馮雨晴，李亞飛，2，史宏志*，周 駿，白若石，馬雁軍，林淑貞

1. 河南農業(yè)大學煙草學院煙草行業(yè)煙草栽培重點實驗室 煙草農業(yè)減害研究中心，鄭州市金水區(qū)文化路95 號 450002

2. 河南經(jīng)貿職業(yè)學院，鄭州市鄭東新區(qū)龍子湖北路58 號 450018

3. 上海煙草集團有限責任公司北京卷煙廠，北京市通州區(qū)萬盛南街99 號 100024

白肋煙煙葉產量、品質和安全性對卷煙品質有較大影響。Lewis 等［1］研究表明，白肋煙Yb 基因突變導致其煙葉色素含量低，光合作用弱，含碳化合物含量低，易出現(xiàn)煙葉硝酸鹽大量積累和氮素利用率低等問題［2-3］。煙草葉片中的硝酸鹽是煙葉和煙氣中煙草特有亞硝胺（TSNAs）的重要前體物，且煙葉硝酸鹽含量與TSNAs 積累呈顯著直線相關關系［4-6］。因此，減少煙葉中硝酸鹽積累量對降低煙葉TSNAs 形成和提高卷煙安全性具有重要意義。有研究表明，煙葉硝酸鹽含量與碳氮代謝密切相關［7-8］，氮還原同化能力弱和物質能量供應不足是引起白肋煙煙葉硝酸鹽積累的主要原因［9］?？梢姡岣邿熑~光合碳固定和氮同化能力是降低煙葉硝酸鹽含量的重要途徑。

鉬素（Mo）是煙草生長必需的微量元素，且鉬是醛氧化酶、亞硫酸鹽氧化酶、黃嘌呤脫氫酶等的組成成分，能促進植物色素合成，對煙草氮素營養(yǎng)吸收及提高煙葉葉綠素含量和穩(wěn)定性、增強光合能力、促進碳水化合物合成轉移和提高作物產量等有重要作用［10-12］。硝酸還原酶（NR）是一種水溶性鉬黃蛋白，參與硝態(tài)氮還原為氨的過程，且有利于蛋白質合成，而鉬素作為NR 的必須組分，直接影響NR 活性。因此，鉬在氮代謝過程中起著核心作用［13-14］。植物缺鉬癥狀與缺氮癥狀較為相似，推測是由于缺鉬導致NR 活性喪失，造成氮素還原作用異常，氮素同化作用受影響，進而呈現(xiàn)出類似缺氮的癥狀［15-16］。施鉬可提高烤煙生長發(fā)育中前期葉綠素含量，增加光合速率，從而促進光合產物的形成，提高煙葉產量［17-19］。同時，施鉬對植物葉片NR 有激活作用，能促進植物氮代謝，降低植物體內硝酸鹽含量，提高氮肥利用效率［20-21］。煙草中鉬是通過土壤以鉬酸根離子的形式被根系吸收利用，而通過葉面噴施煙草葉片也可以吸收鉬，且比根系吸收更快［17］。李亞飛等［22］研究表明，施用鉬酸銨能提高烤煙煙葉NR 活性，促進蛋白質合成；秦亞光等［23］研究發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內，隨著施鉬量的增加，烤煙硝酸鹽含量降低；廖曉勇等［24］研究提出，施鉬對煙草農藝性狀的各項指標均有促進作用；崔國明等［12］試驗認為，烤煙施Mo 能促進煙株生長，協(xié)調煙株生理代謝，增加煙葉產量和產值，改善煙葉品質。同時，國外的一些研究也表明，Mo 在植物氮素代謝過程中扮演著重要的角色，參與植物體的生物固氮、硝酸鹽還原以及含氮化合物運輸?shù)龋?5-27］。在豆科植物和非豆科植物中，施鉬可提高大豆、水稻和大麥的硝酸還原酶活性，促進氮代謝，降低植株硝酸鹽含量，進而提高氮肥利用率［28-30］。Elrys 等［31］研究表明，施用鉬濃度100 mg/L 時馬鈴薯塊莖中硝酸鹽含量顯著降低?？梢姡壳坝嘘P鉬對烤煙和植物生長和品質影響的研究已有報道，但鉬對白肋煙苗期生物量積累和碳氮代謝影響的研究卻鮮有涉及。為此，設置了不同鉬酸鈉濃度噴施試驗，旨在明確鉬酸鈉對白肋煙色素含量、光合作用、氮素還原同化作用、硝酸鹽含量和碳氮化合物協(xié)調性的影響，并篩選出白肋煙苗期鉬酸鈉的適宜施用濃度，為白肋煙減害和煙葉品質的提高提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 煙苗培育

試驗于2017 年4 月在國家煙草生理生化研究基地人工氣候室內進行。氣候室條件設置：溫度22～28 ℃，每12 h晝夜光暗交替（白天時間段設置為7：00—19：00），光照強度800 μmol·m-2·s-1，相對濕度85%。供試白肋煙品種為TN90，在人工氣候室內采用漂浮育苗，煙草種子用2%次氯酸鈉溶液消毒2次，每次5 min，隨后將其播種在填滿基質的200 孔育苗盤中。浮盤規(guī)格：長78 cm，寬38 cm，高5.5 cm，每盤200孔。育苗框規(guī)格：長82 cm，寬45 cm，高20 cm，每框1 個浮盤，育苗時在框中加入10 L 清水，待煙苗長至大十字期時開始加入Hoagland 營養(yǎng)液［8］。待煙苗長至4～5 片真葉（苗齡40 d 左右）時，選取長勢均勻一致的壯苗，用去離子水將根系沖洗干凈后，移栽至小花盆中（規(guī)格7.1 cm×6.7 cm×7.8 cm），每盆1 株，煙苗長至七葉一心時進行噴施處理。每處理選取10 株長勢均勻一致的煙苗，共計50株。用清水和不同濃度鉬酸鈉溶液于每天17：00時對煙苗葉片正反面進行噴施，至葉片上液滴均勻且欲下滴時為止，連續(xù)噴施3 d，最后1 次噴施后間隔7 d 取樣測定。

1.2 試驗處理

試驗采用單因素隨機區(qū)組設計，設置5個處理，即處理1 為清水對照（CK）；處理2 為0.1%鉬酸鈉；處理3 為0.5%鉬酸鈉；處理4 為1.0%鉬酸鈉；處理5 為2.0%鉬酸鈉。每處理設置3 次生物學重復。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 樣品處理

在最后一次噴施后7 d 取樣并進行相關生理指標的測定。將各處理煙苗平均分成兩份，分別用于新鮮樣品檢測和殺青樣品保存。樣品分組后，將各處理煙苗的根、莖、葉分離，用去離子水清洗干凈，并用吸水紙吸干后進行測定和樣本保存。

新鮮樣本用于煙葉色素含量（質量分數(shù)）、硝酸還原酶活性（NRA）和可溶性蛋白質含量（質量分數(shù)）測定。殺青樣品的制作方法：將各處理樣品葉片清潔干凈后，放入烘箱中于105 ℃殺青20 min，60 ℃烘干至恒質量，稱量，磨碎，過0.3 mm（60目）篩，用于煙葉干物質積累量、含量和常規(guī)化學成分含量（質量分數(shù)）的測定。

1.3.2 煙草光合速率的測定

選取各處理長勢均勻一致的煙苗，采用便攜式光合測定儀（LI-6400，美國Licor 公司）測定光合速率。該儀器為開放式氣路，紅藍光源，光照強度為800 μmol·m-2·s-1，測定時間為8：30—10：00，測定對象為煙苗最大功能葉（從下向上數(shù)，第3 葉位）［32］。每處理重復測定3 次。

1.3.3 煙葉NRA、色素和可溶性蛋白質含量的測定

選取各處理長勢均勻一致的煙苗，選擇最大功能葉的6～8 支脈（位于葉尖與葉基中部）之間葉肉，用剪刀剪成2 mm × 5 mm 條狀，混勻后用于煙葉NRA、可溶性蛋白含量、色素含量的測定，每處理數(shù)據(jù)為3 次重復的平均值。采用95%乙醇提取法測定色素含量，采用活體法測定NR 活性，采用考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白質含量［14］。

1.3.4 總氮、總糖和還原糖含量的測定

采用濃H2SO4水楊酸法測定煙葉含量［33］。煙葉總氮、總糖和還原糖含量按照煙草行業(yè)標準［34-35］用連續(xù)流動分析儀（AA3，德國BRAN+LUEBBE 公司）檢測。

煙葉氮素積累量和氮素利用效率的計算：

氮素積累量（mg/株）=煙葉總氮含量（%，g/100 g）×煙葉干質量（g/株）×1 000

氮素利用效率（NUE，mg DW/mg N）=煙葉干物質量/煙葉氮素積累量

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016 和Origin pro 9.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析和制圖；使用SPSS 17.0 軟件進行方差分析，用LSD 法對煙葉干物質積累量、色素含量、NRA、總氮和氮素積累量等指標進行方差分析和方差齊性檢驗。

2 結果與分析

2.1 不同濃度鉬酸鈉處理對煙葉干物質積累的影響

由圖1 可知，在0.1%～2.0%濃度范圍內，施用鉬酸鈉后煙葉干物質積累均呈增加趨勢，且隨鉬酸鈉濃度增加煙葉干物質積累呈升高趨勢。其中，0.1%、0.5%、1.0%和2.0%鉬酸鈉處理后，煙葉干物質積累量較對照分別提高7.83%、16.87%、30.72%和30.12%，其中1.0%和2.0%鉬酸鈉處理效果最佳。這說明施用1.0%和2.0%鉬酸鈉對增加煙葉干物質積累和培育壯苗有積極作用。

圖1 不同濃度鉬酸鈉處理煙葉干物質積累量的比較Fig.1 Comparison of dry matter accumulation among tobacco leaves sprayed with sodium molybdate at different concentrations

2.2 不同濃度鉬酸鈉處理對煙葉色素含量和光合速率的影響

葉綠素是參與植物葉綠體內光合作用的重要色素，能夠捕捉光能并將光能轉化為化學能，對煙草的生長發(fā)育及產量和品質形成均具有重要作用［36］。由圖2 可知，在0.1%～2.0%濃度范圍內，施用不同濃度鉬酸鈉后，煙葉色素含量和光合速率均呈現(xiàn)出升高趨勢；在0.1%、0.5%、1.0%和2.0%鉬酸鈉處理后煙葉色素含量較對照分別提高1.13%、2.55%、4.25%和3.40%，其中噴施1.0%鉬酸鈉后，煙葉色素含量明顯高于對照，且差異達到顯著水平；煙葉光合速率分別較對照提高0.85%、3.70%、12.81%和12.15%，其中，1.0%和2.0%鉬酸鈉處理后，煙葉光合速率與對照間差異均達到顯著水平。本試驗中，在0.1%～1.0%鉬酸鈉范圍內，煙草色素含量和光合速率均隨鉬酸鈉濃度增加而呈現(xiàn)出升高趨勢，但在鉬酸鈉濃度大于1.0%時煙葉色素含量和光合速率相對穩(wěn)定，且保持在較高水平，即煙葉光合速率在2.0%鉬酸鈉和1.0%鉬酸鈉處理間差異不顯著。

圖2 不同濃度鉬酸鈉處理煙葉光合速率和色素含量的比較Fig.2 Comparison of photosynthetic rate and pigment content among tobacco leaves sprayed with sodium molybdate at different concentrations

2.3 不同濃度鉬酸鈉處理對煙葉總糖和還原糖含量的影響

煙葉中的總糖和還原糖是重要碳水化合物，為煙株氮代謝活動提供能量物質和碳骨架，對煙株生長發(fā)育有重要影響［8］。由圖3 可知，在0.1%～2.0%濃度范圍內，噴施鉬酸鈉后，煙葉總糖含量變化不大，但煙葉還原糖含量與對照間差異達到顯著或極顯著水平；在0.1%～2.0%濃度范圍內，隨著施用鉬酸鈉濃度的增加，煙葉還原糖含量呈現(xiàn)出升高趨勢，其中在鉬酸鈉濃度為0.5%、1.0%和2.0%時，煙葉還原糖含量較對照分別增加19.69%、23.38%和22.46%。可見，噴施鉬酸鈉能夠提高煙苗碳同化能力，促進碳水化合物合成，為煙草中還原同化和其他代謝過程提供充足碳源，這有利于降低煙葉硝酸鹽含量和提高煙葉產量［8］。

2.4 不同濃度鉬酸鈉處理對煙葉酶活性的影響

圖3 不同濃度鉬酸鈉處理煙葉總糖和還原糖含量的比較Fig.3 Comparison of total sugar and reducing sugar contents among tobacco leaves sprayed with sodium molybdate at different concentrations

NR 是植物體硝酸鹽代謝途徑中的限速酶，具有將硝酸鹽還原成為亞硝酸鹽的作用［32］。鉬是NR 的重要組分，增施鉬肥能夠提高作物NRA，對促進煙株的同化利用有積極作用，對降低煙株體內硝酸鹽含量和提高氮肥利用效率均有良好效果［10］。由圖4 可知，煙葉NRA 隨著鉬酸鈉濃度增加而呈現(xiàn)出升高趨勢。其中，施用鉬酸鈉濃度為0.5%、1.0%和2.0%時，煙葉NRA較對照分別提高16.87%、30.72%和30.12%，差異均達到極顯著水平。施用2.0%鉬酸鈉后，煙葉NRA 與鉬酸鈉濃度為1.0%時差異不大，說明鉬酸鈉能促進苗期白肋煙NRA 的提高，且濃度為1.0%時效果最佳。

圖4 不同濃度鉬酸鈉處理煙葉硝酸還原酶活性的比較Fig.4 Comparison of nitrate reductase activity among tobacco leaves sprayed with sodium molybdate at different concentrations

2.5 不同濃度鉬酸鈉處理對煙葉可溶性蛋白含量的影響

葉片中可溶性蛋白不僅參與了植物器官的建成，而且很大一部分蛋白是具有調控生理生化反應活性的酶類物質，其含量可以反映植物的代謝強度［37］。由圖5 可知，在0.1%～2.0%濃度范圍內，隨著鉬酸鈉濃度的增加，煙葉可溶性蛋白含量呈現(xiàn)出升高趨勢，說明施用鉬酸鈉能促進氮素同化作用，有利于煙葉可溶性蛋白的形成。其中，在鉬酸鈉為1.0%和2.0%時，煙葉可溶性蛋白含量較對照分別提高18.43%和17.84%，差異達到極顯著水平，且鉬酸鈉濃度為1.0%和2.0%時，煙葉可溶性蛋白含量差異不大。由此可見，在0.1%～2.0%濃度范圍內，1.0%鉬酸鈉濃度對提高煙葉可溶性蛋白含量的作用效果最佳。

圖5 不同濃度鉬酸鈉處理煙葉可溶性蛋白含量的比較Fig.5 Comparison of soluble protein content among tobacco leaves sprayed with sodium molybdate at different concentrations

2.6 不同濃度鉬酸鈉處理對煙葉總氮含量和氮素積累量的影響

由圖6 可知，在0.1%～2.0%濃度范圍內，煙葉總氮含量隨鉬酸鈉濃度的增加呈現(xiàn)出下降趨勢，其中在鉬酸鈉濃度為1.0%和2.0%時，煙葉總氮含量較對照分別降低10.76%和10.57%，差異達到顯著水平。在0.1%～2.0%濃度范圍內，煙葉氮素積累量隨鉬酸鈉濃度增加而呈現(xiàn)出升高趨勢，其中在0.1%、0.5%、1.0%和2.0%鉬酸鈉處理時，煙葉氮素積累量較對照分別提高3.50%、7.44%、16.59%和16.37%。噴施1.0%鉬酸鈉的煙葉總氮含量下降10.76%，煙葉氮素積累量提高16.59%，說明噴施鉬酸鈉能增加煙葉干物質積累量，從而使煙葉氮素積累量呈現(xiàn)增加趨勢。原因可能是由于鉬酸鈉處理能促進煙草干物質積累，從而對總氮含量產生稀釋效應，最終導致煙葉總氮含量下降。另一方面也表明，噴施鉬酸鈉能促進煙株的碳氮代謝，對增加煙葉干物質積累量和降低硝酸鹽含量有積極作用。

圖6 不同鉬酸鈉濃度處理煙葉總氮含量和氮素積累量的比較Fig.6 Comparison of total nitrogen content and nitrogen accumulation among tobacco leaves sprayed with sodium molybdate at different concentrations

2.7 不同濃度鉬酸鈉處理對煙葉 含量和硝態(tài)氮/總氮（-N/TN）的影響

圖7 鉬酸鈉處理煙葉和的比較Fig.7 Comparison of content and content/total nitrogen content among tobacco leaves sprayed with sodium molybdate at different concentrations

2.8 不同濃度鉬酸鈉處理對煙葉氮素利用效率的影響

由圖8 可知，噴施不同濃度鉬酸鈉均能提高煙葉氮素利用效率，且差異達到顯著或極顯著水平。與對照相比，鉬酸鈉濃度為1.0%和2.0%時，煙葉氮素利用效率分別提高12.42%和10.92%，與鉬酸鈉能促進煙葉干物質積累，提高煙草氮代謝能力有關。

圖8 鉬酸鈉處理煙葉氮素利用效率的比較Fig.8 Comparison of nitrogen use efficiency among tobacco leaves sprayed with sodium molybdate at different concentrations

3 討論

NR 是高等植物氮同化過程中的關鍵限速酶，可直接調節(jié)硝酸鹽的還原，從而調節(jié)氮代謝，并影響光合碳代謝［38］。Mo 作為NR 的主要組成成分，參與植物的氮代謝和碳代謝過程［39］。本試驗條件下，噴施不同濃度鉬酸鈉能不同程度地提高煙葉色素含量和光合速率，與劉利［40］和張紀利等［41］在草莓和烤煙上的研究結果一致。其中在鉬酸鈉濃度為1.0%時，煙葉還原糖含量和干物質積累量顯著提高，與色素和光合作用指標的試驗結果一致，而總糖含量與對照間差異不大，與崔國明等［12］和張紀利等［41］的研究結果有所不同，可能是因為鉬酸鈉處理對煙葉總糖和還原糖含量的影響有時間效應，煙草生長前期鉬酸鈉處理能促進光合作用直接產物（葡萄糖、果糖等還原性糖）的生成，而對總糖（淀粉等）的影響相對滯后。這說明鉬酸鈉處理能夠提高煙草光合作用能力，促進光合產物的積累，可能與鉬能提高作物葉綠素結構的穩(wěn)定性有關［42］，而鉬酸鈉參與植物體光合作用的機制尚不清楚，有待進一步研究。此外，噴施不同濃度鉬酸鈉均能提高煙葉NRA 和可溶性蛋白質含量，其中鉬酸鈉濃度為1.0%和2.0%時，煙葉硝酸鹽含量顯著降低，NRA 顯著提高，同時，在該處理條件下煙草可溶性蛋白質含量顯著提高，表明該處理條件下有更多的被吸收利用。鉬酸鈉可以通過提高NR 活性，增強氮素還原同化能力，從而降低煙葉硝酸鹽積累量，與趙靜等［21］、崔國明等［12］研究結果一致。本試驗結果中，噴施不同濃度鉬酸鈉能提高煙葉氮素積累量和煙葉干物質積累量，可能是由于鉬酸鈉提高氮同化能力，進而增強碳同化能力，促進光合產物的積累和植株的生長，其作用機制還有待進一步深入探索。值得關注的是，白肋煙需氮量高，氮利用效率低，而鉬酸鈉的施用能提高煙葉氮素利用效率，進而減少氮肥施用，對優(yōu)質低危害煙葉的生產和可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。本試驗中，鉬酸鈉濃度為1.0%時對苗期白肋煙煙葉總體效果較好，最佳劑量能否作為田間的最佳施用量，有待進一步大田試驗驗證。

4 結論

在溫度22～28 ℃，光照強度800 μmol·m-2·s-1，相對濕度85%，每12 h 晝夜光照交替的人工氣候室條件下，白肋煙煙苗施用0.1%～2.0%濃度鉬酸鈉后，煙葉色素含量、光合速率、兩糖含量、NRA 和可溶性蛋白含量、煙葉干物質積累量均增加，煙葉氮素利用效率明顯提高，且硝酸鹽含量顯著降低。鉬酸鈉處理能提高白肋煙煙葉氮素還原同化能力和碳同化能力，促進光合產物的積累，從而促進硝酸鹽還原同化過程，有利于降低煙葉硝酸鹽含量，在白肋煙苗期以1.0%鉬酸鈉處理效果最佳。