楊杰　李蘭　戴莉　張江國　莫善明　徐新龍

摘要? [目的]分析不同標準方法中CaMV 35S啟動子基因篩查方法中引物探針位置關系，討論以引物探針序列重組為陽性對照樣品的可行性。[方法]收集國內標準方法中CaMV 35S啟動子基因檢測引物探針序列與CaMV參考序列比較，確定其引物探針位置特點。設計不同長度間隔序列的串聯(lián)引物探針重組序列，檢測其結果差別。[結果]CaMV 35S啟動子基因實時熒光PCR檢測方法中引物與探針區(qū)間隔序列對擴增結果影響甚微。[結論]通過將引物探針序列順序串聯(lián)合成重組序列可以作為特定實時熒光PCR檢測方法的陽性對照。

關鍵詞? 轉基因;CaMV 35S啟動子;實時熒光PCR;陽性樣品

中圖分類號? Q785??? 文獻標識碼? A

文章編號? 0517-6611（2019）24-0192-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.24.058

Characteristics and Effects of Primer Probe Sequences in Real-time Fluorescent PCR Detection Method for GMO Products CaMV 35S Promoter Gene

YANG Jie，LI Lan，DAI Li et al? （Technical Center of Alashankou Customs，Alashankou，Xinjiang 833418）

Abstract? [Objective]The research aimed to analyze the position relationship of primer probe in different standard methods for CaMV 35S promoter gene screening detection method，and discuss the feasibility of using primer probe sequence recombination as positive control sample.[Method]The primer and probe sequence of CaMV 35S promoter gene detection in domestic standard methods was compared with the CaMV genome reference sequence，to determine the position characteristics of the primer and probe.[Result]The interval sequence between primers and probes in real-time PCR detection of CaMV 35S promoter gene had little effect on amplification results.[Conclusion]By combining primer probe sequences into recombinant sequences，it can be used as a positive control for specific real-time PCR detection methods.

Key words? GMO;CaMV 35s promoter;Real-time fluorescent PCR;Positive control sample

基金項目? 新疆維吾爾自治區(qū)國際合作項目（20166012）。

作者簡介?? 楊杰（1986—），男，新疆烏魯木齊人，助理工程師，從事轉基因及微生物檢測工作。*通信作者，高級農藝師，從事實驗室管理及出入境植物檢疫工作。

收稿日期? 2019-06-04

隨著基因工程技術在遺傳育種方面相關的研究中不斷加深，轉基因作物開發(fā)日漸成熟，其在世界范圍內的應用和種植越來越廣泛，在國際農業(yè)發(fā)展和經濟貿易過程中都起到了舉足輕重的作用。根據國際農業(yè)生物技術應用服務組織（internarional service for the acquisition of afri-bio-tech applications，ISAAA）官方數(shù)據統(tǒng)計，截至2019年4月，全球各國總計批準了31個物種共計517個商業(yè)化轉基因事件的加工或種植，并且這個數(shù)量每年仍有數(shù)以十計的數(shù)量在不斷增長[1]。

在一個轉化事件的開發(fā)過程中，插入基因片段的構建是工作的核心，插入片段大都是以一個或多個由啟動子-目的基因-終止子構成的轉錄單元串聯(lián)而成。目前在世界各國已經通過審批允許貿易、加工和種植的商業(yè)化轉基因作物中，花椰菜花病毒（簡稱CaMV）35S啟動子是使用最為成熟的外源啟動子序列之一。完整的CaMV 35S啟動子具有在多數(shù)植物及部分真菌中均能高效轉錄的特點，這使其能夠被廣泛應用于玉米、大豆、土豆等各種主要糧食及經濟作物的基因工程改造工作中[2]，目前根據國際生物安全信息交換所（biosafety clearing-house，BCH）中的信息記錄，插入基因片段的結構中涉及CaMV 35S啟動子的轉化事件已經多達368個[3]。

轉基因技術不斷發(fā)展的過程中，轉基因作物及其加工產品的安全性一直是世界范圍內關注的焦點。為了保障各個國家生態(tài)環(huán)保及社會政治經濟等方面的需求，各國對轉基因作物的種植貿易加工都有著不同程度的管理規(guī)定，而是否具備成熟的轉基因成分檢測標準方法體系就成為這些監(jiān)管政策是否可以順利實施的先決條件。由于CaMV 35S啟動子基因在轉基因技術中應用廣泛的特點，通過對食品農產品中CaMV 35S啟動子基因的篩查成為轉基因產品檢驗方法中應用最為常用的手段，不同國家和地區(qū)對于轉基因成分中CaMV 35S啟動子基因篩查大多建立了國家、地區(qū)及行業(yè)標準[4]。

然而不同產品不同范圍的檢測標準方法中，CaMV 35S啟動子的檢測所采用的引物探針序列不盡相同。對于Taqman探針實時熒光PCR檢測而言，其檢測的特異性取決于引物探針序列，與引物探針結合區(qū)域之間的序列無關。該研究旨在通過對目前國內現(xiàn)行有效的13個不同對象轉基因成分檢測標準方法[5-17]中CaMV 35S啟動子基因檢測片段的序列特點進行分析，建立在人工合成引物及探針序列中插入不同長度間隔序列作為比較對象的模型，通過將這些不同長度的重組序列與陽性物質進行實時熒光PCR檢測，比較引物與探針序列之間不同長度插入片段對實時熒光PCR檢測結果是否產生明確影響，從而確定僅用引物及探針序列信息進行重組構建的序列作為特定轉基因成分檢測方法陽性對照模板的可行性。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 陽性物質。試驗采用 2016年由中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心組織的糧食轉基因檢測能力驗證計劃（計劃編號：ACAS-PT215）中檢出的陽性轉基因玉米粉作為陽性物質。

1.1.2? 重組序列及引物、探針。試驗所用重組序列片段、引物序列及水解探針均由北京鼎國生物技術有限公司合成。

1.1.3? 主要試劑。植物基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司;FastStart Essential DNA Probes Master預混液購自羅氏診斷產品（上海）有限公司;瓊脂糖凝膠及DNA Marker購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.4? 主要儀器。Roche LightCycler 96型實時熒光定量PCR儀，ABI 9700 型PCR儀。

1.2? 方法

1.2.1? CaMV 35S啟動子基因不同檢測片段特征分析。

通過NCBI檢索獲得花椰菜花葉病毒全基因組參考序列（編號：NC_001497），使用DNAMAN軟件分析對SN/T 1198—2013 《轉基因成分檢測 馬鈴薯檢測方法》、 GB/T 19495.4—2018 《轉基因產品檢測 實時熒光定性聚合酶鏈式反應（PCR）檢測方法》、農業(yè)部1782號公告-3-2012 《轉基因植物及其產品成分檢測調控元件CaMV 35S啟動子、FMV 35S啟動子、NOS啟動子、NOS終止子和CaMV 35S終止子定性PCR方法》等13個轉基因檢測標準中CaMV 35S啟動子基因檢測引物及探針序列與參考序列進行比對，確定每個檢測片段在基因中的位置，從而分析不同標準檢測方法中實時熒光PCR的上下游引物及探針之間的間隔序列的長度特征。

1.2.2? 不同長度插入片段的CaMV 35S檢測陽性重組序列設計與合成。根據比對結果，分別設計5條插入片段長度不同的陽性重組序列，序列信息詳見表1。

1.2.3? 陽性重組序列的熒光定量PCR檢測。

陽性物質基因組的提取按照植物基因組DNA提取試劑盒DP305說明進行操作，將合成好的陽性重組序列梯度稀釋，選擇濃度為10-9μmol/L作為模板與陽性物質基因組一同檢測。PCR反應體系及程序按照SN/T 1198—2013 《轉基因成分檢測 馬鈴薯檢測方法》中要求進行配置。

2? 結果與分析

2.1? CaMV 35S啟動子基因檢測引物探針結合序列的特點

13個檢測標準中CaMV35S 啟動子基因檢測的上下游引物及探針序列信息如表2，由表2可見13個檢測標準中共有3個檢測片段的選擇，分別將農業(yè)部1782號公告-3-2012等9個檢測標準中位于參考序列7 249～7 322 bp的檢測片段記為CaMV1，SN/T 1198—2013中位于參考序列7 191～7 385 bp 的檢測片段為CaMV2，GB/T 19495.4—2018等3個標準中位于參考序列7 241～7 322 bp的檢測片段標記為CaMV3。

經比對發(fā)現(xiàn)3條檢測片段有如下特征：①3條檢測片段上游引物與探針序列均在同鏈，下游引物在互補鏈;②3個檢測片段區(qū)域范圍有重合，CaMV1、CaMV3全長位于CaMV2上游引物與探針序列之間;③CaMV1上游較CaMV3短8 bp，且兩者下游引物區(qū)相同;④CaMV1上游引物與探針序列間直接相連，無間隔序列;⑤CaMV2上游引物與探針序列間插入片段較長，達到138 bp;⑥CaMV2 探針序列3端與其下游引物3端有7個bp的堿基互補狀況，即探針結合區(qū)與下游引物結合區(qū)的互補鏈有部分重合。序列特征情況參見圖1。

由以上特征可以發(fā)現(xiàn)在擴增片段中熒光探針的位置選擇條件較為寬泛，與同側引物間最近可直接相連不插入間隔序列，與異側引物影響更小甚至可以有部分重疊而不影響擴增結果。檢測片段上引物與探針序列間隔序列對檢測結果影響較小。因此在設計陽性重組序列時，設立了將SN/T 1198—2013 《轉基因成分檢測 馬鈴薯檢測方法》上游拼接下游重疊序列的重組片段和上下游引物與探針序列間分別間隔0、1、3、5 bp的共5組陽性重組序列，與陽性物質進行比較插入堿基對檢測結果的影響。

2.2? 重組序列CaMV 35S啟動子實時熒光PCR檢測結果

經檢測，C、C0、C1、C3、C5不同插入片段的5條重組陽性與陽性物質中CaMV 35S啟動子基因均能有效地擴增，無明顯差異，擴增曲線見圖2。

3? 討論

3.1? 現(xiàn)行標準中CaMV 35S啟動子基因檢測方法可能存在的問題

比對過程中發(fā)現(xiàn)SN/T 2135—2008《蜂蜜中轉基因成分檢測方法 普通PCR方法和實時熒光PCR方法》CaMV 35S啟動子基因實時熒光檢測方法上游引物3端與熒光探針5端有一個重疊的堿基T，由于上游引物與探針均結合同側鏈，重疊堿基兩者結合時會發(fā)生競爭，降低擴增效率，但推測由于僅重疊一個堿基，對結果影響尚小。

[9]中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局.甜菜中轉基因成分檢測 普通PCR方法和實時熒光PCR方法：SN/T 3959—2014[S].北京：中國標準出版社，2014.

[10]中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局.飼料中轉基因植物成分PCR檢測方法：SN/T 1201—2014[S].北京：中國標準出版社，2016.

[11]中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局.轉基因成分檢測 玉米檢測方法：SN/T 1196—2018[S].北京：中國標準出版社，2018.

[12]中華人民共和國農業(yè)部.轉基因植物及其產品成分檢測調控元件CaMV35S啟動子、FMV 35S啟動子、NOS啟動子、NOS終止子和CaMV35S終止子定性PCR方法：農業(yè)部1782號公告-3—2012[S].北京：中國農業(yè)出版社，2012.

[13]中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局.蜂蜜中轉基因成分檢測方法 普通PCR方法和實時熒光PCR方法：SN/T 2135—2008[S].北京：中國標準出版社，2008.

[14]國家市場監(jiān)督管理總局，中國國家標準化管理委員會.轉基因產品檢測 實時熒光定性聚合酶鏈式反應（PCR）檢測方法：GB/T 19495.4—2018[S].北京：中國標準出版社，2018.

[15]中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局.植物及其加工產品中轉基因成分實時熒光PCR定性檢驗方法：SN/T 1204—2016[S].北京：中國標準出版社，2017.

[16]中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局.轉基因成分檢測 馬鈴薯檢測方法：SN/T 1198—2013[S].北京：中國標準出版社，2013.

[17]中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局.油菜中轉基因成分檢測 普通PCR和實時熒光PCR方法：SN/T 1197—2016[S].北京：中國標準出版社，2018.

[18]GIULIETTI A，OVERBERGH L，VALCKX D，et al.An Overview of real-time quantitative PCR： Applications to quantify cytokine gene expression[J].Methods，2001，25（4）：386-401.