郗有麗，周 杰，聶 超，葛衛(wèi)紅

(1.南京鼓樓醫(yī)院 藥學部，江蘇 南京 210008； 2.江蘇衛(wèi)生健康職業(yè)學院 藥學院，江蘇 南京 211800)

由于不健康的生活方式，導致全球20～79歲成人糖尿病的患病率已達7.3%，估計到2045年將達到8.3%，其中2型糖尿病患者占90%以上，已成為全球十大死亡原因之一[1]。胰島素抵抗(Insulin resistance,IR)又稱胰島素耐受，是指機體對胰島素的敏感性降低，導致葡萄糖的攝取及利用減少，血糖升高，常伴有脂質代謝紊亂，是引發(fā)2型糖尿病的主要原因及病理基礎[2]。

黃芩苷(結構式見圖1)是黃芩的主要活性成分，作為一種黃酮類化學物，臨床常用來治療炎癥、高血壓、心血管疾病以及細菌和病毒感染等[3-4]。Xi等[5]研究發(fā)現(xiàn)在前期動物實驗中黃芩苷能夠改善胰島素抵抗小鼠的血脂紊亂，降低高血糖和空腹血清胰島素水平，從而改善糖耐量和胰島素耐量異常，但是其具體作用機制尚不明。

自噬(autophagy)是指在真核細胞中由雙層膜包裹部分胞質或者細胞器等形成自噬體，隨即與內涵體融合成自噬內涵體，再與溶酶體形成自噬性溶酶體，最終降解所包裹內容物的過程[6]。自噬在糖尿病中也起著重要的作用，作為細胞的一種防御機制，自噬能清除胞質內受損的細胞器、有害的蛋白質等，從而保護細胞免受損害[7]。Yan等[8]研究發(fā)現(xiàn)，當機體出現(xiàn)胰島素抵抗時，細胞自噬被抑制，而升高肥胖小鼠肝臟自噬水平后，胰島素抵抗能得到明顯改善[9]。

圖1 黃芩苷的結構式Fig.1 The structure of baicalin

因此，本研究以BRL-3A 細胞(大鼠肝臟間質細胞)復制胰島素抵抗細胞模型，給予黃芩苷進行干預，觀察黃芩苷對胰島素抵抗的作用，探究其作用機制。由于目前國內外未見有關黃芩苷通過增強自噬從而改善胰島素抵抗的報道，故本研究以期為治療胰島素抵抗和開發(fā)理想的治療藥物提供新的靶標。

1 材料與方法

1.1 細胞株

BRL-3A 細胞，購于中國科學院上海細胞中心。

1.2 藥物與試劑

黃芩苷(純度98%)，四川廣漢市草本植化有限公司；棕櫚酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基，美國Hyclone公司；胎牛血清(FBS)，美國Gibco公司；葡萄糖和甘油三酯試劑盒，南京建成生物工程研究所；LC3-I、LC3-II和GAPDH抗體，美國Cell Signaling Technology公司；PVDF膜，美國Millipore公司；Trizol，美國Invitrogen公司；cDNA反轉錄試劑盒和實時定量PCR試劑盒，美國 Thermo Fisher公司。

1.3 實驗儀器

XD-101型CO2培養(yǎng)箱，日本 SANYO公司；H1650R型臺式高速冷凍離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；CX31型生物正置顯微鏡，日本OLYMPUS公司；Western SDS-Page型電泳儀，美國BIO RAD公司；MICROCHEMI化學發(fā)光成像儀，以色列DNR公司；普通梯度PCR儀，美國ABIVeriti 96 well Thermal cycler；熒光定量PCR儀，美國ABI stepone plus；UV-2450型紫外光度儀，日本SHIMADZU公司。

1.4 細胞培養(yǎng)方法

將BRL-3A 細胞用含胎牛血清FBS(10%，體積分數(shù)，下同)的DMEM 高糖培養(yǎng)液，置于37 ℃、體積分數(shù)5%CO2(體積分數(shù)，下同)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔24 h更換含F(xiàn)BS的DMEM 高糖培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)傳代。

1.5 葡萄糖消耗量的測定

按文獻[10]的方法，將100 μL BRL-3A細胞懸浮液(1×105個/mL)接種于96 孔板，置于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，除空白組外，其余BRL-3A細胞均采用0.2 mmol/L棕櫚酸(PA)處理24 h 后，給予黃芩苷進行干預。將所有細胞實驗分成4組：1)空白組：BRL-3A細胞+含10%FBS的DMEM 高糖培養(yǎng)液；2)模型組：經PA處理的BRL-3A細胞+含10%FBS的DMEM 高糖培養(yǎng)液；3)黃芩苷高劑量組：經PA處理的BRL-3A細胞+0.1 mmol/L黃芩苷+含10%FBS的DMEM 高糖培養(yǎng)液；4)黃芩苷低劑量組：經PA處理的BRL-3A細胞+0.05 mmol/L黃芩苷+含10%FBS的DMEM 高糖培養(yǎng)液。將細胞共培養(yǎng)24 h后，收集上清液，采用葡萄糖試劑盒檢測上清液中葡萄糖含量，并計算葡萄糖的消耗量。

1.6 甘油三酯含量的測定

將2 mL BRL-3A細胞懸浮液(1×105/mL)接種于6 孔板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，細胞處理與分組方法同1.5節(jié)。細胞共培養(yǎng)24 h后收集細胞，進行超聲破碎，采用甘油三酯試劑盒檢測甘油三酯的含量。

1.7 Western blotting法檢測自噬蛋白LC3-I、LC3-II和Beclin1的表達

將2 mL BRL-3A細胞懸浮液(1×105/mL)接種于6 孔板培養(yǎng)，細胞處理與分組方法同1.5節(jié)。細胞共培養(yǎng)24 h后棄上清，加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，4 ℃ 12 000 r/min，離心20 min，收集上清液，用BCA法測定總蛋白濃度，采用SDS-PAGE凝膠電泳，每孔加入30 μg 蛋白，轉至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%質量分數(shù)脫脂奶粉室溫封閉1 h，置于LC3-I、LC3-II和Beclin1多克隆抗體(體積比為1∶ 1 000)，4 ℃孵育過夜。用TBST洗滌5次，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔lgG二抗室溫下孵育1 h，用TBST洗滌5次，化學發(fā)光成像系統(tǒng)發(fā)光成像。

1.8 RT-qPCR法檢測自噬基因Beclin1的表達

將2 mL BRL-3A細胞懸浮液(1×105/mL)接種于6 孔板培養(yǎng)，細胞處理與分組方法同1.5節(jié)。Trizol試劑盒提取細胞總RNA，分光光度法測定RNA純度。用cDNA反轉錄試劑盒將提取RNA進行反轉錄為cDNA。用熒光染色法和熒光定量PCR儀進行實時定量PCR。引物由南京金斯瑞科技有限公司合成，引物設計序列為GAPDH primer (101 bp)[5- A￣C￣A￣A￣C￣T￣T￣T￣G￣G￣T￣A￣T￣C￣G￣T￣G￣G￣A￣A￣G￣G-3(Sense)和5-G￣C￣C￣A￣T￣C￣A￣C￣G￣C￣C￣A￣C￣A￣G￣T￣T￣T￣C-3(Antisense)]；Beclin1 primer(140 bp)[5-A￣T￣G￣T￣C￣C￣A￣C￣A￣G￣A￣A￣A￣G￣T￣G￣C￣C￣A￣A-3(Sense)和5-G￣G￣G￣T￣G￣A￣T￣C￣C￣A￣C￣A￣T￣C￣T￣G￣T￣C￣T￣G-3(Antisense)]。擴增條件：95 ℃預變性5 min，隨后95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸20 s，72 ℃變性40 s，共40個循環(huán)。擴增產物特異性用溶解曲線監(jiān)測，用軟件計算各組目的基因相對表達量，以GAPDH為內參衡量靶細胞的目的基因表達量。

1.9 統(tǒng)計學方法

2 結果與討論

2.1 黃芩苷對BRL-3A細胞葡萄糖消耗量的影響

黃芩苷對BRL-3A細胞葡萄糖消耗量的影響見圖2。由圖2可知：經PA處理之后，BRL-3A細胞對葡萄糖消耗量均明顯減少，表明發(fā)生了葡萄糖的攝取和利用障礙。其中，模型組細胞減少最為明顯，與空白組相比，具有顯著性差異(P<0.01)。而黃芩苷高劑量組(0.1 mmol/L)和黃芩苷低劑量組(0.05 mmol/L)細胞對葡萄糖的消耗量明顯增加，與模型組相比，具有顯著性差異(P<0.01)。提示黃芩苷(0.05 mmol/L和0.1 mmol/L)可以增加BRL-3A細胞對葡萄糖的消耗量，改善細胞對葡萄糖的攝取和利用障礙。

與空白組相比，△△表示P<0.01；與模型組相比，**表示P<0.01圖2 黃芩苷對BRL-3A細胞葡萄糖消耗量的影響Fig.2 Effects of baicalin on consumption of glucose in BRL-3A cells

2.2 黃芩苷對BRL-3A細胞甘油三酯含量的影響

黃芩苷對BRL-3A細胞甘油三酯含量的影響如圖3所示。由圖3可知：經PA處理之后，BRL-3A細胞甘油三酯含量均明顯增多，引起細胞脂代謝紊亂。模型組細胞甘油三酯含量增加明顯，與空白組相比，具有顯著性差異(P<0.01)。黃芩苷能夠明顯減少BRL-3A細胞中甘油三酯的含量(P<0.05、P<0.01)，且高劑量(0.1 mmol/L)效果強于低劑量(0.05 mmol/L)。提示黃芩苷可以減少BRL-3A細胞中甘油三酯的含量，改善細胞脂代謝紊亂。

與空白組相比，△△表示P<0.01；與模型組相比，**表示P<0.01，*表示P<0.05圖3 黃芩苷對BRL-3A細胞甘油三酯含量的影響Fig.3 Effects of baicalin on triglyceridecontent in BRL-3A cells

2.3 黃芩苷對BRL-3A細胞自噬蛋白LC3-II/LC3-I和Beclin1的影響

微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)是自噬產生的標志，有LC3-I型和LC3-II型。當機體出現(xiàn)缺氧、能量不足等應激狀況時，細胞自噬被誘導，位于胞漿內的LC3-I就會轉變成LC3-II，而LC3-II是位于自噬體膜上的，因此LC3-II的增多表明自噬體的生成增多，亦可用于衡量自噬的發(fā)生程度[11]。

Beclin1位于人類染色體17q21上，由BH3、中央螺旋區(qū)和進化保守區(qū)組成，是細胞自噬體形成過程中非常重要的自噬基因。Beclin1通過調節(jié)III型磷脂酰肌醇3-激酶的活性，促進自噬體膜的生成，與LC3-II的表達一致，是細胞自噬的正向調節(jié)因子，常常作為細胞自噬發(fā)生發(fā)展的評價指標[12]

結果顯示：空白組BRL-3A細胞LC3-I多，LC3-II少，經過PA處理之后，模型組LC3-II更少，LC3-II/LC3-I的比值明顯降低，Beclin1的表達也明顯減少，與空白組相比，具有顯著性差異(P<0.01)，表明自噬被抑制。經黃芩苷干預之后，高劑量和低劑量組BRL-3A細胞LC3-I的表達減少，LC3-II的表達增多，LC3-II/LC3-I的比值明顯升高，Beclin1的表達也明顯增多(P<0.01)，表明自噬被誘導促進(圖4)。

與空白組相比，△△表示P<0.01；與模型組相比，**表示P<0.01圖4 黃芩苷對BRL-3A細胞自噬蛋白 LC3-II/LC3-I的影響Fig.4 Effects of baicalin on LC3-II/LC3-I in BRL-3A cells

2.4 黃芩苷對BRL-3A細胞自噬基因Beclin1的影響

進一步驗證自噬基因Beclin1的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)模型組BRL-3A細胞的Beclin1 mRNA的表達明顯降低，與空白組相比，具有顯著性差異(P<0.01)。黃芩苷高劑量和低劑量組BRL-3A細胞的Beclin1 mRNA的表達明顯升高，與模型組相比，具有顯著性差異(P<0.01)，實驗結果與自噬蛋白Beclin1的表達一致。提示黃芩苷可以增加Beclin1的表達，誘導自噬的發(fā)生。

與空白組相比，△△表示P<0.01；與模型組相比，**表示P<0.01圖5 黃芩苷對BRL-3A細胞自噬基因Beclin1的影響Fig.5 Effect of baicalin on Beclin1 in BRL-3A cells

3 結論

1)將BRL-3A細胞采用0.2 mmol/L棕櫚酸處理后，細胞對葡萄糖的消耗量減少，細胞中甘油三酯含量增多，表明BRL-3A細胞發(fā)生了葡萄糖的攝取和利用障礙，并出現(xiàn)脂代謝紊亂，證明胰島素抵抗模型復制成功。同時發(fā)現(xiàn)經棕櫚酸處理過的BRL-3A細胞LC3-II/LC3-I和Beclin1的表達降低，表明當BRL-3A細胞出現(xiàn)胰島素抵抗時，自噬被抑制。

2)黃芩苷可以增加BRL-3A細胞對葡萄糖的攝取和利用，減少細胞中的甘油三酯含量，改善脂代謝紊亂狀態(tài)及改善胰島素抵抗，這可能與其促進自噬的發(fā)生有關。