劉文靜，鄭永祥，張 革，唐章勇，余 蓉

(1.四川大學(xué) 華西藥學(xué)院，四川 成都 610041；2.四川德博爾制藥有限公司，四川 德陽 618000)

細(xì)胞色素C是由103～113個氨基酸殘基組成、分子量約為12 000～13 000的一種重要的氧化還原血紅蛋白酶，是生命體內(nèi)氧化還原鏈上重要的電子傳遞體。細(xì)胞色素C肽鏈中心包裹著一個鐵卟啉環(huán)，通過鐵卟啉環(huán)中心Fe價(jià)態(tài)的轉(zhuǎn)換來達(dá)到糾正呼吸的作用[1]。目前，細(xì)胞色素C在臨床上主要用于各種組織缺氧的急救；對抗癌藥物引起的白細(xì)胞降低、四肢循環(huán)障礙、肝臟疾患和腎炎亦有一定改善作用[2]；同時有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞色素C可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，用于抗癌治療[3-5]。

但細(xì)胞色素C存在穩(wěn)定性不好、誘發(fā)臨床過敏等問題[6-7]，限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。而過敏反應(yīng)的發(fā)生與純度有關(guān)，純度越高，過敏發(fā)生率越低[8]。為了減少細(xì)胞色素C臨床副反應(yīng)，提高藥物療效，進(jìn)一步提高細(xì)胞色素C質(zhì)量，需嚴(yán)格控制細(xì)胞色素C生產(chǎn)工藝。生化藥品的質(zhì)量受到生產(chǎn)過程各個環(huán)節(jié)因素的影響，細(xì)胞色素C傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝常用三氯乙酸作為沉淀劑，通過可逆沉淀來純化細(xì)胞色素C，然而有研究報(bào)道三氯乙酸可能會引起細(xì)胞色素C發(fā)生變性與聚合[9]。因此，目前有研究者對細(xì)胞色素C傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝進(jìn)行了改進(jìn)[10-11]，并對新舊工藝制備的細(xì)胞色素C純度進(jìn)行分析[12]。但對于傳統(tǒng)工藝中三氯乙酸如何影響細(xì)胞色素C的質(zhì)量尚未明確闡明，深入研究三氯乙酸對細(xì)胞色素C質(zhì)量的影響及其作用方式有助于為細(xì)胞色素C生產(chǎn)工藝改進(jìn)提供理論指導(dǎo)。

本文中，筆者采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)來對比分析三氯乙酸對細(xì)胞色素C質(zhì)量的影響，以期提高細(xì)胞色素C質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試樣品

傳統(tǒng)工藝制備的細(xì)胞色素C原料藥溶液(批號：2018001)、新工藝制備的細(xì)胞色素C原料藥溶液(批號：2018002、2018003、2018004、2018005、2018006、2018007)，四川德博爾制藥有限公司；新工藝制備的細(xì)胞色素C原料藥溶液(批號：2018008)，實(shí)驗(yàn)室自制；細(xì)胞色素C對照品(細(xì)胞色素C注射液，批號：20170422)，安徽宏業(yè)藥業(yè)有限公司；細(xì)胞色素C標(biāo)準(zhǔn)品(批號：140670-200501)，中國食品藥品檢定研究院。

1.1.2 試劑與儀器

乙腈(色譜級)、甲酸(色譜級)、甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮(TPCK)處理的胰蛋白酶(T1426)、三羥甲基氨基甲烷，Sigma-Aldrich公司；預(yù)染蛋白(Marker)，美國Thermo Scientific公司；其余試劑皆為市售國產(chǎn)分析純。

液相色譜-四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(miroTOF-QⅡ質(zhì)譜儀，Bruker Daltonics公司；LC-20AD型納升液相儀，Shimadzu公司)；Sorvall ST 16R型冷凍離心機(jī)、902-ULTS型酶標(biāo)儀，Thermo Scientific公司；VE-186型電泳系統(tǒng)，上海Tanon公司；2014AE64型全自動凝膠成像系統(tǒng)，北京五洲東方科技發(fā)展有限公司；UPH-I-20T型超純水器，四川優(yōu)普公司；丁基-瓊脂糖凝膠(Butyl-Sepharose FF)層析柱，常州天地人和公司；HD-21-1 型核酸蛋白檢測儀，HD-A型電腦采集器，上海青浦滬西儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞色素C制備

細(xì)胞色素C的傳統(tǒng)工藝參照文獻(xiàn)[13]進(jìn)行。

細(xì)胞色素C新工藝[12]采用疏水層析純化取代了三氯乙酸沉淀，其他步驟都應(yīng)用傳統(tǒng)工藝[13]。

疏水層析純化：鹽析后細(xì)胞色素C 上清液用丁基-瓊脂糖凝膠(Butyl-Sepharose FF)疏水層析柱純化，采用硫酸銨濃度梯度洗脫。A洗脫液為含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為45%硫酸銨的20 mmol/L磷酸鹽(pH 7.0)緩沖液；B洗脫液為20 mmol/L磷酸鹽(pH 7.0)緩沖液。洗脫程序?yàn)?～40 min 100%A，40～80 min 25%B，80～120 min 50%B，120～160 min 75%B，160～200 min 100%B。先用100%A洗脫液平衡柱子，將鹽析后含細(xì)胞色素C 的上清液緩慢加入層析柱中，按照上述程序進(jìn)行梯度洗脫，每個梯度用約10倍柱體積(柱體積5 mL)洗脫液洗脫。流速1.2 mL/min，檢測波長280 nm，收集最大吸收峰洗脫液。洗脫液經(jīng)超濾，透析得到新工藝制備的細(xì)胞色素C原料藥溶液樣品(批號：2018008)。

制備的細(xì)胞色素C樣品經(jīng)過2015版《中國藥典》[14]細(xì)胞色素C溶液項(xiàng)下的鑒別、含量測定，符合藥典規(guī)定。

1.2.2 SDS-PAGE分析細(xì)胞色素C

非還原SDS-PAGE法分析細(xì)胞色素C純度：配制5%濃縮膠與15%分離膠的不連續(xù)緩沖系統(tǒng)。細(xì)胞色素C原料藥樣品、對照品、標(biāo)準(zhǔn)品分別加超純水稀釋至1 mg/mL，按體積比4∶ 1分別加入5倍非還原蛋白上樣緩沖液，混勻，在沸水中孵育5 min，離心。細(xì)胞色素C樣品上樣量6 μL、標(biāo)準(zhǔn)蛋白上樣量3 μL。電泳操作參見2015版《中國藥典》通則0541第五法[15]。

還原性SDS-PAGE：取含有分子量2.5×104蛋白的細(xì)胞色素C標(biāo)準(zhǔn)品、對照品、原料藥樣品(2018001批次)進(jìn)行還原性SDS-PAGE，以上3批樣品分別加超純水稀釋至1 mg/mL，按體積比4∶ 1分別加入5倍還原性蛋白上樣緩沖液處理，其余實(shí)驗(yàn)操作同上述非還原SDS-PAGE法。

1.2.3 LC-MS/MS分析與鑒定細(xì)胞色素C二聚體

色譜條件：Acclaim PepMap 100 C18 (5 μm,5 mm×0.3 mm,10 nm)預(yù)柱，Thermo Scientific公司；Venusil?XBP C18(5 μm,4.6 mm×150 mm,15 mm)分析柱，Agela Technologies公司。流動相0.1%甲酸水溶液(A)- 0.1%甲酸乙腈溶液 ( B )，層析程序?yàn)?～4 min 5% B，4～30 min 5%～40% B，30～35 min 40%～80% B，35～45 min 80% B，45～45.1 min 80%B～5% B，45.1～62 min 5% B；總流速 400 nL/min；上樣量10 μL。

質(zhì)譜條件：正離子模式掃描，一級掃描范圍50～2 200m/z，分辨率20 000，碎裂模式誘導(dǎo)碰撞解離(CID)，碰撞氣體Ar，離子源電壓1 500 V，毛細(xì)管溫度150 ℃，二級掃描范圍依賴于一級母離子質(zhì)荷比自動選擇。

切下非還原SDS-PAGE凝膠中細(xì)胞色素C(2018001批次)樣品的2.5×104條帶，經(jīng)消化脫色、還原烷基化、胰蛋白酶酶解處理后，進(jìn)行LC-MS/MS分析并與豬源蛋白庫搜尋鑒定。用質(zhì)譜采集軟件Bruker Daltonics micro TOF control提取質(zhì)譜數(shù)據(jù)，利用 Data Analysis 軟件標(biāo)峰后，采用MASCOT search engine version 2.3.01搜索豬源蛋白庫，進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與討論

2.1 疏水層析圖譜

新工藝制備細(xì)胞色素C的疏水層析圖譜見圖1。由圖1可知：鹽析后含細(xì)胞色素C的上清液與Butyl-Sepharose FF層析柱在高鹽濃度緩沖液中吸附，低鹽濃度洗脫液中解吸附，在約120 min處出現(xiàn)1個極大吸收峰，該峰為細(xì)胞色素C峰，其余小吸收峰多為雜蛋白峰。結(jié)果表明采用疏水層析法能有效分離細(xì)胞色素C與雜蛋白。

圖1 細(xì)胞色素C疏水層析圖譜Fig.1 Hydrophobic chromatography of cytochrome C

2.2 SDS-PAGE分析細(xì)胞色素C結(jié)果

非還原SDS-PAGE分析細(xì)胞色素C的結(jié)果見圖2。由圖2可知：所有細(xì)胞色素C供試樣品都含有1.22×104的豬心細(xì)胞色素C，其中細(xì)胞色素C標(biāo)準(zhǔn)品、對照品、2018001批次樣品還包含1個大小約2.5×104的蛋白，余下幾批次樣品不含該蛋白質(zhì)。通過比較這些樣品的生產(chǎn)工藝發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞色素C標(biāo)準(zhǔn)品、對照品、2018001批次樣品制備過程中均使用了三氯乙酸作為沉淀劑，而其余7個批次樣品制備過程中未使用三氯乙酸。這提示約2.5×104大小的蛋白分子條帶與生產(chǎn)過程中使用三氯乙酸沉淀劑之間具有某種關(guān)聯(lián)性，而三氯乙酸沉淀劑容易引起細(xì)胞色素C聚合，該蛋白分子量約2.5×104，恰為細(xì)胞色素C分子量(1.22×104)的2倍，所以可以推斷：2.5×104處的蛋白很可能是2個細(xì)胞色素C分子聚合而成的二聚體。

二硫鍵是蛋白質(zhì)聚合常見的連接方式，為了驗(yàn)證該蛋白是否為二硫鍵連接的細(xì)胞色素C二聚體，因此采用還原性SDS-PAGE進(jìn)一步分析該蛋白，若經(jīng)還原劑處理后2.5×104附近的條帶消失，且不出現(xiàn)其他新的條帶，則說明該蛋白是由兩個細(xì)胞色素C分子通過二硫鍵連接而成的二聚體。具體分析結(jié)果見圖3。由圖3可知：泳道1～3為細(xì)胞色素C經(jīng)還原劑處理后的蛋白樣品，泳道4～6為未經(jīng)還原劑處理的細(xì)胞色素C蛋白樣品，以上所有樣品都顯示存在分子量約2.5×104的條帶，這說明此2.5×104蛋白不是由肽鏈間二硫鍵連接的二聚體，而可能是2個細(xì)胞色素C分子以非二硫鍵方式形成的二聚體，為了驗(yàn)證此猜想需要進(jìn)一步分析二聚體的結(jié)構(gòu)。其中，經(jīng)還原劑處理蛋白樣品的該條帶略高于未經(jīng)還原劑處理的蛋白樣品的對應(yīng)條帶，筆者認(rèn)為這可能是因?yàn)槲催€原的蛋白質(zhì)可能不會被SDS完全飽和[16]，這使得該類蛋白的分子質(zhì)量測定結(jié)果不如完全變性的蛋白的分子質(zhì)量測定結(jié)果明確，從而造成電泳遷移速度的差異。

M—標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1—標(biāo)準(zhǔn)品； 2—對照品；3—2018001批次；4—2018002批次；5—2018003批次；6—2018004批次；7— 2018005批次；8—2018006批次；9—2018007批次；10—2018008批次圖2 細(xì)胞色素C非還原SDS-PAGE分析Fig.2 Non-reduced SDS-PAGE analysis of cytochrome C

M—標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1—標(biāo)準(zhǔn)品+還原劑；2—對照品+還原劑；3—2018001批次+還原劑；4—非還原標(biāo)準(zhǔn)品；5—非還原對照品；6—非還原2018001批次圖3 細(xì)胞色素C還原性SDS-PAGE、非還原SDS-PAGE分析Fig.3 Reduced and non-reduced SDS-PAGE analysis of cytochrome C

2.3 LC-MS/MS分析與鑒定細(xì)胞色素C二聚體結(jié)果

為了驗(yàn)證分子量約2.5×104的蛋白是否為細(xì)胞色素C二聚體，需要進(jìn)一步分析其氨基酸序列，因此對傳統(tǒng)工藝制備的細(xì)胞色素C樣品(2018001批次)非還原SDS-PAGE圖譜中的2.5×104蛋白質(zhì)進(jìn)行LC-MS/MS分析，圖4為該蛋白分子的一級質(zhì)譜圖，肽段信息如表1所示。對多個肽段進(jìn)行了二級質(zhì)譜分析，圖5列舉了其中最長的一段18肽(氨基酸序列為GITWGEETLMEYLENPKK，分子量為2 137.0)的一級質(zhì)譜圖，選擇m/z=1 069.5的雙電荷正離子為母離子，得到該18肽的二級質(zhì)譜圖，見圖6。將分析得到的2.5×104蛋白的質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用Mascot與豬源蛋白庫搜尋鑒定，結(jié)果見表2。由表2可知：該蛋白與豬源細(xì)胞色素C比對有最高得分3 461，有最大的覆蓋率76%，同時結(jié)合其他蛋白的分子量分析，可以推測該2.5×104大小的蛋白只含有細(xì)胞色素C分子；再結(jié)合經(jīng)還原劑處理的細(xì)胞色素C樣品的SDS-PAGE電泳結(jié)果可知，此蛋白是由2個細(xì)胞色素C以非二硫鍵的其他某種共價(jià)鍵連接而成的二聚體。

細(xì)胞色素C二聚體的存在會降低細(xì)胞色素C原料藥的純度，增大引發(fā)過敏的概率，影響產(chǎn)品穩(wěn)定性。由于細(xì)胞色素C二聚體自身不如細(xì)胞色素C穩(wěn)定，且在細(xì)胞色素C原料藥中含量極低，又與主成分性質(zhì)相近，不易檢測，須從源頭上控制，因此應(yīng)盡量在細(xì)胞色素C制備過程中不使用三氯乙酸，以免產(chǎn)生細(xì)胞色素C二聚體。

表1 細(xì)胞色素C二聚體的LC-MS/MS分析的肽段信息

圖5 荷質(zhì)比1 069.5的一級質(zhì)譜圖Fig.5 Mass spectrum of ion with mass to charge ratio of 1 069.5

圖6 荷質(zhì)比1 069.5的二級質(zhì)譜圖Fig.6 MS/MS of ion with mass to charge ratio of 1 069.5

序號蛋白序列號蛋白描述分子量得分覆蓋率/%1p62895細(xì)胞色素C11 8103 461762A0A286ZW70肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶23 8271 895623A0A287B5W2未標(biāo)記蛋白26 5631 007234A0A286ZY95纖維連接蛋白1265 75692685A0A287AKA2未標(biāo)記蛋白34 588903486F1SGG3角蛋白 165 006706117I3LDS3角蛋白1059 230623168F1SLQ7線粒體核糖體循環(huán)因子29 099552379P02189肌紅蛋白17 0745255110A0A287AEL2角蛋白1456 30044327

3 結(jié)論

主要針對細(xì)胞色素C生產(chǎn)工藝的重要因素——三氯乙酸對細(xì)胞色素C質(zhì)量的影響開展研究，采用SDS-PAGE分析不同工藝下的細(xì)胞色素C樣品，發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)工藝中有使用三氯乙酸沉淀劑的細(xì)胞色素C標(biāo)準(zhǔn)品、對照品、傳統(tǒng)工藝制備的細(xì)胞色素C樣品(2018001批次)在約細(xì)胞色素C分子量2倍大小處出現(xiàn)明顯條帶(約2.5×104)，而采用無三氯乙酸沉淀劑的生產(chǎn)工藝制備的細(xì)胞色素C樣品(2018002～2018008批次)沒有此條帶。根據(jù)三氯乙酸會使細(xì)胞色素C變性與聚合的性質(zhì)，推測該蛋白可能是細(xì)胞色素C二聚體。

進(jìn)一步采用LC-MS/MS分析與搜尋鑒定該蛋白，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)工藝制備的細(xì)胞色素C 樣品(2018001批次)中該蛋白與豬源細(xì)胞色素C的相似性得分最高(3461)，覆蓋率最大(達(dá)到76%)，并結(jié)合相關(guān)蛋白質(zhì)的分子量分析，可以證明該蛋白為細(xì)胞色素C二聚體。

本研究首次探明了細(xì)胞色素C制備過程中三氯乙酸沉淀劑易導(dǎo)致細(xì)胞色素C形成二聚體，說明三氯乙酸是導(dǎo)致細(xì)胞色素C變性與聚合的重要因素之一，這為細(xì)胞色素C工藝優(yōu)化與產(chǎn)品質(zhì)量提高提供了理論依據(jù)與改進(jìn)方向。