陳曦，陳亮，李大力

生物工程與大健康

李大力 博士，華東師范大學生命科學學院研究員，博士生導師。2007年獲湖南師范大學遺傳學博士學位，2009年和2014年先后破格晉升為副教授、研究員，2016年獲教育部青年長江學者項目資助。主要從事CRISPR等基因編輯技術的開發(fā)、應用和基因治療研究。率先在國際上建立了基于TALEN和CRISPR/Cas9等基因編輯技術的大鼠和小鼠基因修飾技術體系，并利用多種基因編輯方法在遺傳疾病動物模型中定點修復突變基因?qū)崿F(xiàn)長期療效。相關研究成果在、和等專業(yè)雜志發(fā)表。

基因治療在臨床應用中的研究進展

陳曦，陳亮，李大力

華東師范大學 生命科學學院 上海市調(diào)控生物學重點實驗室，上海 200241

20世紀60年代，科學家首次提出利用基因治療治愈遺傳疾病的概念。這一全新的概念性策略旨在通過將外源性遺傳物質(zhì)引入患者體內(nèi)來獲得長期的治療效果。五十年的風雨沉浮，21世紀取得的里程碑式突破為基因治療開啟了新的篇章。文中回顧和總結了基因治療的發(fā)展歷程和重大突破，包括一些重要的臨床試驗和已批準上市的基因療法，以及新興的基因編輯技術。相對于傳統(tǒng)療法的獨特優(yōu)勢，基因療法將會成為治療遺傳疾病的重要手段，必將造福全人類。

基因治療，遺傳罕見病，臨床試驗，上市藥物，基因組編輯技術，CRISPR/Cas9系統(tǒng)

1 基因治療發(fā)展的歷史

針對遺傳疾病的基因治療旨在通過向細胞遞送治療性基因來實現(xiàn)基因的持久表達，并以最低的安全風險為前提使治療基因的表達足以達到改善或治愈疾病的水平。20世紀60年代美國分子生物學家Lederberg J首次提出基因治療的初步概念，為基因治療的發(fā)展奠定了基礎[1]。1972年基因療法被正式提出，并被認可作為人類遺傳疾病的一種治療方式[2]?；蛑委煾鶕?jù)載體的給藥途徑可分為離體和在體基因治療兩種類別 (圖1)：1) 離體基因治療 () 是直接取自異體正常細胞或患者自身的病變細胞，體外通過基因?qū)氲姆绞叫揎椉毎?，將修飾后的細胞體外擴增后回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)，從而達到治療疾病的目的。2) 在體基因治療 () 則是利用非病毒或病毒載體直接將治療基因遞送到患者體內(nèi)的方式來治療疾病。臨床試驗針對個體差異和疾病類型的不同而選擇最佳的治療方式：離體基因治療可通過體外篩選的方式獲得更多高效轉導且無脫靶效應的細胞。此外，自體細胞的使用不會誘導免疫反應，可實現(xiàn)安全有效的治療效果。然而，離體基因治療由于步驟繁瑣，細胞的離體操作容易導致其活力低下，且一些整合型病毒的使用更易引起體內(nèi)的隨機插入，進而誘發(fā)癌變，因此這一方法的應用受到諸多局限；相比離體基因治療，在體基因治療的操作相對簡便，對于一些體外無法培養(yǎng)的細胞來說無疑是最佳的選擇。但體內(nèi)編輯的不確定性導致這一方法無法避免隨機整合和脫靶效應的發(fā)生，并且一些病毒載體還有可能在體內(nèi)出現(xiàn)嚴重的免疫反應，因此合理地優(yōu)化編輯的方法和改造遞送的載體將會大大降低這一方法的風險。

圖1 基因治療原理示意圖：在體(左)和離體(右)基因治療

基因治療在臨床前研究中的突破性進展促使科學家們在20世紀90年代初開始進行臨床試驗。第一個獲得授權的基因治療研究誕生于1989年美國國立衛(wèi)生研究院 (National Institutes of Health, NIH)，研究人員收集了腫瘤浸潤的淋巴細胞，使用逆轉錄病毒載體 (Retrovirus, RV) 進行基因標記的方式在體內(nèi)檢測“腫瘤歸巢”的功能。這項研究為證明“人類細胞可以被體外基因改造并安全地回輸給患者”提供了一個直接證據(jù)[3]。基因治療第一個成功的臨床案例為1995年報道的一例通過體內(nèi)回輸RV糾正自體白細胞來治療重度聯(lián)合免疫缺陷綜合征 (Severe combined immunedeficiency, SCID) 的臨床試驗，這一案例被認為是基因治療發(fā)展史上一個重要的里程碑[4]。自1990年開始，全世界有數(shù)百個實驗室陸續(xù)開展了各種基因治療的臨床試驗，據(jù)統(tǒng)計截止當前已有超過4 000位病人參與了500多項臨床試驗[5]。

然而，1999年在賓夕法尼亞大學的James Wilson醫(yī)生開展的一項腺病毒基因治療臨床試驗中，受試者由于腺病毒誘發(fā)的致命性免疫反應而致死。隨后一系列的早期試驗結果接連暴露基因治療嚴重的副作用，包括針對載體的免疫反應以及載體介導的原癌基因插入激活引起的惡性腫瘤等，這一系列的負面報道無疑給基因治療的發(fā)展蒙上了巨大的陰影[6]。這些失敗的案例讓研究者們開始反思基因治療的風險因素，從而陸續(xù)推動了更多基礎研究的快速發(fā)展，包括病毒學、免疫學、細胞生物學、動物模型構建和疾病靶向治療等。伴隨著這些領域的快速發(fā)展，基因治療于21世紀初開始逐漸走出困境。慢病毒 (Lentivirus, LV) 等新型載體的問世提高了外源基因遞送到非分裂細胞的效率和安全性。在早期臨床試驗中，這些安全有效的載體被用于自體造血干細胞 (Hematopoietic stem cells, HSCs) 的轉導，對于患有免疫缺陷、血紅蛋白病、代謝和儲存障礙的患者而言，這些載體顯得更加安全有效?；诖?，美國食品藥品監(jiān)督管理局 (Food and Drug Administration, FDA) 于2017年批準了首個基因治療產(chǎn)品，包括T (Chimeric antigen receptor T, CAR-T) 細胞免疫療法治療B細胞惡性腫瘤 (Kymriah和Yescarta) 和AAV載體體內(nèi)治療先天性失明 (Luxturna)。針對神經(jīng)肌肉疾病和血友病等更多遺傳疾病的基因治療藥品也有望在將來獲得更多的批準許可。

近年來，基于工程化核酸酶的基因組編輯技術得到了快速發(fā)展。與傳統(tǒng)的基因治療不同，基因組編輯技術可實現(xiàn)精確的基因插入、敲除以及“修正”?；蚪M編輯技術可以在離體細胞上進行，也可以通過載體遞送的方式在體內(nèi)實現(xiàn)原位基因組的編輯。通過基因編輯技術修飾的細胞不存在插入突變致癌的風險，由于外源基因的定點整合，治療效果不會隨著細胞的增殖而丟失，能夠?qū)崿F(xiàn)長期安全有效的治療效果。目前，基因組編輯技術的臨床轉化尚處于初級階段，預計在未來的10年內(nèi)將開展多項臨床基因組編輯試驗。

最初基因治療僅被用于遺傳性疾病的治療，而現(xiàn)在正被廣泛用于腫瘤、感染性疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病的治療，如CAR-T細胞免疫療法。隨著基因治療的快速發(fā)展，更多諸如多基因遺傳病、神經(jīng)遺傳性疾病等目前醫(yī)學上束手無策的疾病將有望被根治。在經(jīng)歷了30多年的曲折發(fā)展后，基因治療正迅速成為各種人類遺傳性和獲得性疾病的有效治療方法。

2 基因治療臨床試驗的進展

隨著基礎研究的快速發(fā)展，從20世紀90年代早期開始，基因治療開始進入臨床試驗階段。截至2018年末，基因治療已在38個國家進行了2 930項試驗，這些早期階段的試驗為基因治療提供了重要的臨床指導意見[5](圖2)。

圖2 1989年至2018年全球基因治療臨床試驗項目數(shù)[7]

臨床實驗的結果不斷重復著“樂觀-失望”的反復循環(huán)，良好的治療效果也會伴隨著嚴重的副作用。盡管越來越多的臨床試驗證明基因治療的低效性，但基因治療的研究勢頭仍迅猛增長。其中最突出的試驗包括幾種原發(fā)性遺傳疾病Leber先天性黑蒙癥[8-10]、B型血友病[11]和X-連鎖腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良 (X-linked adrenoleukodystrophy, X-ALD)[12]的治療。根據(jù)Pharmaprojects在2018年的報告顯示，癌癥和罕見病是當前基因治療臨床研究最多的兩個領域，下圖展示了截止2018年底基因治療臨床試驗適應癥占比 (圖3)。

圖3 基因治療臨床試驗的適應癥[7]

3 基因治療臨床試驗在癌癥領域的研究進展

目前基因治療在腫瘤領域的應用，主要借助CAR-T或者T細胞受體 (TCR) 嵌合型T細胞(TCR-T)的形式以離體基因治療的方式達到殺傷腫瘤的目的。以CAR-T為例，這是一種新型的細胞免疫療法，利用白細胞分離技術從患者的血液中提取免疫T細胞，體外通過基因工程技術給T細胞整合一個能識別腫瘤細胞，并且同時激活T細胞殺死腫瘤細胞的嵌合抗體基因，再進行體外擴增改造的T細胞并回輸?shù)桨┌Y患者體內(nèi)，從而識別并攻擊自身的腫瘤細胞，達到腫瘤治療的目的。

基于CAR-T的細胞免疫療法已于2011年開展了臨床試驗，3例慢性淋巴細胞白血病患者接受了自體改造的T細胞治療，治療初期顯示了有利的治療效果[13]。2014年，CAR-T細胞治療在急性淋巴細胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia, ALL)中取得了顯著療效，給血液惡性腫瘤的治療帶來新的曙光。目前已有數(shù)百名患者采用這一方式進行了多次臨床試驗，在白血病或淋巴瘤患者中觀察到了前所未有的緩解率，特別是急性淋巴細胞白血病[14]。隨著更多的臨床試驗取得了積極的治療效果，癌癥免疫療法在臨床的成功轉化被雜志編輯評為2013年年度科學突破。隨后，兩種免疫細胞療法于2017年獲得美國FDA批準上市，即Novartis的Kymriah和Kite Pharmar的Yescarta，這兩款CAR-T療法主要針對罹患B細胞前急性淋巴細胞白血病及復發(fā)或難治性大B細胞淋巴瘤的成人患者。但令人遺憾的是，國內(nèi)至今尚無批準上市的細胞免疫療法。

盡管目前基于CAR和TCR的細胞免疫療法在血液腫瘤的治療中具有巨大的潛力，但其面臨的一個重大問題就是細胞因子風暴。當這些工程化的T細胞靶向清除癌細胞的同時，大量產(chǎn)生的細胞因子也會對宿主的其他組織器官進行攻擊，導致患者出現(xiàn)高燒、低壓、休克甚至死亡。雖然基于CAR和TCR的T細胞免疫療法在某些特定腫瘤中的療效顯著，但我們?nèi)孕枰嗟难芯縼砝斫獠涣挤磻l(fā)生的機制，進而開發(fā)相應的對策來規(guī)避這一風險。

4 基因治療在遺傳罕見病中的臨床應用

基因治療在遺傳疾病中的應用主要針對單基因遺傳疾病，目前臨床試驗主要以基因增補的方式實現(xiàn)疾病的治療。截至2018年11月，針對單基因遺傳疾病的臨床試驗占比11.5% (圖3)。一項隨機、雙盲、有安慰劑對照的2b期臨床試驗首次概念性地證明了通過非病毒基因治療的方法能夠改善囊性纖維化病人的肺功能[15]。在這項研究中，78名患者在肺部接受了遞送編碼CFTR質(zhì)粒的陽離子脂質(zhì)體的治療。盡管治療的效果并不顯著，但這一治療總體來說是安全的，并為后來臨床試驗的改進提供了建議，比如增加脂質(zhì)體制劑的劑量以及使用頻率等。針對原發(fā)性免疫缺陷病的臨床試驗顯示出了良好的治療效果，目前已有超過150名患者使用γ-逆轉錄病毒或慢病毒為載體的基因遞送策略來治療這類疾病[16]。腺苷脫氨酶缺乏癥 (Adenosine deaminase deficiency-related severe combined immune-deficiency, ADA-SCID) 作為此類疾病的代表，已有超過40名患者接受了基因治療，且生存率可達70%以上[17]?；谶@一結果，2016年歐洲藥品管理局 (European Medicines Agency, EMA) 批準了針對ADA-SCID疾病的首個基因治療產(chǎn)品Strimvelis，這也是第一個獲批的針對干細胞的離體基因治療產(chǎn)品。相比于20年前利用γ-逆轉錄病毒載體在ADA-SCID患兒中開展的首項離體基因治療研究[18-19]，Strimvelis在臨床試驗取得的成功主要得益于移植前使用化療進行了清髓處理，為基因修飾的自體干細胞創(chuàng)造了擴增的空間[20]。盡管ADA-SCID的基因治療臨床試驗尚未觀察到與載體遺傳毒性有關的不良事件，但目前仍在開展基于慢病毒載體的臨床試驗，以期獲得更為安全有效的治療效果[21]。

由于慢病毒載體可作用于細胞周期的G0/G1期，并且具有更加安全的整合方式，因而成為目前基因治療中應用較為廣泛的載體[22]。針對原發(fā)性免疫缺陷病、X連鎖嚴重聯(lián)合免疫缺陷 (X-SCID)和Wiskott-Aldrich綜合征的慢病毒基因遞送治療已有報道，并且與其γ-逆轉錄病毒載體治療相比，安全性更高[23]。使用慢病毒載體基因改造HSCs治療遺傳性神經(jīng)系統(tǒng)疾病(Adrenoleukodystrophy, ALD)和異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良(Metachromatic leukodystrophy, MLD)也顯示出了積極的治療效果[24-27]，類似的方法也被用于血紅蛋白病的治療，其中包括一例針對鐮狀細胞病的患者[28]。此前一項針對β-地中海貧血的臨床試驗已證明，使用慢病毒載體將基因引入自體HSCs來實現(xiàn)珠蛋白的穩(wěn)定特異性表達是可行的，該患者自停止輸血后已安全存活達6年之久[29]。

腺相關病毒 (Adeno-associated virus, AAV) 是一類單鏈線狀DNA缺陷型病毒，因其具有高效的轉導能力、非整合性以及能特異性感染各組織器官，已被作為一種安全有效的病毒載體用于基因治療的臨床試驗?；贏AV的臨床試驗展現(xiàn)出了令人振奮的結果，這些試驗中最值得關注的包括基于α-1抗胰蛋白酶缺乏癥[30]、A型[31]和B型[32-33]血友病以及眼科疾病[34-35]的基因治療。UniQure公司開發(fā)的基于AAV載體用于治療脂蛋白脂肪酶缺乏的基因治療產(chǎn)品Glybera早在2012年就獲得了EMA的許可。而美國第一個基于AAV的基因治療產(chǎn)品是由Spark Therapeutics推出的Luxturna，于2017年12月19日獲得了FDA的正式批準。然而，首例利用AAV載體針對B型血友病的臨床治療以失敗告終，究其原因在于患者本身存在的AAV抗體會中和載體的療效，以及載體輸注后AAV病毒衣殼會引起遲發(fā)型的細胞免疫應答，進而導致轉導細胞被免疫系統(tǒng)破壞而失效[11]。通過篩選沒有抗體的患者作為受試對象以及進行皮質(zhì)類固醇藥物處理可以解決這些問題[36]。目前針對A型血友病的臨床試驗主要使用AAV載體遞送編碼截短因子Ⅷ的cDNA進行治療。近期的結果顯示了因子Ⅷ水平的短期提升，但隨著時間的推移而下降。盡管如此，在隨訪的3年內(nèi)仍能觀察到患者年出血率的穩(wěn)健降低[37]。此外，基于AAV9血清型的重組AAV載體也被用于脊髓性肌萎縮癥 (Spinal muscular atrophy, SMA)[38]和Sanfilippo綜合征A型 (Mucopolysaccharidosis IIIA, MPS IIIA)[39]的臨床治療，初步的臨床治療結果已顯示出該方法的有效性，這充分說明該載體能夠有效地穿過血腦屏障，轉導神經(jīng)細胞和脊髓，在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病上擁有極大的潛力。

隨著基因治療的飛速發(fā)展，進入臨床試驗階段的基因治療藥物層出不窮。在進行基因治療的臨床試驗之前，研究人員會從理論上推測該試驗的潛在風險。這些風險主要分為兩大類：1) 整合型載體存在插入突變的風險，這在臨床試驗中已得到證實，即治療X-連鎖嚴重聯(lián)合免疫缺陷(X-SCID)的兒童最終引發(fā)T細胞白血病[40-41]。2) 基因治療會引起自身免疫反應和炎癥反應，包括中和抗體引起的細胞免疫反應和病毒衣殼引起的體液免疫反應[42]。對于癌癥基因治療，風險還與過度激活的T細胞有關。雖然通過降低病毒載體的注射劑量以及進行免疫抑制類藥物的適當處理可以減輕這些風險，但更為安全有效的治療策略仍需進一步的優(yōu)化和完善。

5 基因治療上市藥物

基因治療產(chǎn)品應該是迄今為止人類開發(fā)的最為復雜的“藥物”。中國是世界上第一個批準商業(yè)基因治療產(chǎn)品的國家，首個基因治療產(chǎn)品Gendicine于2003年獲得我國國家食品藥品監(jiān)督管理局批準上市。Glybera是歐洲第一個獲批的基因治療產(chǎn)品，于2012年獲得歐洲EMA有條件的上市許可。隨著基因治療在臨床試驗上的突破性進展，自2012年以來，美國FDA和歐洲EMA共分別批準了8種基因治療產(chǎn)品：5種用于治療嚴重單基因疾病的產(chǎn)品、2種用于治療B細胞癌的嵌合抗原受體T細胞產(chǎn)品以及一種用于治療黑色素瘤的轉基因皰疹病毒產(chǎn)品，上述單基因疾病包括β地中海貧血、Leber先天性黑朦癥、脊髓性肌萎縮和一種罕見的原發(fā)性免疫缺陷和脂蛋白脂肪酶缺乏癥。下圖展示了自2003年以來全球范圍內(nèi)市場上獲批的基因治療產(chǎn)品 (圖4)，以下根據(jù)治療原理分別簡單介紹一下目前市場上比較經(jīng)典的幾款基因治療產(chǎn)品。

Imlygic[43]是一種用于治療通過手術無法去除的黑色素瘤的轉基因皰疹病毒 (Herpes simplex virus, HSV) 療法，于2015年上市，命名為T-Vec，是第一個FDA批準的可直接注入黑色素瘤的基因藥物。T-Vec是一種基因工程皰疹病毒 (HSV-1)，在腫瘤細胞中復制并合成粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子 (Granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)，導致腫瘤抗原的裂解和釋放，從而引發(fā)免疫反應殺死轉移性的黑色素瘤細胞。研究顯示，Imlygic治療后約16.3%的患者病灶縮小，且持續(xù)效果可達6個月以上。

圖4 醫(yī)藥市場基因治療藥物的發(fā)展概況

Zalmoxis[44]是首個基于供者來源T細胞的自殺基因免疫療法，于2016年被EMA有條件批準用于治療部分白血病和淋巴瘤。通過γ-逆轉錄病毒載體將誘導型“自殺基因” (Herpes simplex virus thymidine kinase, HSV-TK) 整合到異體來源的T細胞中，可通過服用更昔洛韋藥物來消滅引起免疫排斥反應的T細胞。帶有“自殺基因”的T細胞表達前藥轉換酶HSV-TK，后者可磷酸化激活更昔洛韋的細胞毒性，從而誘導T細胞“自殺”，防止?jié)撛诘囊浦参锟顾拗鞑?(Graft-versus-host disease, GVHD) 進一步惡化。根據(jù)臨床實驗結果顯示，Zalmoxis能有效恢復患者的免疫系統(tǒng)，明顯延長患者的生存周期，使部分匹配的HSCs的移植更加安全和有效。

Yescarta[45]是一種基于逆轉錄病毒的CAR-T細胞免疫療法，于2017年獲得FDA批準用于治療成年特定類型的大B細胞淋巴瘤患者。該療法使用患者自身的T細胞通過逆轉錄病毒進行遺傳修飾，使T細胞產(chǎn)生與CD28和CD3-zeta共刺激結構域連接的抗CD19的CAR，以幫助對抗淋巴瘤，完全緩解率可達58%。Yescarta于2018年獲EMA批準上市，用于治療成年兩次或以上系統(tǒng)性治療復發(fā)或難治性彌漫性大B細胞淋巴瘤 (Diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL) 和原發(fā)性縱隔大B細胞淋巴瘤 (Primary mediastinal large B-cell lymphoma, PMBCL) 的患者。

Kymriah[46]是一種基于慢病毒的CAR-T細胞免疫療法，于2017年獲美國FDA批準上市，用于治療不符合自體干細胞移植要求的非霍奇金淋巴瘤 (Non-Hodgkin’s lymphoma, NHL) 和B細胞急性淋巴細胞白血病患者。該療法在其CAR中使用4-1BB共刺激結構域來增強細胞的擴增和持久性，使用患者自身重編程的T細胞編碼轉基因CAR來鑒定和消除表達CD19的惡性和非惡性腫瘤細胞，整體的治療緩解率可達83%。

Strimvelis[47]是第一個用于治療因腺苷脫氨酶缺乏引起ADA-SCID的體外干細胞基因療法，于2016年獲EMA批準上市。該療法利用γ逆轉錄病毒將ADA基因拷貝整合入患者提取的CD34+ HSCs中，然后將HSCs以靜脈注射的方式重新輸入患者體內(nèi)，復制并產(chǎn)生具有正常功能的腺苷脫氨酶蛋白的細胞，成功修復患者的免疫缺陷表型。根據(jù)臨床實驗的結果，經(jīng)治療的患者沒有出現(xiàn)白血病轉化或骨髓增生異常的事件。

Luxturna[48]于2017年被FDA批準作為治療Leber先天性黑朦癥的孤兒藥，也是目前FDA唯一批準的在體基因療法。Luxturna是一種基于腺相關病毒2型 (AAV2) 的治療方法，通過AAV載體將人視網(wǎng)膜色素上皮特異性蛋白65 kDa (RPE65) 基因遞送至視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良患者的視網(wǎng)膜內(nèi)，體內(nèi)表達視力所必需的全反式視黃基酯異構酶，可在幾個月內(nèi)恢復患者視力，從而有效地治療雙等位基因RPE65突變相關的視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良患者。

Spinraza[49]是一種反義寡核苷酸 (Antisense oligonucleotides, ASOs) 基因療法，于2016年被EMA批準用于治療SMN1基因突變所引起的脊髓性肌萎縮癥，也是首個且唯一在美國獲批的SMA基因治療藥物。Spinraza通過反義寡核苷酸調(diào)控SMN2前mRNA的拼接，有效地增加患者全長SMN蛋白的表達，改善患者肌無力的癥狀。目前的臨床數(shù)據(jù)顯示Spinraza在SMA的治療中療效顯著，且具有廣泛的適用性。此外，由AveXis公司開發(fā)的基于AAV介導體內(nèi)表達SMN1蛋白的藥物Zolgensma也已于2019年被美國FDA批準用于治療SMA[50]。

Zynteglo[51-52]是由BlueBird Bio公司開發(fā)的一款基于慢病毒載體的離體基因療法，于2019年獲EMA批準用于治療輸血依賴型β地中海貧血 (Trans-fusion-dependent β thalassemia, TDT)。該療法先從患者骨髓分離HSCs，體外利用慢病毒載體向HSCs遞送患者缺少的β珠蛋白基因，為確?；剌斠浦驳某晒π?，患者需預先接受化療為回輸?shù)摹敖】导毎绷舫錾L空間。Zynteglo已成功幫助數(shù)名患者脫離輸血依賴長達5年之久。

6 基于新興基因組編輯技術的臨床治療進展

由于傳統(tǒng)的基因治療僅靠添加正常功能的基因?qū)τ陲@性疾病的治療往往束手無策，因此更多的研究開始聚焦基因增補策略的替代方案，包括靶向重組技術和基因組編輯技術等。基于同源重組修復 (Homology directed repair, HDR) 的傳統(tǒng)基因編輯技術雖然解決了缺陷基因定點修復和外源基因靶向插入的難題，但其體內(nèi)編輯的低效性極大地限制了其在臨床試驗中的應用。

人工核酸酶技術的開發(fā)極大地推動了基因編輯技術的發(fā)展，自第一個核酸內(nèi)切酶被證明可定點切割DNA產(chǎn)生雙鏈斷裂以來，特定位點的基因組編輯技術備受青睞[53]。通過核酸酶誘導的雙鏈斷裂 (Double strand breaks, DSBs) 不僅可用于基因敲除或基因敲入，還可用于精準的基因修復，拓展了基因治療的應用范圍。目前新一代基因組編輯工具 (如鋅指核酸酶ZFN、轉錄激活因子樣效應物核酸酶TALEN和規(guī)律成簇間隔短回文重復序列(CRISPR)/Cas9系統(tǒng)) 正被科學家們作為一種精準靶向的技術手段陸續(xù)用于遺傳疾病的臨床試驗治療。如圖5所示，新型基因組編輯技術的核心思路是通過基因工程的方法針對目標位點設計并構建特定的核酸內(nèi)切酶，使其能特異性識別、結合并切割靶向序列，在基因組的特定位點產(chǎn)生DSBs，通過非同源末端整合 (Non-homologousend joining, NHEJ) 的方式產(chǎn)生插入或缺失 (Insertions and deletions, Indels) 導致基因的敲除，在提供外源模板的條件下可通過NHEJ或HDR的方式發(fā)生靶向整合，將治療基因靶向整合到基因組或?qū)ν蛔兓蜻M行定點修復，成功編輯的細胞可傳遞給子代，以實現(xiàn)疾病的長期修復效果[54]。目前基于基因組編輯技術的臨床試驗的相關報道展示了良好的治療效果，其中包括利用ZFN治療HIV-193的臨床試驗，以及3項針對粘液多發(fā)性硬化癥Ⅰ/Ⅱ型和B型血友病的臨床試驗，均是通過ZFN遞送治療基因定點整合到肝細胞白蛋白位點的方式[55-56]。此外，針對急性髓性白血病和母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞腫瘤的早期臨床試驗則是利用TALEN編輯的靶向CD123的同種異體CAR-T細胞進行治療[57]。相比于ZFN和TALEN，CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)以其簡易性、高效性及安全性被認為是當前最有潛力的基因編輯工具[58]。前不久，美國生物科技公司Editas與制藥公司Allergan聯(lián)合開展了通過AAV遞送CRISPR體內(nèi)敲除CEP290突變內(nèi)含子的方式治療先天性黑朦10 (LCA10)的1/2期臨床試驗[59]。近日，由北京大學鄧宏魁研究組等多個研究團隊首次利用CRISPR/Cas9基因編輯的成體HSCs治療艾滋病和白血病患者，實現(xiàn)了CCR5突變的HSPCs在患有艾滋病合并急性淋巴細胞患者中同種異體移植，急性淋巴母細胞性白血病僅在移植后4周就得到了完全緩解。由于CRISPR/Cas9體外敲除效率偏低，移植后的受體反應效率還不足以達到治愈HIV-1的水平，因此，提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因編輯效率以及安全性仍需進一步的研究來改進和優(yōu)化[60]。此外，目前還有很多基于基因編輯的臨床試驗尚處于前期研究階段，未來有希望獲得批準用于更多疾病的臨床治療。

與經(jīng)典的基因遞送療法相比，基因組編輯治療正處于臨床轉化的初級階段，目前仍存在很多可能影響臨床應用的潛在風險，迫切需要在合適的動物模型和更多的臨床試驗中進行進一步的探索。例如，由核酸酶介導的DSBs在其他位點產(chǎn)生的脫靶效率亟待得到解決，此外遞送核酸酶的病毒載體的轉導效率和安全性也需要進一步的優(yōu)化提升。目前正在開展的工作主要集中在如何設計合適的CRISPR/Cas9系統(tǒng)來避免off-target以及在臨床應用之前如何預測、篩選以及檢測靶向和脫靶對基因組的改變[61]。最近開發(fā)的高保真CRISPR/Cas9核酸酶變體，被證明可顯著降低編輯后的脫靶效應[62]。然而，不可否認的是，在一味降低off-target效率的同時，也不可避免地會降低on-target的效率，如何平衡這一效果對于基因組編輯安全有效地用于臨床試驗至關重要。

圖5 基于基因組編輯技術的臨床試驗

7 結語與展望

回顧基因治療過去30年的發(fā)展歷程，臨床應用的成敗很大程度上取決于基礎研究的深度，正所謂“工欲善其事，必先利其器”，在大規(guī)模開展臨床試驗的過程中，仍需把注意力重新集中到基礎研究的發(fā)展上來。目前基因治療仍然存在諸多挑戰(zhàn)，其中包括對整合載體或基因組編輯脫靶引起的細胞毒性的認識和預防，提高基因遞送和編輯效率以治療更多類型的遺傳疾病，防止載體或基因組編輯復合物引起的體內(nèi)免疫反應等?；蛑委煹耐黄坪艽蟪潭壬先Q于基礎學科的發(fā)展，包括病毒學、免疫學、細胞生物學以及動物模型構建等，目前的研究主要針對以下幾個方面：1) 針對病毒載體的優(yōu)化改造可以進一步提高外源基因的高效轉導以及降低機體的免疫原性；2) 基于基因編輯工具的升級改造可以提高靶向切割的效率以及降低脫靶效應的產(chǎn)生；3) 開發(fā)高效精準的靶向基因組整合策略將有助于外源基因的長期穩(wěn)定整合，實現(xiàn)遺傳疾病的長期有效治療。過去十幾年里科學技術的快速進步和臨床試驗的重大突破充分展示了基因治療能夠為人類健康提供持久的益處，越來越多的努力朝著這個方向邁進。在不久的將來，基因治療或?qū)⒊蔀槿祟惣膊≈委煵豢苫蛉钡囊徊糠帧?/p>

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Research progress of gene therapy in clinical application

Xi Chen, Liang Chen, and Dali Li

Shanghai Key Laboratory of Regulatory Biology, School of Life Sciences, East China Normal University, Shanghai 200241, China

In the 1960s, scientists first raised the idea of curing genetic diseases using gene therapy. This new conceptual strategy aimed to achieve a much longer therapeutic effect by introducing exogenous genetic materials into the patients. After more than five decades of ups and downs, gene therapy has been brought into a new era by those milestone breakthroughs in the 21st century. Here we reviewed and summarized the history and breakthroughs of gene therapy, including some critical clinical trials, approved drugs, and emerging gene editing techniques. We believe that with their unique advantages over traditional therapies, more gene therapies will become practical approaches to genetic diseases and benefit the entire human race.

gene therapy, genetic rare disease, clinical trails, approved drugs, genome editing technology, CRISPR/Cas9 system

October 10, 2019;

November 25, 2019

National Natural Science Foundation of China (Nos. 81670470, 81873685).

Dali Li. Tel: +86-21-24206824; E-mail: dlli@bio.ecnu.edu.cn

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國家自然科學基金 (Nos. 81670470, 81873685) 資助。

(本文責編 陳宏宇)