馬仁勝　高常年　鮑俊杰　王永杰

摘要? [目的]優(yōu)化植物源蛋白發(fā)酵飼料的生產(chǎn)工藝，探討發(fā)酵飼料替代傳統(tǒng)膨化飼料飼養(yǎng)克氏原螯蝦的可能性。[方法]以小肽含量為指標(biāo)，對枯草芽孢桿菌、乳酸菌和酵母菌3個(gè)菌種的混合發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，并用該工藝條件生產(chǎn)的發(fā)酵飼料來飼養(yǎng)克氏原螯蝦。[結(jié)果]枯草芽孢桿菌、乳酸菌和酵母菌3個(gè)菌種混菌發(fā)酵最佳工藝條件為接種量15%、固液比2∶1（g∶mL）、發(fā)酵時(shí)間96 h、溫度32 ℃，且接種枯草芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌的比例為 12∶3∶2;原料經(jīng)過混合菌發(fā)酵后，小肽含量提高了約10倍，粗纖維含量有所降低，粗蛋白、灰分和粗脂肪含量變化不明顯。采用發(fā)酵飼料喂養(yǎng)的克氏原螯蝦，在生長初期增重速率明顯高于投喂膨化飼料的，發(fā)酵飼料組蝦田水體pH和溶氧都略低于膨化飼料組，氨氮對比差異不明顯。[結(jié)論]發(fā)酵飼料更易于克氏原螯蝦生長初期消化吸收，可部分代替膨化飼料使用，且對水質(zhì)影響較小。

關(guān)鍵詞? 克氏原螯蝦;混菌發(fā)酵;發(fā)酵飼料;水質(zhì)

中圖分類號? S966.12??? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼? A

文章編號? 0517-6611（2019）24-0122-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.24.037

Study on the Application of Fermented Feed in the Feeding of Crayfish

MA Ren-sheng1，GAO Chang-nian2，BAO Jun-jie3 et al

（1.Feixi Animal Disease Prevention and Control Center，Hefei， Anhui 231200;2.Feixi Jiayu Ecological Agriculture Technology Co.， Ltd.，Hefei， Anhui 231200;3.Fisheries Research Institute， Anhui Academy of Agricultural Sciences，Hefei， Anhui 230031）

Abstract? [Objective]To optimize the production process of plant-derived protein fermented feed and explore the possibility of fermented feed replacing traditional extruded feed for crayfish.[Method]The mixed fermentation conditions of Bacillus subtilis， lactic acid bacteria and yeast were optimized by using small peptide content as indicators. The fermented feed produced by the process conditions was used to raise crayfish. [Result]The optimal fermentation conditions for the mixed fermentation of Bacillus subtilis， lactic acid bacteria and yeast were as follows： inoculum 15%， solid-liquid ratio 2∶1（g∶mL）， fermentation time 96 h， temperature 32 ℃， and that inoculation proportion with Bacillus subtilis， lactic acid bacteria and yeast was 12∶3∶2. After fermentation of the mixed bacteria， the content of small peptides increased about 10 times， slight decreased in the content of crude fiber and no significant change in the contents of crude protein， crude ash and crude fat. The growth rate of crayfish fed with fermented feed was significantly higher than that fed with extruded feed in the early stage of growth. The pH and dissolved oxygen of the shrimp field in the fermented groups were slightly lower than those in the extruded groups. No significant differences were found in ammonia and nitrogen. [Conclusion]Fermented feed is easier to be digested and absorbed in the early growth stage of crayfish， which can partially replace extruded feed， and it has little effect on water quality.

Key words? Crayfish;Mixed fermentation;Fermented feed;Water quality

基金項(xiàng)目? 肥西縣科技特派員專項(xiàng)。

作者簡介? 馬仁勝（1965—），男，安徽合肥人，副研究員，碩士，從事水產(chǎn)養(yǎng)殖研究。

收稿日期? 2019-11-07

大豆、花生等植物提取油類后的副產(chǎn)物蛋白質(zhì)含量較高，氨基酸組成合理，價(jià)格便宜且資源豐富[1-2]。但由于其含有多種抗?fàn)I養(yǎng)因子、氨基酸不平衡、功能性營養(yǎng)物質(zhì)缺乏且適口性較差，不適合直接用于飼喂動(dòng)物[3-6]。如何提高豆粕和花生粕等植物蛋白源的飼用價(jià)值，受到越來越多學(xué)者的關(guān)注。

常見的發(fā)酵飼料是由玉米、大豆和花生等通過微生物發(fā)酵后干燥壓制而成。其蛋白含量與傳統(tǒng)飼料相近，有利于降低水產(chǎn)動(dòng)物飼喂的成本，提高養(yǎng)殖收益。筆者擬優(yōu)化枯草芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌協(xié)同發(fā)酵雜粕的生產(chǎn)工藝，并初步探究飼喂發(fā)酵飼料對克氏原螯蝦生長以及水質(zhì)情況的影響，旨在為生物發(fā)酵飼料在克氏原螯蝦養(yǎng)殖中的實(shí)際應(yīng)用提供參考[7-9]。

1? 材料與方法

1.1? 材料與菌種

豆粕和玉米粕：由安徽萬士生物制藥有限公司提供，粉碎過40目篩;

無菌水：蒸餾水分裝，121 ℃ 滅菌 20 min;

枯草芽孢桿菌：由實(shí)驗(yàn)室分離所得;

植物乳酸菌：購自安徽萬士生物制藥有限公司;

釀酒酵母菌：購自安徽萬士生物制藥有限公司。

1.2? 培養(yǎng)基配制

1.2.1? 液體種子培養(yǎng)基配制。

LB培養(yǎng)基：酵母提取物5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，蒸餾水定容至1 000 mL，調(diào)pH至7.0，121 ℃高壓滅菌20 min。

MRS培養(yǎng)基：酵母膏5 g、牛肉膏10 g、蛋白胨10 g、檸檬酸氫二胺2 g、葡萄糖20 g、吐溫-80 1 g、乙酸鈉5 g、磷酸氫二鉀2 g、硫酸鎂0.6 g、硫酸錳0.2 g、瓊脂15 g，蒸餾水定容至1 000 mL，調(diào)pH至6.6，121 ℃高壓滅菌20 min。

YPD培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、葡萄糖20 g、酵母粉5 g，蒸餾水定容至1 000 mL，121 ℃高壓滅菌20 min。

1.2.2? 發(fā)酵種子液的制備。

首先將枯草芽孢桿菌、乳酸菌和酵母菌接于各菌種的液體種子培養(yǎng)基中，分別為LB培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基和YPD培養(yǎng)基。將枯草芽孢桿菌置于35 ℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，釀酒酵母菌置于30 ℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，乳酸30 ℃靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后，將上述菌液按1%的接種量分別接種到各菌種的液體種子培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.3? 混菌發(fā)酵雜粕試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1? 混菌發(fā)酵雜粕菌種比例優(yōu)化。

采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將3個(gè)菌種分別以不同接種量進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)，每組設(shè)定重復(fù)。

發(fā)酵條件為溫度32 ℃、固液比2∶1（g∶mL）、發(fā)酵時(shí)間48 h、pH 70。以發(fā)酵結(jié)束產(chǎn)的小肽含量為考察指標(biāo)，確定3菌種混合發(fā)酵時(shí)的最佳比例?；炀l(fā)酵雜粕的菌種接種比例的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

1.3.2? 混菌發(fā)酵雜粕條件的優(yōu)化。

在確定3個(gè)菌種的最佳接種比例的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對混菌發(fā)酵雜粕的接種量（A）、固液比（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）、發(fā)酵溫度（D）4個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)。優(yōu)化混菌發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表2所示。

1.4? 測定方法

發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵產(chǎn)物于烘箱中45 ℃烘至恒重，靜置24 h，然后粉粹過60目篩，進(jìn)行指標(biāo)測定。小肽含量測定參照輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《大豆肽粉》（QB/T2653—2004）中方法;粗蛋白質(zhì)含量測定采用凱氏定氮法;粗脂肪含量測定采用索氏抽提法;水質(zhì)測定采用YSI多參數(shù)水質(zhì)測定儀。

1.5? 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)用Excel進(jìn)行初步處理后，做統(tǒng)計(jì)分析，其中正交數(shù)據(jù)采用一般線性模型單變量進(jìn)行極差與方差分析，其他采用單因素方差分析。

1.6? 田間飼喂管理

7—9月，在肥西縣稼漁水產(chǎn)有限公司基地的5#～8#稻蝦共生池塘比較不同飼料的功效。同樣水源情況下，池塘面積均為0.33～0.47 hm2，放養(yǎng)蝦苗體重為5～7 g，放養(yǎng)密度8尾/m2，養(yǎng)殖周期90 d。5#、6#僅投喂發(fā)酵飼料，7#、8#僅投喂傳統(tǒng)膨化飼料，日投喂量約為蝦體重4%。每10 d從試驗(yàn)的各個(gè)稻蝦塘隨機(jī)撈取20尾克氏原螯蝦樣本測量總體重，并測量水體溶解氧、pH、氨氮。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 混菌發(fā)酵菌種比例試驗(yàn)結(jié)果

由正交試驗(yàn)結(jié)果（表3）可知，3個(gè)菌種對發(fā)酵雜粕產(chǎn)小肽的影響程度為 A>B>C，即枯草芽孢桿菌對發(fā)酵產(chǎn)肽的貢獻(xiàn)最大，其次是乳酸菌，酵母菌對發(fā)酵效果的貢獻(xiàn)最小。方差分析結(jié)果顯示，3個(gè)菌種對發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量均沒有顯著影響（P>0.05）。此次試驗(yàn)中枯草芽孢桿菌、乳酸菌和酵母菌混合發(fā)酵雜粕的最佳接種比例為A3B3C2，即混菌發(fā)酵的菌種比例為枯草芽孢桿菌∶乳酸菌∶酵母菌=12∶3∶2。

2.2? 混菌發(fā)酵工藝條件優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

由正交試驗(yàn)結(jié)果（表4）可知，4種因素對發(fā)酵產(chǎn)肽的影響程度為 A>C>D>B，即接種量對發(fā)酵產(chǎn)肽的影響最大，其次是發(fā)酵時(shí)間，固液比和溫度對發(fā)酵效果的影響較小。方差分析結(jié)果顯示，接種量和發(fā)酵時(shí)間對發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量有顯著影響（P<0.05）。結(jié)合k值大小分析可得，3個(gè)菌種混合發(fā)酵豆粕工藝條件的最佳組合為A2B3C3D2，即在接種量為15%、固液比為2∶1、發(fā)酵時(shí)間為96 h、溫度為32 ℃的條件下，可以取得最優(yōu)發(fā)酵效果。

2.3? 雜粕發(fā)酵前后理化性質(zhì)變化

雜粕發(fā)酵前后主要營養(yǎng)物質(zhì)含量發(fā)生變化，小肽、粗蛋白、粗纖維、灰分和粗脂肪的含量（相對干物質(zhì)）變化如表5所示。雜粕經(jīng)混菌發(fā)酵后，小肽含量變?yōu)?7.92%，顯著高于未發(fā)酵組;粗纖維含量有所降低;粗蛋白、灰分和粗脂肪含量變化不明顯。

2.4? 不同飼料飼喂克氏原螯蝦生長的結(jié)果

從蝦苗投放開始計(jì)，每10 d從試驗(yàn)的各個(gè)稻蝦塘隨機(jī)撈取20尾樣本測量總體重。由表6可以看出，投喂發(fā)酵飼料一組的蝦在生長初期體重增長速率明顯高于投喂膨化飼料一組的蝦。但從蝦的生長中期開始，膨化飼料組蝦的增重速率就開始超過發(fā)酵飼料組。

2.5? 水質(zhì)監(jiān)測結(jié)果

從蝦苗投放開始，每10 d對水體的溶解氧、pH、氨氮進(jìn)行測量，試驗(yàn)結(jié)果如表7所示。由表7可以得到，發(fā)酵飼料組蝦田pH和溶解氧都低于膨化飼料組，2組試驗(yàn)蝦田的氨氮對比差異不明顯。

3? 討論

混菌發(fā)酵雜粕試驗(yàn)表明，發(fā)酵前后營養(yǎng)物質(zhì)含量存在較明顯變化。該試驗(yàn)中原料經(jīng)3種微生物混合發(fā)酵處理后，小肽含量較未發(fā)酵前提高了約10倍，但前后的粗蛋白質(zhì)含量變化不顯著。小肽含量的升高是因?yàn)槲⑸锇l(fā)酵可以把豆粕中的蛋白質(zhì)水解為氨基酸、多肽等小分子物質(zhì)[10-12]。同時(shí)蛋白質(zhì)含量變化不大，說明發(fā)酵過程中微生物雖然消解了部分植物蛋白，但同時(shí)有新的蛋白質(zhì)產(chǎn)出，可能是菌體發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)化而成的?？梢娫诎l(fā)酵過程中，微生物繁殖時(shí)能將豆粕中不易消化的植物蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為菌體蛋白，改良了豆粕中蛋白質(zhì)的品質(zhì)[13-15]。

飼喂試驗(yàn)中，發(fā)酵飼料組的克氏原螯蝦在生長初期重量增長速率較快，可能是因?yàn)轱暳现泻械陌l(fā)酵菌進(jìn)入幼蝦的消化道輔助消化，進(jìn)而促進(jìn)蝦的生長。豆粕經(jīng)發(fā)酵水解后產(chǎn)生的小分子蛋白、小肽也便于蝦的消化利用[16-17]。并且發(fā)酵飼料所用的菌體在貯存期仍然繼續(xù)繁殖發(fā)酵，使飼料產(chǎn)品具有香味進(jìn)而有較好的誘食性。但當(dāng)克氏原螯蝦達(dá)到生長中期，膨化飼料組蝦的增重速率就開始超過發(fā)酵飼料組，可能是因?yàn)榘l(fā)酵飼料質(zhì)地松散，投入水中容易消散，大體格蝦覓食時(shí)難以發(fā)現(xiàn)成塊飼料，影響攝食，導(dǎo)致增重緩慢。

飼喂2種飼料對水質(zhì)的影響差異不明顯。發(fā)酵飼料組含氧量略低，可能因?yàn)轱暳现泻休^多微生物，增加了額外的氧氣消耗。氨氮及pH都較為穩(wěn)定，沒有出現(xiàn)壞水情況。

4? 結(jié)論

（1）通過研究表明，枯草芽孢桿菌、乳酸菌和酵母菌3個(gè)菌種的混合菌固態(tài)發(fā)酵豆粕最佳工藝條件為接種量15%、固液比2∶1、發(fā)酵時(shí)間96 h、溫度32 ℃，且混合菌中枯草芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌的比例為 12∶3∶2。

（2）豆粕經(jīng)過混合菌發(fā)酵后，大分子蛋白質(zhì)被降解，小肽含量提高了約10倍，粗纖維含量有所降低，粗蛋白、灰分和粗脂肪含量變化不明顯。

（3）用混合菌發(fā)酵飼料飼喂克氏原螯蝦，蝦在生長初期重量增長速率明顯高于投喂膨化飼料一組的蝦，可以考慮在克氏原螯蝦養(yǎng)殖前期替代發(fā)酵飼料使用，使用發(fā)酵飼料對水質(zhì)的影響與膨化飼料相比，差異不大。

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