余美嬋 陳凱炎 劉思源

口腔黏膜的基本結(jié)構(gòu)與皮膚相似，由上皮細(xì)胞和包括成纖維細(xì)胞、血管、淋巴管和神經(jīng)在內(nèi)的黏膜組成[1]。口腔黏膜能抵抗病原體、外源性物質(zhì)和機械應(yīng)力[2]?？谇火つび线^程與皮膚傷口愈合基本相同，包括止血、炎癥、增殖和膠原基質(zhì)重塑階段[3]。但是，兩者的區(qū)別在于口腔黏膜愈合更快且不會導(dǎo)致瘢痕形成[4]。成纖維細(xì)胞是肉芽組織的重要組成部分，在黏膜修復(fù)中具有重要作用[5]。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是內(nèi)源性小的非編碼RNA（長度為19～22 nt），在不同的生理和病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，包括發(fā)育、增殖、分化、凋亡和癌變[6]。最近，miRNA 在皮膚傷口愈合過程中的作用逐漸顯現(xiàn)，許多miRNA 通過調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞遷移參與再上皮化[7]。miR-2053 是表皮中一種豐富的角質(zhì)形成細(xì)胞特異性miRNA[8]。通過調(diào)節(jié)PI（3）k 途徑，在促進新生兒皮膚干細(xì)胞擴增方面具有重要作用[9]，但在口腔黏膜修復(fù)中的作用和機制尚不明確。本研究擬探索miR-2053 在口腔黏膜修復(fù)中對成纖維細(xì)胞的影響及其作用機制，為口腔黏膜創(chuàng)傷治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

2018 年1 月至2018 年12 月就診于我科的初診患者40 例（實驗組），其中口腔扁平苔蘚（Oral Lichen Planus，OLP）10 例、灼口綜合征（Burning Mouth Syndrome，BMS）10 例、復(fù)發(fā)性口腔潰瘍（Recurrent Aphthous Uicer，RAU）10 例，以及其他口腔黏膜?。ㄈ缈谇火つだw維化、慢性唇炎、白斑等）10例。實驗組中男、女各20 例，年齡（52.43±12.76）歲。對照組為本院體檢中心健康體檢者40 例，無全身系統(tǒng)疾病，未檢出口腔黏膜病。對照組中男、女各20例，年齡（52.60±13.19）歲。兩組一般情況比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），具有可比性。兩組均在無菌條件下取少許口腔黏膜組織，-80 ℃保存。本研究由我院倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者均知情同意。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡＞18 周歲；②符合《口腔黏膜病學(xué)》[10]中所列出的疾病癥狀，如復(fù)發(fā)性口腔潰瘍、肉芽腫性唇炎、灼口綜合征等。排除標(biāo)準(zhǔn)：①口腔內(nèi)同時出現(xiàn)兩種以上黏膜疾病者；②認(rèn)知障礙患者；③有嚴(yán)重全身系統(tǒng)疾病者。

1.2 儀器與試劑

DMEM-F12 培養(yǎng)液（Hyclone，美國），胎牛血清（GIBCO，美國），青霉素和鏈霉素雙抗混合液、BCA檢測試劑盒（碧云天，中國），胰蛋白酶、cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Ⅱ試劑盒（Taraka，日本），CCK-8（同仁，日本），Trizol（BBI，中國），Collagen Ⅰ一抗、Collagen Ⅲ一抗（CST，德國），MMP-1 一抗、MMP-13 一抗（Santa，美國），ECL 顯色液（南京諾唯贊生物科技有限公司），總RNA 提取分離試劑盒、miRcute miRNA 第一鏈合成試劑盒、miRcute miRNA 熒光定量檢測試劑盒（天根生化科技有限公司）。

CO2培養(yǎng)箱（Sigma，美國），流式細(xì)胞儀（Muse，德國），7500Fast PCR（Thermo，美國），酶標(biāo)儀（Molecular Device，美國），低速離心機（Thermo，美國），WB 電源（伯樂，美國）。

1.3 研究方法

1.3.1 牙齦成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)與處理

人牙齦成纖維細(xì)胞（Human Gingival fibroblasts，HGF-1）購置于美國模式培養(yǎng)物集成庫（ATCC）。將復(fù)蘇后的HGF-1 置于含10%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞進入對數(shù)生長期后進行傳代，傳至3 代后的細(xì)胞用于后續(xù)實驗。本研究設(shè)置miR-2053 模擬物組、miRNA 陰性模擬物組及空白對照組（不處理）。以脂質(zhì)體LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染HGF-1，miRNA模擬物及陰性模擬物均來自上海吉瑪基因公司。

1.3.2 miR-2053 對HGF-1 增殖能力的影響

將各組細(xì)胞以2×104cells/mL 接種與96 孔板后處理24 h，以CCK-8 法檢測細(xì)胞活力。每孔中加入相應(yīng)體積的CCK-8 試劑，混勻后在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h，之后于酶標(biāo)儀450 nm 波長處測OD 值。細(xì)胞存活率=（實驗組OD 值/對照組OD 值）×100%。進行3 次獨立重復(fù)實驗。

1.3.3 miR-2053 對HGF-1 遷移能力的影響

應(yīng)用Transwell 進行細(xì)胞遷移能力檢測，將各組細(xì)胞以4×104cells/mL 的密度置于Transwell 上室中。上室給予含0.2%胎牛血清培養(yǎng)基進行接種，下室給予含10%胎牛血清培養(yǎng)基作為趨化。將Transwell 小室置于6 孔板中，于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，95%乙醇固定，0.2%結(jié)晶紫染色，拍照。細(xì)胞相對遷移率=實驗組平均遷移距離/對照組平均遷移距離×100%。

1.3.4 miR-2053 對HGF-1 凋亡的影響

各組按照2×105cells/mL 細(xì)胞數(shù)量接種于12 孔板后，按照Annexin V Dead Cell Kit 說明書進行操作后經(jīng)Muse 流式細(xì)胞儀進行檢測，并進行3 次獨立重復(fù)實驗。

1.3.5 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測

本研究采用總RNA 提取分離試劑盒對不同處理組及口腔黏膜組織進行總RNA 的提取，然后將提取的miRNA 通過miRcute miRNA 第一鏈合成試劑盒進行cDNA 的合成，mRNA 根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反應(yīng)說明進行cDNA 合成。通過miRcute miRNA 熒光定量檢測試劑盒對miR-2053 的表達量進行檢測，內(nèi)參基因為U6；用Ⅱ試劑盒檢測CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、MMP-1、MMP-13 的mRNA 表達量，內(nèi)參基因為GAPDH。依據(jù)2-△△ct 計算各miRNA 及mRNA 的相對表達量（表1）。

表1 熒光定量PCR 引物序列Table 1 Fluorescence quantitative PCR primer sequences

1.3.6 Western-blot 檢測相關(guān)蛋白的表達

按照蛋白提取試劑盒說明書提取組織蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，用Western-blot 法測定βactin（內(nèi) 參）、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-1、MMP-13 的蛋白表達情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用EpiData 對全部實驗數(shù)據(jù)進行錄入整理，定量數(shù)據(jù)以（）表示。應(yīng)用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布且方差齊性檢驗合格后，采用單因素方差分析（one-way ANOVA），與對照組比較采用Dunnett 法；不符合正態(tài)分布則用非參數(shù)檢驗進行分析。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-2053 的表達情況

與對照組比較，實驗組miR-2053 在口腔黏膜組織中的表達量明顯升高（P＜0.05）（圖1）。

圖1 miR-2053 在各組中的相對表達量（*：與對照組相比，P＜0.05）Fig.1 Relative expression level of miR-2053 in each group(*:compared with control group,P＜0.05)

2.2 miR-2053 在各組HGF-1 中的表達量

HGF-1 經(jīng)不同處理后，通過RT-PCR 對miR-2053 表達量進行驗證。與陰性模擬物組及對照組比較，miR-2053 模擬物轉(zhuǎn)染組中miR-2053 表達量明顯升高（P＜0.05）；而陰性模擬物組與對照組相比無明顯差異（P＞0.05）（圖2）。

圖2 不同處理方法處理后HGF-1 細(xì)胞miR-2053 相對表達量（*：與對照組比較，P＜0.05；#：與陰性模擬物組比較，P＜0.05）Fig.2 Relative expression levels of miR-2053 in HGF-1 cells after treated by different methods (*:compared with control group,P＜0.05;#:compared with negative analogue group,P＜0.05)

2.3 HGF-1 細(xì)胞活力情況

與陰性模擬物組及對照組比較，轉(zhuǎn)染miR-2053后的細(xì)胞存活率明顯下降（P＜0.05）；而陰性模擬物組與對照組相比無明顯差異（P＞0.05）（圖3）。

2.4 HGF-1 細(xì)胞凋亡情況

與陰性模擬物組及對照組比較，轉(zhuǎn)染miR-2053后的細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；而陰性模擬物組與對照組相比無明顯差異（P＞0.05）（圖4）。

2.5 HGF-1 細(xì)胞遷移能力

與陰性模擬物及對照組比較，轉(zhuǎn)染miR-2053 后的HGF-1 細(xì)胞遷移率明顯升高（P＜0.05）；而陰性模擬物與對照組相比無明顯差異（P＞0.05）（圖5）。

圖5 不同處理方法處理后HGF-1 細(xì)胞遷移率（*：與對照組比較，P＜0.05；#：與陰性模擬物組比較，P＜0.05）Fig.5 HGF-1 cell migration rate after treated by different methods (*:compared with control group,P＜0.05;#:compared with negative analogue group,P＜0.05)

2.6 Real-time PCR 檢測CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、MMP-1、MMP-13 基因表達情況

本研究通過對組織重塑中的關(guān)鍵基因檢測，驗證miR-2053 對其的影響。結(jié)果顯示，與陰性模擬物組及對照組比較，轉(zhuǎn)染miR-2053 后HGF-1 細(xì)胞的Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-1、MMP-13 基因相對表達量均明顯降低（P＜0.05）（圖6）。

2.7 Western-blot 檢 測Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-1、MMP-13 蛋白表達情況

對相關(guān)蛋白進行檢測后發(fā)現(xiàn)，與陰性模擬物組及對照組比較，轉(zhuǎn)染miR-2053 后HGF-1 細(xì)胞的Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-13 蛋白相對表達量均出現(xiàn)明顯降低（P＜0.05），而MMP-1 蛋白表達雖有下降趨勢但無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖7）。

圖6 轉(zhuǎn)染miR-2053 對組織重塑相關(guān)基因表達的影響（*：與對照組比較，P＜0.05；#：與陰性模擬物組比較，P＜0.05）Fig.6 Effect of transfection of miR-2053 on the expression of genes involved in tissue remodeling (*:compared with control group,P＜0.05;#:compared with negative analogue group,P＜0.05)

圖6 轉(zhuǎn)染miR-2053 對組織重塑相關(guān)基因表達的影響（*：與對照組比較，P＜0.05；#：與陰性模擬物組比較，P＜0.05）Fig.6 Effect of transfection of miRNA-2053 on the expression of genes involved in tissue remodeling (*:compared with control group,P＜0.05;#:compared with negative analogue group,P＜0.05)

3 討論

口腔黏膜病多發(fā)于中老年人群，主要發(fā)生在口腔黏膜及其軟組織上，常以口腔軟組織上的斑紋、充血及糜爛為主要臨床表現(xiàn)[11]。牙齦成纖維細(xì)胞向損傷區(qū)域的遷移，是對損傷組織的修復(fù)反應(yīng)。這些細(xì)胞通過填充該區(qū)域并分泌愈合所需的細(xì)胞外基質(zhì)成分進行修復(fù)，在口腔黏膜病的治療中具有重要意義[12]。目前，miRNA 在疾病中的作用越來越受到重視，但在口腔黏膜病中的作用機制尚不明確。miR-2053 是表皮中表達最豐富的皮膚miRNA 之一，已證實其對成纖維細(xì)胞的遷移及表皮的修復(fù)具有重要作用[13-14]。因此，本研究首先對miR-2053 在實驗組及對照組中的表達進行檢測，結(jié)果顯示miR-2053 的表達在實驗組中明顯升高，表明miR-2053 在口腔黏膜病中扮演著重要的角色。因此，我們進一步通過miR-2053 轉(zhuǎn)染的方式使其過表達，檢測其對HGF-1 的細(xì)胞活力、凋亡及遷移能力的影響，并通過對組織修復(fù)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及蛋白的檢測進一步對其機制進行探討。

與對照組及陰性模擬物組比較，轉(zhuǎn)染miR-2053的人牙齦成纖維細(xì)胞模型的細(xì)胞活力及遷移率均明顯下降（P＜0.05），而凋亡顯著增高（P＜0.05），表明過表達miR-2053 對HGF-1 存在一定程度的損傷。已有研究顯示，miR-2053 能夠?qū)е陆琴|(zhì)形成細(xì)胞遷移能力下降[15]，與本研究結(jié)果一致。雖然本研究結(jié)果可以看出miR-2053 在口腔黏膜病患者的組織中表達增高，且能夠通過影響HFG-1 的一般情況而影響疾病的進程，但其機制仍需進一步探討，因此選擇對牙周組織重塑起關(guān)鍵作用的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子作進一步研究。

牙周組織重塑在口腔黏膜疾病中扮演重要的角色，是一種復(fù)雜的機械和生物力學(xué)反應(yīng)過程[16]。本研究選擇的Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-1、MMP-13 基因在牙周組織重塑中起重要作用[12]。與對照組及陰性模擬物組比較，轉(zhuǎn)染miR-2053 后的HGF-1中4 種基因的表達量均明顯下降（P＜0.05）；在對蛋白水平的進一步檢測中發(fā)現(xiàn)，與對照組及陰性模擬物組比較，轉(zhuǎn)染miR-2053 后的HGF-1 的CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、MMP-13 蛋白相對表達量均明顯降低（P＜0.05），而MMP-1 蛋白表達雖有下降趨勢但無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。陳盈哲等[12]采用不同細(xì)胞因子處理成纖維細(xì)胞，同樣發(fā)現(xiàn)Collagen Ⅰ、CollagenⅢ、MMP-1、MMP-13 在口腔黏膜修復(fù)中的作用，與本研究結(jié)果一致。Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ作為調(diào)節(jié)組織重構(gòu)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在表皮修復(fù)中具有重要作用，而miR-2053 可能通過影響其表達從而影響口腔黏膜病的進程。MMP-1、MMP-13 作為間質(zhì)膠原酶，通過特異性降解膠原蛋白從而發(fā)揮作用。雖然本研究中MMP-1 蛋白水平表達并未出現(xiàn)明顯改變，但其基因水平表達出現(xiàn)降低，可能由于轉(zhuǎn)錄時間的存在從而導(dǎo)致基因出現(xiàn)變化但蛋白還未明顯改變。這種現(xiàn)象在既往研究中同樣發(fā)生過[17]。

綜上所述，我們認(rèn)為miR-2053 可能通過影響Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-1、MMP-13 基 因及蛋白的表達，進而影響人牙齦成纖維細(xì)胞的活力、凋亡及遷移能力，從而影響口腔黏膜病的康復(fù)及病程。因此，今后或許可以利用與其相關(guān)的抑制藥劑為口腔黏膜病的靶向治療提供新的方向。