郗有麗，周 杰，聶 超，葛衛(wèi)紅

(1.南京鼓樓醫(yī)院 藥學(xué)部，江蘇 南京 210008； 2.江蘇衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院 藥學(xué)院，江蘇 南京 211800)

由于不健康的生活方式，導(dǎo)致全球20～79歲成人糖尿病的患病率已達(dá)7.3%，估計(jì)到2045年將達(dá)到8.3%，其中2型糖尿病患者占90%以上，已成為全球十大死亡原因之一[1]。胰島素抵抗(Insulin resistance,IR)又稱胰島素耐受，是指機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性降低，導(dǎo)致葡萄糖的攝取及利用減少，血糖升高，常伴有脂質(zhì)代謝紊亂，是引發(fā)2型糖尿病的主要原因及病理基礎(chǔ)[2]。

黃芩苷(結(jié)構(gòu)式見圖1)是黃芩的主要活性成分，作為一種黃酮類化學(xué)物，臨床常用來治療炎癥、高血壓、心血管疾病以及細(xì)菌和病毒感染等[3-4]。Xi等[5]研究發(fā)現(xiàn)在前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中黃芩苷能夠改善胰島素抵抗小鼠的血脂紊亂，降低高血糖和空腹血清胰島素水平，從而改善糖耐量和胰島素耐量異常，但是其具體作用機(jī)制尚不明。

自噬(autophagy)是指在真核細(xì)胞中由雙層膜包裹部分胞質(zhì)或者細(xì)胞器等形成自噬體，隨即與內(nèi)涵體融合成自噬內(nèi)涵體，再與溶酶體形成自噬性溶酶體，最終降解所包裹內(nèi)容物的過程[6]。自噬在糖尿病中也起著重要的作用，作為細(xì)胞的一種防御機(jī)制，自噬能清除胞質(zhì)內(nèi)受損的細(xì)胞器、有害的蛋白質(zhì)等，從而保護(hù)細(xì)胞免受損害[7]。Yan等[8]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)胰島素抵抗時(shí)，細(xì)胞自噬被抑制，而升高肥胖小鼠肝臟自噬水平后，胰島素抵抗能得到明顯改善[9]。

圖1 黃芩苷的結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structure of baicalin

因此，本研究以BRL-3A 細(xì)胞(大鼠肝臟間質(zhì)細(xì)胞)復(fù)制胰島素抵抗細(xì)胞模型，給予黃芩苷進(jìn)行干預(yù)，觀察黃芩苷對(duì)胰島素抵抗的作用，探究其作用機(jī)制。由于目前國(guó)內(nèi)外未見有關(guān)黃芩苷通過增強(qiáng)自噬從而改善胰島素抵抗的報(bào)道，故本研究以期為治療胰島素抵抗和開發(fā)理想的治療藥物提供新的靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

BRL-3A 細(xì)胞，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞中心。

1.2 藥物與試劑

黃芩苷(純度98%)，四川廣漢市草本植化有限公司；棕櫚酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基，美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清(FBS)，美國(guó)Gibco公司；葡萄糖和甘油三酯試劑盒，南京建成生物工程研究所；LC3-I、LC3-II和GAPDH抗體，美國(guó)Cell Signaling Technology公司；PVDF膜，美國(guó)Millipore公司；Trizol，美國(guó)Invitrogen公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒，美國(guó) Thermo Fisher公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

XD-101型CO2培養(yǎng)箱，日本 SANYO公司；H1650R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；CX31型生物正置顯微鏡，日本OLYMPUS公司；Western SDS-Page型電泳儀，美國(guó)BIO RAD公司；MICROCHEMI化學(xué)發(fā)光成像儀，以色列DNR公司；普通梯度PCR儀，美國(guó)ABIVeriti 96 well Thermal cycler；熒光定量PCR儀，美國(guó)ABI stepone plus；UV-2450型紫外光度儀，日本SHIMADZU公司。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)方法

將BRL-3A 細(xì)胞用含胎牛血清FBS(10%，體積分?jǐn)?shù)，下同)的DMEM 高糖培養(yǎng)液，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2(體積分?jǐn)?shù)，下同)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔24 h更換含F(xiàn)BS的DMEM 高糖培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)傳代。

1.5 葡萄糖消耗量的測(cè)定

按文獻(xiàn)[10]的方法，將100 μL BRL-3A細(xì)胞懸浮液(1×105個(gè)/mL)接種于96 孔板，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，除空白組外，其余BRL-3A細(xì)胞均采用0.2 mmol/L棕櫚酸(PA)處理24 h 后，給予黃芩苷進(jìn)行干預(yù)。將所有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分成4組：1)空白組：BRL-3A細(xì)胞+含10%FBS的DMEM 高糖培養(yǎng)液；2)模型組：經(jīng)PA處理的BRL-3A細(xì)胞+含10%FBS的DMEM 高糖培養(yǎng)液；3)黃芩苷高劑量組：經(jīng)PA處理的BRL-3A細(xì)胞+0.1 mmol/L黃芩苷+含10%FBS的DMEM 高糖培養(yǎng)液；4)黃芩苷低劑量組：經(jīng)PA處理的BRL-3A細(xì)胞+0.05 mmol/L黃芩苷+含10%FBS的DMEM 高糖培養(yǎng)液。將細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后，收集上清液，采用葡萄糖試劑盒檢測(cè)上清液中葡萄糖含量，并計(jì)算葡萄糖的消耗量。

1.6 甘油三酯含量的測(cè)定

將2 mL BRL-3A細(xì)胞懸浮液(1×105/mL)接種于6 孔板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞處理與分組方法同1.5節(jié)。細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，進(jìn)行超聲破碎，采用甘油三酯試劑盒檢測(cè)甘油三酯的含量。

1.7 Western blotting法檢測(cè)自噬蛋白LC3-I、LC3-II和Beclin1的表達(dá)

將2 mL BRL-3A細(xì)胞懸浮液(1×105/mL)接種于6 孔板培養(yǎng)，細(xì)胞處理與分組方法同1.5節(jié)。細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后棄上清，加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，4 ℃ 12 000 r/min，離心20 min，收集上清液，用BCA法測(cè)定總蛋白濃度，采用SDS-PAGE凝膠電泳，每孔加入30 μg 蛋白，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)脫脂奶粉室溫封閉1 h，置于LC3-I、LC3-II和Beclin1多克隆抗體(體積比為1∶ 1 000)，4 ℃孵育過夜。用TBST洗滌5次，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔lgG二抗室溫下孵育1 h，用TBST洗滌5次，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)發(fā)光成像。

1.8 RT-qPCR法檢測(cè)自噬基因Beclin1的表達(dá)

將2 mL BRL-3A細(xì)胞懸浮液(1×105/mL)接種于6 孔板培養(yǎng)，細(xì)胞處理與分組方法同1.5節(jié)。Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，分光光度法測(cè)定RNA純度。用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用熒光染色法和熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。引物由南京金斯瑞科技有限公司合成，引物設(shè)計(jì)序列為GAPDH primer (101 bp)[5- A￣C￣A￣A￣C￣T￣T￣T￣G￣G￣T￣A￣T￣C￣G￣T￣G￣G￣A￣A￣G￣G-3(Sense)和5-G￣C￣C￣A￣T￣C￣A￣C￣G￣C￣C￣A￣C￣A￣G￣T￣T￣T￣C-3(Antisense)]；Beclin1 primer(140 bp)[5-A￣T￣G￣T￣C￣C￣A￣C￣A￣G￣A￣A￣A￣G￣T￣G￣C￣C￣A￣A-3(Sense)和5-G￣G￣G￣T￣G￣A￣T￣C￣C￣A￣C￣A￣T￣C￣T￣G￣T￣C￣T￣G-3(Antisense)]。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，隨后95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸20 s，72 ℃變性40 s，共40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物特異性用溶解曲線監(jiān)測(cè)，用軟件計(jì)算各組目的基因相對(duì)表達(dá)量，以GAPDH為內(nèi)參衡量靶細(xì)胞的目的基因表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果與討論

2.1 黃芩苷對(duì)BRL-3A細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響

黃芩苷對(duì)BRL-3A細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響見圖2。由圖2可知：經(jīng)PA處理之后，BRL-3A細(xì)胞對(duì)葡萄糖消耗量均明顯減少，表明發(fā)生了葡萄糖的攝取和利用障礙。其中，模型組細(xì)胞減少最為明顯，與空白組相比，具有顯著性差異(P<0.01)。而黃芩苷高劑量組(0.1 mmol/L)和黃芩苷低劑量組(0.05 mmol/L)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗量明顯增加，與模型組相比，具有顯著性差異(P<0.01)。提示黃芩苷(0.05 mmol/L和0.1 mmol/L)可以增加BRL-3A細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗量，改善細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和利用障礙。

與空白組相比，△△表示P<0.01；與模型組相比，**表示P<0.01圖2 黃芩苷對(duì)BRL-3A細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響Fig.2 Effects of baicalin on consumption of glucose in BRL-3A cells

2.2 黃芩苷對(duì)BRL-3A細(xì)胞甘油三酯含量的影響

黃芩苷對(duì)BRL-3A細(xì)胞甘油三酯含量的影響如圖3所示。由圖3可知：經(jīng)PA處理之后，BRL-3A細(xì)胞甘油三酯含量均明顯增多，引起細(xì)胞脂代謝紊亂。模型組細(xì)胞甘油三酯含量增加明顯，與空白組相比，具有顯著性差異(P<0.01)。黃芩苷能夠明顯減少BRL-3A細(xì)胞中甘油三酯的含量(P<0.05、P<0.01)，且高劑量(0.1 mmol/L)效果強(qiáng)于低劑量(0.05 mmol/L)。提示黃芩苷可以減少BRL-3A細(xì)胞中甘油三酯的含量，改善細(xì)胞脂代謝紊亂。

與空白組相比，△△表示P<0.01；與模型組相比，**表示P<0.01，*表示P<0.05圖3 黃芩苷對(duì)BRL-3A細(xì)胞甘油三酯含量的影響Fig.3 Effects of baicalin on triglyceridecontent in BRL-3A cells

2.3 黃芩苷對(duì)BRL-3A細(xì)胞自噬蛋白LC3-II/LC3-I和Beclin1的影響

微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)是自噬產(chǎn)生的標(biāo)志，有LC3-I型和LC3-II型。當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)缺氧、能量不足等應(yīng)激狀況時(shí)，細(xì)胞自噬被誘導(dǎo)，位于胞漿內(nèi)的LC3-I就會(huì)轉(zhuǎn)變成LC3-II，而LC3-II是位于自噬體膜上的，因此LC3-II的增多表明自噬體的生成增多，亦可用于衡量自噬的發(fā)生程度[11]。

Beclin1位于人類染色體17q21上，由BH3、中央螺旋區(qū)和進(jìn)化保守區(qū)組成，是細(xì)胞自噬體形成過程中非常重要的自噬基因。Beclin1通過調(diào)節(jié)III型磷脂酰肌醇3-激酶的活性，促進(jìn)自噬體膜的生成，與LC3-II的表達(dá)一致，是細(xì)胞自噬的正向調(diào)節(jié)因子，常常作為細(xì)胞自噬發(fā)生發(fā)展的評(píng)價(jià)指標(biāo)[12]

結(jié)果顯示：空白組BRL-3A細(xì)胞LC3-I多，LC3-II少，經(jīng)過PA處理之后，模型組LC3-II更少，LC3-II/LC3-I的比值明顯降低，Beclin1的表達(dá)也明顯減少，與空白組相比，具有顯著性差異(P<0.01)，表明自噬被抑制。經(jīng)黃芩苷干預(yù)之后，高劑量和低劑量組BRL-3A細(xì)胞LC3-I的表達(dá)減少，LC3-II的表達(dá)增多，LC3-II/LC3-I的比值明顯升高，Beclin1的表達(dá)也明顯增多(P<0.01)，表明自噬被誘導(dǎo)促進(jìn)(圖4)。

與空白組相比，△△表示P<0.01；與模型組相比，**表示P<0.01圖4 黃芩苷對(duì)BRL-3A細(xì)胞自噬蛋白 LC3-II/LC3-I的影響Fig.4 Effects of baicalin on LC3-II/LC3-I in BRL-3A cells

2.4 黃芩苷對(duì)BRL-3A細(xì)胞自噬基因Beclin1的影響

進(jìn)一步驗(yàn)證自噬基因Beclin1的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組BRL-3A細(xì)胞的Beclin1 mRNA的表達(dá)明顯降低，與空白組相比，具有顯著性差異(P<0.01)。黃芩苷高劑量和低劑量組BRL-3A細(xì)胞的Beclin1 mRNA的表達(dá)明顯升高，與模型組相比，具有顯著性差異(P<0.01)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與自噬蛋白Beclin1的表達(dá)一致。提示黃芩苷可以增加Beclin1的表達(dá)，誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。

與空白組相比，△△表示P<0.01；與模型組相比，**表示P<0.01圖5 黃芩苷對(duì)BRL-3A細(xì)胞自噬基因Beclin1的影響Fig.5 Effect of baicalin on Beclin1 in BRL-3A cells

3 結(jié)論

1)將BRL-3A細(xì)胞采用0.2 mmol/L棕櫚酸處理后，細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗量減少，細(xì)胞中甘油三酯含量增多，表明BRL-3A細(xì)胞發(fā)生了葡萄糖的攝取和利用障礙，并出現(xiàn)脂代謝紊亂，證明胰島素抵抗模型復(fù)制成功。同時(shí)發(fā)現(xiàn)經(jīng)棕櫚酸處理過的BRL-3A細(xì)胞LC3-II/LC3-I和Beclin1的表達(dá)降低，表明當(dāng)BRL-3A細(xì)胞出現(xiàn)胰島素抵抗時(shí)，自噬被抑制。

2)黃芩苷可以增加BRL-3A細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和利用，減少細(xì)胞中的甘油三酯含量，改善脂代謝紊亂狀態(tài)及改善胰島素抵抗，這可能與其促進(jìn)自噬的發(fā)生有關(guān)。