǎo)率的大小反映出質(zhì)膜透性的大小，即質(zhì)膜的熱穩(wěn)定性能。煙農(nóng)19、石優(yōu)17和中麥175的幼苗葉片在熱激處理后的電導(dǎo)率比較低，說明其質(zhì)膜透性小，熱穩(wěn)定性比較好;良星99、農(nóng)大212和中優(yōu)206的電導(dǎo)率中等，而新麥26和濟(jì)麥22的電導(dǎo)率高，說明其質(zhì)膜透性大，熱穩(wěn)定性差，其中以濟(jì)麥22為最大，其電導(dǎo)率高達(dá)80%以上（見圖1）。

3.3 幼苗存活率檢測

農(nóng)大212和煙農(nóng)19的存活率分別為48.8%和55.8%;而中優(yōu)206和新麥26存活率較低，其存活率分別為20.7%和26%;濟(jì)麥22的存活率最低，其存活率只有9.5%。說明這幾個小麥品種的幼苗耐熱性有較大差異，中麥175、石優(yōu)17、良星99、煙農(nóng)19和農(nóng)大212幾個品種耐熱性較好，而中優(yōu)206、新麥26和濟(jì)麥22耐熱性較差（見表2）。這跟上述質(zhì)膜透性的檢測結(jié)果基本一致。

3.4 小麥材料中提取的RNA和cDNA凝膠電泳

分別提取小麥材料的總RNA，并經(jīng)RNAseI處理后，用MMLV酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后用小麥的持家基因TaTubulin引物檢測cDNA的質(zhì)量。如圖2A所示，所有樣品的RNA都含有完整的未降解的RNA，電泳圖譜應(yīng)可清晰看到18s rRNA、28s rRNA、5s rRNA的三條帶且28s rRNA的亮度應(yīng)為18s rRNA的兩倍。提取的總RNA必須完整，凝膠電泳圖中條帶包括18s，28s的完整性以及5s的完整性。圖2B所示所有樣品都能擴(kuò)增出目的產(chǎn)物，表明合成的cDNA質(zhì)量比較好，可以用于下一步的表達(dá)分析。

3.5 小麥的持家基因TaTubulin引物特異性檢測

為了準(zhǔn)確獲知小麥熱激相關(guān)基因的表達(dá)情況，我們首先對這些基因表達(dá)引物的特異性進(jìn)行了檢測，如圖3所示，絕大多數(shù)基因均能擴(kuò)增出單一目的條帶，說明引物特異性比較好，可用于實(shí)時熒光定量PCR實(shí)驗。

3.6 熱激相關(guān)基因?qū)崟r熒光定量表達(dá)模式分析

高溫時，植物可以通過熱激反應(yīng)產(chǎn)生熱激蛋白來在保護(hù)植物自身，以降低高溫的傷害。HSPs的合成水平與植物生長的溫度密切相關(guān)，誘導(dǎo)合成HSP的理想條件是比正常溫度高出10℃的熱機(jī)處理。HSPs在細(xì)胞活力的保護(hù)和細(xì)胞受高溫到脅迫后其功能的恢復(fù)上具有重要作用。熱應(yīng)激蛋白按分子量大小可分為HSP100、HSP90、HSP70、HSP60及小分子HSP，每個家族又有多個成員。由于近年來小麥產(chǎn)區(qū)持續(xù)干旱，使干旱造成的生產(chǎn)損失越來越嚴(yán)重，因此對作物抗旱性的研究已經(jīng)引起人們廣泛重視。

本研究中，通過對8種小麥熱激相關(guān)基因進(jìn)行實(shí)時熒光定量分析（圖4A、B、C），HSP90和HSP70在熱脅迫后，所有品種中其相對表達(dá)水平比較高，尤其是HSP90基因。它們的表達(dá)趨勢是先升后降，HSP90的相對表達(dá)水平在熱激4小時不同品種間除中優(yōu)206外差異不是很顯著，在熱激處理8小時煙農(nóng)19和濟(jì)麥22達(dá)最高表達(dá)水平。而HSP70基因在熱激處理后，煙農(nóng)19，良星99，濟(jì)麥22和新麥26的表達(dá)水平明顯比其他四個品種高。HSP16則對熱激處理反應(yīng)比較弱，除濟(jì)麥22和煙農(nóng)19在熱激處理20小時表達(dá)水平升高較多外，其余品種的表達(dá)水平都較低。說明HSP90、HSP70和HSP16都受熱激誘導(dǎo)表達(dá)，但HSP90和HSP70可能在熱脅迫中起著更重要的作用。

熱激轉(zhuǎn)錄因子（HSFs）具有調(diào)控?zé)峒さ鞍椎谋磉_(dá)作用，在植物熱激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。圖5、6、7、8所示，HSF5、HSF6、HSF10在8個小麥品種受熱脅迫后表達(dá)水平都增高，也基本表現(xiàn)出先升后降的趨勢。其中煙農(nóng)19，良星99，濟(jì)麥22和新麥26的表達(dá)水平相對比其他四個品種高，三個基因在中優(yōu)206中的表達(dá)水平都比較低。說明HSF5、HSF6、HSF10均受到熱脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)，尤其以HSF5的表達(dá)最為明顯。

4 實(shí)驗結(jié)論

隨著全球氣候變暖的日益加劇和人口的增長，糧食安全始終是一個值得人們關(guān)注的重要問題，科研工作者和育種家們一直致力于提高農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)以滿足人們?nèi)找嬖鲩L的需要。小麥的耐熱性機(jī)理研究和耐熱品種選育就是近年來的一個熱點(diǎn)。不同小麥品種因遺傳背景不同，其耐熱機(jī)理也具有明顯差異。

本研究選用了8個在黃淮麥區(qū)大面積推廣的小麥品種作為研究對象，分析了它們苗期的耐熱機(jī)理，從熱脅迫后的質(zhì)膜透性、存活率，以及熱激相關(guān)基因的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，中麥175、煙農(nóng)19、良星99和石優(yōu)17的質(zhì)膜的熱穩(wěn)定性比較好，熱脅迫后存活率比較高，熱激相關(guān)基因的表達(dá)水平也比較高，表現(xiàn)相對耐熱。但苗期耐熱性較差的濟(jì)麥22和新麥26的熱激相關(guān)基因如HSP90，HSP70等的表達(dá)水平比較高，可能其遺傳背景的差異導(dǎo)致的，其機(jī)理需要進(jìn)一步的深入研究。

參考文獻(xiàn)

[1] 董建力，李樹華，王敬東，等.熱脅迫下春小麥品種產(chǎn)量性狀耐熱性差異及相關(guān)分析[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2008，17（2）：70-73.

[2] 耿曉麗，張月伶，臧新山，等.北方冬麥區(qū)與黃淮北片優(yōu)良小麥品種（系）耐熱性評價[J].麥類作物學(xué)報，2016，36（2）：172-181.

[3] 郭秀林，李慧聰，劉子會，等.不同基因型小麥對熱處理的響應(yīng)[J].麥類作物學(xué)報，2013，33（3）：514-519.