白素杭，楊曉悅，張楠，張富涵，沈宗毅，楊娜，張文賽，喻長(zhǎng)遠(yuǎn)，楊昭

生物工程與大健康

楊昭 北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院副教授，碩士生導(dǎo)師。中國(guó)生物工程學(xué)會(huì)青年工作委員會(huì)委員，北京腫瘤病理精準(zhǔn)診斷研究會(huì)常委。2010年獲吉林大學(xué)學(xué)士學(xué)位，2015年獲中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所博士學(xué)位。致力于腫瘤干細(xì)胞和腫瘤免疫治療研究，國(guó)際上首次證明了膀胱癌干細(xì)胞起源于正常膀胱干細(xì)胞或膀胱癌非干細(xì)胞，相關(guān)研究成果發(fā)表于、、、和等國(guó)際權(quán)威學(xué)術(shù)期刊。

腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞在實(shí)體腫瘤中作用的研究進(jìn)展

白素杭，楊曉悅，張楠，張富涵，沈宗毅，楊娜，張文賽，喻長(zhǎng)遠(yuǎn)，楊昭

北京化工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100029

腫瘤是21世紀(jì)威脅人類健康的主要疾患之一。臨床上，實(shí)體瘤治療仍以手術(shù)切除、放化療和靶向治療為主，但這些方法往往不能根除腫瘤病灶，易導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和進(jìn)展。腫瘤免疫治療是利用人體的免疫系統(tǒng)，通過增強(qiáng)或恢復(fù)抗腫瘤免疫力實(shí)現(xiàn)控制和殺傷腫瘤的一種新的治療模式。腫瘤免疫治療能夠在眾多患者中產(chǎn)生持久反應(yīng)，過繼性免疫治療和免疫檢查點(diǎn)阻斷劑治療均可產(chǎn)生顯著的抗原特異性免疫反應(yīng)。腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞 (TILs)是一種存在于腫瘤組織內(nèi)部具有高度異質(zhì)性的淋巴細(xì)胞，在宿主抗原特異性腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用。最新研究表明，在腫瘤發(fā)生和治療過程中，TILs的亞群組成和數(shù)量與患者預(yù)后密切相關(guān)；抗腫瘤的TILs介導(dǎo)的過繼性免疫治療方法已在多種實(shí)體瘤中取得了良好的療效。文中就實(shí)體腫瘤中TILs的研究進(jìn)展作一綜述。

腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞，實(shí)體瘤，免疫治療，預(yù)后

腫瘤是一類嚴(yán)重危害人類生命健康的疾病，《2018年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)》顯示2018年全球約有1 810萬(wàn)癌癥新增病例和960萬(wàn)癌癥死亡病例，其中發(fā)病率最高的前10種癌癥均為實(shí)體瘤。相比于其他國(guó)家，我國(guó)癌癥發(fā)病率、死亡率均為全球第一。在1 810萬(wàn)新增癌癥病例中，我國(guó)占380.4萬(wàn)例；在960萬(wàn)癌癥死亡病例中，我國(guó)占229.6萬(wàn) 例[1]。2012年我國(guó)腫瘤登記年報(bào)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)發(fā)病率最高的前10種癌癥均為實(shí)體瘤，占全部癌癥的比例高達(dá)77%。其中，肺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌和女性乳腺癌的發(fā)病率最高[2]。

實(shí)體瘤的發(fā)生發(fā)展涉及大量的基因突變和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變異，由于該過程非常復(fù)雜，其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。目前臨床上，實(shí)體瘤治療仍以手術(shù)切除、放化療和靶向治療為主，但這些方法往往不能根除腫瘤病灶，易導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和 進(jìn)展。

傳統(tǒng)的腫瘤治療方案，更多的是針對(duì)腫瘤細(xì)胞本身，但事實(shí)上腫瘤是在高度復(fù)雜且動(dòng)態(tài)的環(huán)境中發(fā)展而來(lái)的。腫瘤微環(huán)境 (Tumor microenvironment，TME) 包括腫瘤細(xì)胞和腫瘤相關(guān)基質(zhì)，腫瘤基質(zhì)由腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞 (Tumor infiltrating lymphocytes，TILs)、成纖維細(xì)胞以及腫瘤周圍的細(xì)胞外基質(zhì)等共同構(gòu)成[3]。TILs是存在TME中具有異質(zhì)性的淋巴細(xì)胞，參與抗腫瘤免疫反應(yīng)，主要包括T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和髄源性抑制細(xì)胞等[4]。在微環(huán)境中，腫瘤組織與免疫系統(tǒng)的相互作用常常呈現(xiàn)雙向作用，如機(jī)體免疫系統(tǒng)可以對(duì)腫瘤產(chǎn)生正向的識(shí)別與殺傷，而腫瘤細(xì)胞又可通過其表面表達(dá)的抑制性分子和分泌腫瘤相關(guān)細(xì)胞因子來(lái)形成免疫抑制性的微環(huán)境，介導(dǎo)機(jī)體對(duì)腫瘤產(chǎn)生免疫耐受，造成免疫逃逸。腫瘤細(xì)胞和相關(guān)基質(zhì)之間的相互作用不僅影響疾病的發(fā)生和發(fā)展，并且與患者預(yù)后密切相關(guān)[5]。因此揭示各免疫細(xì)胞的特性及其與腫瘤的相互作用的機(jī)制，對(duì)于研究者通過重塑TME進(jìn)而提高機(jī)體的抗腫瘤效應(yīng)具有重要的科學(xué)意義。本文就實(shí)體腫瘤中TILs的研究進(jìn)展作一綜述。

1 TILs在惡性腫瘤中的作用

1.1 TILs在腫瘤微環(huán)境中的功能

TILs是具有高度異質(zhì)性的淋巴細(xì)胞亞群，不同的細(xì)胞亞群在TME中發(fā)揮著不同的作用。其包含具有正向調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的免疫細(xì)胞，如樹突狀細(xì)胞 (Dendritic cells，DC)、CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞、自然殺傷 (Natural killer，NK) 細(xì)胞等。它們通過對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別、殺傷和清除，實(shí)現(xiàn)腫瘤免疫應(yīng)答。TME也包含具有負(fù)向調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的免疫細(xì)胞，如腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、髄源性抑制細(xì)胞等。它們會(huì)分泌大量的免疫抑制細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，如IL-6、IL-10、VEGF、TGF-β等，抑制上述DC、CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞的激活，從而使腫瘤細(xì)胞逃脫免疫監(jiān)視，最終導(dǎo)致腫瘤形成、侵襲與轉(zhuǎn)移[6]。

1.1.1 具有正向調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的免疫細(xì)胞

CD4+Th1：CD4+Th1通過與主要組織相容性復(fù)合體 (Major histocompatibility complex，MHC Ⅱ)遞呈的多肽抗原反應(yīng)被激活，Th1主要分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2等細(xì)胞因子，介導(dǎo)細(xì)胞免疫，Th1可增強(qiáng)NK細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞的殺傷能力，同時(shí)抑制Th2增殖。

CD8+細(xì)胞毒T細(xì)胞：CD8+細(xì)胞毒T細(xì)胞主要功能是特異性識(shí)別內(nèi)源性抗原肽-MHCⅠ類分子復(fù)合物，進(jìn)而殺傷腫瘤細(xì)胞。殺傷機(jī)制主要有兩種：一是分泌穿孔素、顆粒酶等物質(zhì)直接殺傷把細(xì)胞；二是通過表達(dá)FasL或分泌TNF-α，分別與靶細(xì)胞表面受體結(jié)合誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡。

NK細(xì)胞：NK細(xì)胞是一類表面標(biāo)志為CD3–CD19–CD56+CD16+的固有淋巴樣細(xì)胞，其無(wú)需通過提前接觸或激活就能發(fā)揮腫瘤殺傷能力，某些腫瘤表面表達(dá)非MHC Ⅰ類配體分子的殺傷活化受體如NKG2D同源二聚體和自然細(xì)胞毒性受體，NK細(xì)胞表面識(shí)別這些受體選擇性攻擊腫瘤細(xì)胞。NK細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷機(jī)制和CD8+細(xì)胞毒T細(xì)胞類似。

M1巨噬細(xì)胞：巨噬細(xì)胞是一種位于組織內(nèi)的白細(xì)胞。激活的M1巨噬細(xì)胞具有促炎和殺傷腫瘤的功能，并分泌TH1細(xì)胞因子，如IL-12和TNF-α，以及少量的IL-10和IL-4[7]。

DC：DC是體內(nèi)功能最強(qiáng)的專職性抗原遞呈細(xì)胞，其最重要的功能是加工和提呈抗原，從而激活初始T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞。DC還能夠分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞的功能，如DC分泌大量IL-12誘導(dǎo)初始T細(xì)胞分化為Th1，產(chǎn)生Th1型免疫應(yīng)答。

1.1.2 具有負(fù)向調(diào)節(jié)作用的免疫細(xì)胞

CD4+Th2：Th2主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10及IL-13等，抑制體內(nèi)抗腫瘤免疫反應(yīng)。研究表明腫瘤間質(zhì)浸潤(rùn)的Th2細(xì)胞數(shù)量明顯高于Th1細(xì)胞數(shù)量，導(dǎo)致Th1/Th2漂移，產(chǎn)生的免疫抑制狀態(tài)會(huì)嚴(yán)重影響機(jī)體的抗腫瘤免疫，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[8]。

M2巨噬細(xì)胞：巨噬細(xì)胞具有可塑性，TME中M1巨噬細(xì)胞往往可轉(zhuǎn)變?yōu)镸2巨噬細(xì)胞表型，但這一機(jī)制尚不清楚。M2巨噬細(xì)胞表達(dá)CD163、CD206及CD204等標(biāo)志物，并分泌Th2型細(xì)胞因子，具有較低的抗原提呈能力以及促進(jìn)血管生成等，具有抑制免疫應(yīng)答的能力[7]。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞：典型的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是來(lái)源于胸腺的CD4+CD25+FOXP3+T細(xì)胞 (Treg細(xì)胞)，Treg細(xì)胞在抑制腫瘤相關(guān)抗原特異性免疫中發(fā)揮重要作用，它會(huì)抑制腫瘤引流淋巴結(jié)中的腫瘤相關(guān)抗原特異性激活，并進(jìn)一步聚集到TME中，抑制效應(yīng)細(xì)胞或效應(yīng)分子的功能。目前Treg細(xì)胞發(fā)揮抑制作用的機(jī)理主要有4種：①分泌IL-35、IL-10和TGF-β等可溶性負(fù)性免疫分子發(fā)揮免疫抑制作用；②高表達(dá)IL-2的高親和受體，競(jìng)爭(zhēng)性掠奪鄰近活化T細(xì)胞生存所需的IL-2，導(dǎo)致T細(xì)胞的增殖抑制和凋亡；③通過顆粒酶A、顆粒酶B以穿孔素依賴方式使CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞和NK細(xì)胞等凋亡；④通過表達(dá)CTLA-4等膜分子和分泌IL-35等分子抑制DC成熟和削弱其抗原提呈功能，并促進(jìn)抑制性DC產(chǎn)生。

1.2 TILs對(duì)腫瘤的預(yù)后評(píng)估作用

臨床預(yù)后指標(biāo)可以幫助評(píng)估每一例患者的腫瘤復(fù)發(fā)和術(shù)后生存情況，大量研究證明TILs的密度、亞型和浸潤(rùn)位置在多種腫瘤如結(jié)直腸癌、乳腺癌、黑色素瘤等的預(yù)后判斷中占主導(dǎo)地位。且T細(xì)胞在多種實(shí)體瘤中具有很強(qiáng)的預(yù)后價(jià)值[9-14](表1)。腫瘤浸潤(rùn)T淋巴細(xì)胞是免疫治療過程中最重要的效應(yīng)細(xì)胞類型，其主要包括以下亞型：CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞、CD4+T輔助淋巴細(xì)胞 (Th)、CD45RO+記憶T細(xì)胞 (Tm) 和FOXP3+調(diào)節(jié)細(xì)胞 (Tregs) 等。其中CD8+T淋巴細(xì)胞在抗腫瘤免疫中起到核心作用[15]。

同時(shí)研究者提出運(yùn)用免疫評(píng)分分期系統(tǒng)來(lái)預(yù)測(cè)腫瘤患者的生存周期，他們發(fā)現(xiàn)，通過一系列免疫評(píng)分分期和TNM分期的對(duì)比，顯示免疫評(píng)分對(duì)于預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌患者的生存周期具有明顯的優(yōu)勢(shì)，結(jié)直腸癌TILs的類型及密度是影響患者生存預(yù)后的主要因素，提示“免疫評(píng)分”在預(yù)測(cè)腫瘤患者生存預(yù)后方面，是一個(gè)更加優(yōu)越的分期系 統(tǒng)[10,16]。這些研究也奠定了“免疫評(píng)分”技術(shù)的基礎(chǔ)。2013年Galon等提出了一種圖像分析輔助評(píng)分系統(tǒng)，命名為“免疫評(píng)分”，其是通過檢測(cè)腫瘤核心部位和腫瘤邊緣侵犯部位浸潤(rùn)的CD3/CD45RO、CD3/CD8或CD8/CD45RO淋巴細(xì)胞群，并基于免疫細(xì)胞的類型、數(shù)量和位置3個(gè)方面作出評(píng)分的方法[9,17]。免疫評(píng)分反映了TME的復(fù)雜性和動(dòng)態(tài)性，讓我們了解即使在同一腫瘤中，不同部位的免疫細(xì)胞也是動(dòng)態(tài)變化的。因此運(yùn)用免疫評(píng)分技術(shù)有利于針對(duì)不同病例選擇合理的個(gè)性化治療方案，防止過度治療和不恰當(dāng)治療，對(duì)評(píng)價(jià)患者的預(yù)后具有重要作用。

表1 腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞與實(shí)體瘤預(yù)后的相關(guān)性

TS: tumor stromal; TN: tumor nest; PT: peritumoral; IM: invasive margin; IN: intraepithelial; NSCLC: non-small cell lung cancer; HCC: hepatocellular carcinoma; CRCLM: colorectal cancer liver metastasis; ESCC: esophageal squamous cell carcinoma; TNBC: triple negative breast cancer.

1.3 TILs介導(dǎo)的腫瘤免疫療法

早在1988年，有研究報(bào)道TILs在多種晚期惡性腫瘤中參與積極的作用[18]，提示免疫細(xì)胞的抗腫瘤效果。目前實(shí)體瘤的治療手段主要有手術(shù)切除、化療、放療及靶向藥物治療，但這些方法不能夠完全清除病灶，尤其是晚期實(shí)體瘤治療顯得相當(dāng)困難。近年來(lái)，腫瘤免疫療法蓬勃發(fā)展，為實(shí)體瘤治療帶來(lái)了新的機(jī)遇。免疫治療是一種通過增強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能達(dá)到對(duì)抗腫瘤的治療方式，其中免疫細(xì)胞在抗腫瘤免疫中發(fā)揮著重要作用。免疫治療因其療效顯著、毒副作用小、耐藥性低而備受關(guān)注。腫瘤免疫療法的核心思想認(rèn)為：腫瘤的發(fā)生是由于自身免疫系統(tǒng)被抑制，造成癌細(xì)胞不能被清除；只要將內(nèi)源自身免疫抑制解除 (免疫檢查點(diǎn)抑制劑) 或者外源補(bǔ)充不會(huì)被抑制的免疫細(xì)胞 (過繼免疫療法)，就可能治療甚至治愈癌癥。

過繼免疫療法 (Adoptive immunotherapy，AIT) 主要包括TILs、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(Cytokine-induced killer，CIK)、DC、NK細(xì)胞、T細(xì)胞受體嵌合型T細(xì)胞 (T-cell receptor-T cell，TCR-T) 和嵌合性抗原受體T細(xì)胞 (Chimeric antigen receptor T cell，CAR-T) 免疫療法幾大類，具體內(nèi)容如下。

1.3.1自體TILs過繼免疫療法

DC-CIK過繼免疫療法：CIK細(xì)胞是自然殺傷T淋巴 (NKT) 細(xì)胞的一類，表達(dá)CD3和CD56標(biāo)志物，與其他報(bào)道的抗腫瘤細(xì)胞相比，在體外具有快速增殖、更強(qiáng)的抗腫瘤反應(yīng)和低毒性等特點(diǎn)。近年來(lái)CIK細(xì)胞已被用于過繼免疫療法，但CIK細(xì)胞治療的臨床試驗(yàn)未顯示出治愈率或長(zhǎng)期生存率方面的顯著改善，因此需要進(jìn)一步改善此療法[19]。DC細(xì)胞可以克服腫瘤相關(guān)抑制作用并提高CIK細(xì)胞的活性[20]。因此將DC和CIK結(jié)合可顯著增強(qiáng)抗腫瘤效力[21]。

TILs過繼免疫療法：基于TILs的過繼性細(xì)胞治療是將浸潤(rùn)在腫瘤周圍的淋巴細(xì)胞分離，加入IL-2經(jīng)體外培養(yǎng)、活化和擴(kuò)增后回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，從而發(fā)揮殺傷腫瘤的作用。過繼治療需要回輸?shù)募?xì)胞數(shù)量高達(dá)1×1011。自從1986年Rosenberg利用TILs對(duì)荷瘤小鼠進(jìn)行治療并發(fā)現(xiàn)其療效是淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞的50–100倍后[22]，TILs成為抗腫瘤研究的熱點(diǎn)之一，并且在黑色素瘤的治療中顯示良好的療效[23-24]。

NK細(xì)胞過繼免疫療法：NK過繼免疫治療包括同種異體和自體NK的過繼治療，適用于免疫力低下的病人。自體NK細(xì)胞KIRs受體和MCH-Ⅰ配體結(jié)合能抑制NK細(xì)胞的活化，而同種異體NK細(xì)胞KIRs受體和MCH-Ⅰ配體不匹配，故打破了這種限制，有效活化NK細(xì)胞，啟動(dòng)抗腫瘤反 應(yīng)[25]。過繼的NK細(xì)胞與DC相互作用，產(chǎn)生的INF-γ能有效刺激Th1輔助細(xì)胞，從而進(jìn)一步增強(qiáng)T細(xì)胞抗腫瘤免疫反應(yīng)。同時(shí)，腫瘤致敏的NK細(xì)胞分泌IFN-γ能增加腫瘤細(xì)胞MHC-Ⅰ分子的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的特異性識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞[26]。NK細(xì)胞過繼治療腫瘤如乳腺癌、小細(xì)胞肺癌等，都顯示出其有效性和安全性[27-28]。

1.3.2 基因修飾的過繼免疫療法

在許多情況下，運(yùn)用自體細(xì)胞過繼療法策略存在一些不足之處，如在腫瘤組織中沒有足夠的活檢原料，或沒有足夠的浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞。為了克服這些不足，可以采用基因修飾的策略賦予效應(yīng)細(xì)胞特異性，拓寬AIT對(duì)其他癌癥的影響。目前基因修飾的抗腫瘤T細(xì)胞應(yīng)用最為廣泛，且療效顯著，主要包括以下兩種策略。

(1) CAR-T細(xì)胞免疫療法

CAR-T細(xì)胞是指經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)嵌合抗原受體 (Chimeric antigen receptor，CAR) 的T細(xì)胞，CAR由4部分構(gòu)成，即細(xì)胞單鏈抗體區(qū) (Single- chain antibody fragment)、跨膜結(jié)構(gòu)域、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo) (通常是CD3ζ鏈) 和協(xié)同刺激信號(hào)域 (CD28、41BB、OX40等)。目前CD19-CAR-T在復(fù)發(fā)或難治性急性淋巴細(xì)胞白血病獲得空前成功[29]。2017年被稱為“CAR-T”元年，復(fù)星凱特生物科技有限公司的Yescarta和瑞士諾華公司的Kymriah被批準(zhǔn)上市。但是CAR-T在實(shí)體瘤治療中并不像血液腫瘤一樣順利，在實(shí)體瘤中療效并不顯著并伴隨嚴(yán)重的副作用，臨床應(yīng)用極為受限。因此要積極開發(fā)針對(duì)實(shí)體瘤的免疫治療策略，目前主要有：①增加CAR-T細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)和浸潤(rùn)：構(gòu)建FAP-CAR-T減少腫瘤成纖維細(xì)胞的數(shù)量或使CAR-T表達(dá)趨化因子受體以達(dá)到腫瘤部位。②解除腫瘤抑制性微環(huán)境：將CAR-T與免疫抑制劑聯(lián)用如抗TGF-β、PD-1或PD-L1等抗體聯(lián)用。③提高治療的特異性和安全性如引入串聯(lián)基因等[30]。

因此今后聯(lián)合治療，尋找特異性靶點(diǎn)及構(gòu)建通用型的CAR是CAR-T療法未來(lái)的發(fā)展方向。

(2) TCR-T細(xì)胞免疫療法

TCR-T細(xì)胞免疫療法是將能識(shí)別腫瘤特異性抗原的TCRα和β鏈基因轉(zhuǎn)染到T細(xì)胞中，使T細(xì)胞的TCR抗原結(jié)合區(qū)發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，從而能特異性識(shí)別相應(yīng)的腫瘤抗原。然后經(jīng)體外擴(kuò)增并回輸?shù)饺梭w內(nèi)，表達(dá)特異性TCR的T淋巴細(xì)胞可識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面的HLA-肽復(fù)合物，并通過磷酸化胞內(nèi)區(qū)免疫受體酪氨酸激活基序，來(lái)傳遞抗原刺激信號(hào)，進(jìn)而引發(fā)T細(xì)胞的免疫效應(yīng)，達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的[29,31]。目前，TCR-T細(xì)胞免疫療法在黑素瘤中的臨床研究最多且療效顯著[32]。TCR-T細(xì)胞免疫療法在其他實(shí)體腫瘤例如宮頸癌、結(jié)直腸癌和乳腺癌等中也均有一些嘗試性研究，但其治療效果尚待進(jìn)一步臨床驗(yàn)證。

以上療法均是將來(lái)自患者腫瘤組織、外周血或引流淋巴結(jié)中的淋巴細(xì)胞在體外修飾、擴(kuò)增，最后回輸至患者的療法，與其他抗體或靶向藥物不同，擴(kuò)增后的細(xì)胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)后將激活并繼續(xù)增殖，可以形成持續(xù)的殺傷力。AIT已在多種實(shí)體瘤中取得了積極的臨床效果 (表2)。但是，AIT在臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)出的毒副作用仍然是一個(gè)不可忽視的問題。最常見的毒副作用是細(xì)胞因子風(fēng)暴 (Cytokine release syndrome，CRS)，CRS指的是由于T細(xì)胞增殖和激活，導(dǎo)致細(xì)胞因子大量釋放，引起患者發(fā)燒、低血壓、心功能障礙、腎功能衰竭、甚至死亡[33]。此外，AIT還會(huì)出現(xiàn)脫靶毒性，即T細(xì)胞能夠識(shí)別表達(dá)在正常細(xì)胞上的微量抗原。因此除了靶向表達(dá)該抗原腫瘤細(xì)胞外，還會(huì)攻擊表達(dá)相應(yīng)抗原的正常細(xì)胞，損傷其他正常組織和器官的功能[23]。為了減輕以上的毒副作用，研究者們開發(fā)出一系列的管理策略：①目前，大多數(shù)CRS毒性可通過升壓藥，供氧支持，皮質(zhì)類固醇和IL-6受體拮抗劑等方法來(lái)控制和治療[34]。②針對(duì)ACT存在的脫靶毒性，可以構(gòu)建SynNotch、iCAR、引入自殺基因或小分子開關(guān)的策略來(lái)實(shí)現(xiàn)更特異和更安全地靶向腫瘤細(xì)胞[35-36]。下面將對(duì)不同實(shí)體瘤中TILs的研究進(jìn)展逐一展開敘述。

表2 實(shí)體瘤中腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的臨床治療

TRMT: tumor-reactive memory T cells.

2 TILs與肺癌

2.1 TILs在肺癌預(yù)后評(píng)估中的作用

肺癌是全球癌癥發(fā)病率和死亡率最高的癌癥，在美國(guó)1/4的癌癥死亡是由肺癌引起的[37]。Kim等發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是吸煙人群，還是非吸煙人群，與未接觸二手煙人群相比，二手煙暴露者肺癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加[38]。最近，ShibliShibli等通過對(duì)335個(gè)肺癌組織切除的微陣列研究發(fā)現(xiàn)，單變量分析中腫瘤基質(zhì) (=0.001) 和上皮區(qū)域 (=0.004) 中CD3+細(xì)胞的浸潤(rùn)能夠顯著延長(zhǎng)患者腫瘤特異性生存率 (Cancer-specific survival，CSS)。在多變量分析中，腫瘤基質(zhì)中CD3+細(xì)胞是CSS (=0.005)的獨(dú)立預(yù)后因素。CD3+T細(xì)胞的浸潤(rùn)與非小細(xì)胞肺癌 (Non-small cell lung cancer，NSCLC) 中改善的臨床結(jié)果相關(guān)。但在此項(xiàng)研究中，漿細(xì)胞和肥大細(xì)胞均與預(yù)后無(wú)關(guān)[39]。在另一項(xiàng)研究中，Yin等通過Meta分析研究中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比率與肺癌預(yù)后的相關(guān)性，結(jié)果表明中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比率越高，NSCLC患者的總生存期 (Overall survival，OS) 越差 (=0.001)[40]。Geng等通過對(duì)8 600名患者的Meta分析顯示，腫瘤基質(zhì)或瘤內(nèi)中高水平的CD8+T細(xì)胞和CD3+T細(xì)胞浸潤(rùn)與肺癌患者更好的OS相關(guān)。腫瘤基質(zhì)中高水平CD4+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)在肺癌患者中表現(xiàn)出更好的OS。而腫瘤基質(zhì)中高密度的FOXP3+細(xì)胞浸潤(rùn)與患者更差的無(wú)進(jìn)展生存期 (Progression-free survival，PFS) 有關(guān)，認(rèn)為是預(yù)后不利的因素[41]。這表明TILs不僅具有明確的免疫功能，還具有預(yù)后作用。

2.2 TILs在肺癌中的臨床治療

TILs的臨床應(yīng)用開始于20世紀(jì)80年代中后期，AIT是繼LAK療法之后又一新的殺傷自體瘤細(xì)胞的免疫治療方法。Kradin等用TILs對(duì)6例原發(fā)性肺腺癌患者進(jìn)行多次5.0×108–4.5×109TILs靜脈輸注或瘤灶內(nèi)注入，在無(wú)白介素-2 (Interleukin-2，IL-2) 和環(huán)磷酰胺的情況下，其中4例腫瘤消退且患者有較好的耐受性；他們還對(duì)常規(guī)療法治療無(wú)效的轉(zhuǎn)移性肺癌和轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌等7例患者采用特異性TILs進(jìn)行治療，也獲得較好的療效[42]。Ratto等利用AIT并結(jié)合放射性療法治療113例NSCLC，TILs在術(shù)后6–8周靜脈回輸給患者，數(shù)量為4×109–7×1010，前兩周劑量逐漸上升，后兩周逐漸下降，持續(xù)回輸2–3個(gè)月。結(jié)果表明，對(duì)Ⅱ期NSCLC，AIT治療與對(duì)照組(無(wú)輔助治療)平均生存期分別為22.3個(gè)月和31個(gè)月。對(duì)ⅢA期NSCLC，AIT組OS顯著高于常規(guī)治療組(化療加放療) (=0.06)，平均生存期分別為22個(gè)月和9.9個(gè)月。對(duì)Ⅲ B期患者，AIT組OS顯著高于常規(guī)治療組(<0.01)，平均生存期分別為23.9個(gè)月和7.3個(gè)月。治療期間，AIT組生存率無(wú)明顯變化，而對(duì)照組中不少患者死于復(fù)發(fā)[43]。超過80%的患者未出現(xiàn)嚴(yán)重的毒副作用，因此AIT在未來(lái)可以作為NSCLC輔助治療方案。Kradin等也開展了TILs臨床應(yīng)用研究，他們對(duì)7名患有肺轉(zhuǎn)移性腺癌的患者給予T淋巴細(xì)胞回輸治療，發(fā)現(xiàn)有5名患者的腫瘤減小，但沒有患者達(dá)到完全或部分緩解；3名患者出現(xiàn)皮膚遲發(fā)性超敏反應(yīng)。因此得出結(jié)論，腫瘤浸潤(rùn)T淋巴細(xì)胞可以安全地輸注到人體中，并且可能會(huì)增強(qiáng)免疫反應(yīng)并介導(dǎo)體內(nèi)腫瘤的減小[44]。國(guó)內(nèi)也有學(xué)者展開了相應(yīng)的研究，李東復(fù)等對(duì)7例肺癌患者行TILs回輸免疫治療，結(jié)果大部分患者的狀態(tài)明顯改善，免疫功能增強(qiáng)，除有輕度發(fā)熱及1例血壓下降外，無(wú)其他明顯副作用[45]。

TILs臨床初步應(yīng)用表明，機(jī)體能夠耐受一定劑量的TILs，且副作用少；IL-2對(duì)TILs發(fā)揮體內(nèi)殺瘤效應(yīng)有協(xié)同作用；環(huán)磷酰胺能顯著增強(qiáng)TILs的體內(nèi)抗瘤活性，但TILs體外活性與體內(nèi)效應(yīng)并非總是一致。

3 TILs與肝癌

3.1 TILs在肝癌預(yù)后評(píng)估中的作用

原發(fā)性肝癌包括膽管細(xì)胞癌，亦有混合性腫瘤的情況，但是臨床上主要以肝細(xì)胞肝癌 (Hepatocellular carcinoma，HCC) 最為常見。大量臨床研究發(fā)現(xiàn)，TILs的水平與HCC的預(yù)后顯著相關(guān)。Cai等發(fā)現(xiàn)肝癌瘤內(nèi)DC的高浸潤(rùn)度提示較高的無(wú)病存活時(shí)間 (Disease-free survival，DFS)，瘤內(nèi)CD45+細(xì)胞 (=0.003)、CD3+T細(xì)胞 (=0.005) 及CD8+T細(xì)胞 (=0.037) 浸潤(rùn)均與延長(zhǎng)的DFS密切相關(guān)[46]。Th17細(xì)胞主要效應(yīng)因子是IL-17，Th17細(xì)胞具有強(qiáng)烈的促炎作用，在炎癥和自身免疫性疾病中起著積極的作用。Zhang等通過對(duì)178例HCC患者采用流式細(xì)胞術(shù)和免疫組化法測(cè)定腫瘤內(nèi)產(chǎn)生IL-17細(xì)胞的分布和表型特征，結(jié)果表明Th17細(xì)胞在HCC患者腫瘤中富集 (<0.001)。大多數(shù)腫瘤內(nèi)Th17細(xì)胞表現(xiàn)出效應(yīng)記憶表型，其中CCR4和CCR6的表達(dá)增加。腫瘤內(nèi)產(chǎn)生IL-17細(xì)胞的密度與HCC患者的OS (=0.001) 和DFS (=0.001) 顯著相關(guān)，瘤內(nèi)產(chǎn)生IL-17的細(xì)胞密度的增加預(yù)示著不良預(yù)后。多變量Cox分析顯示腫瘤內(nèi)產(chǎn)生IL-17細(xì)胞的密度是OS (=0.009) 和DFS (=0.002) 的獨(dú)立預(yù)后因素[47]。

在更深入的研究中，Wang等在對(duì)249名結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者的肝轉(zhuǎn)移分析中，通過對(duì)瘤內(nèi)和癌周區(qū)域中CD3+和CD8+T細(xì)胞進(jìn)行免疫評(píng)分發(fā)現(xiàn)，免疫評(píng)分高 (>2) 組相對(duì)于免疫評(píng)分較低組 (≤2)，其無(wú)復(fù)發(fā)生存率 (Relapse-free survival，RFS) (<0.001) 和OS (<0.001) 均顯著延長(zhǎng)，免疫評(píng)分高組RFS中位數(shù)為21.4個(gè)月，OS未達(dá)到終點(diǎn)；免疫評(píng)分低組RFS中位數(shù)為8.7個(gè)月，OS中位數(shù)為28.7個(gè)月。因此，肝轉(zhuǎn)移的TILs可用于預(yù)測(cè)肝切除術(shù)后結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后[48]。另外，來(lái)自46項(xiàng)研究涉及7 905名HCC患者的Meta分析顯示，瘤內(nèi)FOXP3+TILs的密度是最重要的預(yù)后因子 (<0?.001)。其密度越高，HCC患者的預(yù)后越差；瘤內(nèi)或癌周CD8+TILs浸潤(rùn)的患者OS明顯延長(zhǎng) (=0.001)；顆粒酶B表達(dá)為陽(yáng)性的T淋巴細(xì)胞在瘤內(nèi)的浸潤(rùn)與更好的OS (<0?.001) 和DFS (

3.2 TILs在肝癌中的臨床治療

肝癌具有惡性程度高、死亡率高、進(jìn)展快、復(fù)發(fā)快、轉(zhuǎn)移快的特點(diǎn)，HCC占肝癌病例的絕大部分，術(shù)后HCC患者的五年復(fù)發(fā)率高達(dá)70%[50]。Pan等在對(duì)410例HCC患者研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過CIK免疫治療的患者OS顯著高于單純手術(shù)組 (=0.000 7)。接受≥8周期CIK細(xì)胞輸注的患者的生存率明顯高于<8周期組 (=0.027 2)，因此CIK細(xì)胞輸注術(shù)后免疫治療可能是改善HCC患者預(yù)后的有效輔助治療方法[51]。在另一項(xiàng)Ⅰ期臨床實(shí)驗(yàn)研究中，15名HCC患者在腫瘤切除后，用其活化和擴(kuò)增的TILs進(jìn)行治療。在過繼治療后觀察到T細(xì)胞的數(shù)量瞬時(shí)增加，患者的不良反應(yīng)主要為輕度流感樣癥狀。中位隨訪14個(gè)月后，15名患者 (100%) 存活；12名患者 (80%) 未發(fā)現(xiàn)疾病跡象，僅有3名患者腫瘤復(fù)發(fā)[52]。這些結(jié)果表明，用激活并擴(kuò)增的自體TILs進(jìn)行免疫治療具有安全性和有效性的特點(diǎn)，因此可以作為HCC患者的新型治療方式。

4 TILs與胃癌

4.1 TILs在胃癌預(yù)后評(píng)估中的作用

胃癌在不同地理和人群中的發(fā)病率存在很大差異，韓國(guó)、日本、我國(guó)等東亞國(guó)家胃癌發(fā)病率和死亡率明顯高于北美、西歐及非洲地區(qū)的國(guó)家[53]。全國(guó)腫瘤登記中心數(shù)據(jù)顯示，2015年我國(guó)胃癌新發(fā)病例約為67.9萬(wàn)例，胃癌死亡病例約為49.8萬(wàn)例，嚴(yán)重危害我國(guó)居民健康[54]。微衛(wèi)星序列是短串聯(lián)重復(fù)序列，是單個(gè)堿基或堿基片段(1–6個(gè)堿基) 的重復(fù)序列 (通常重復(fù)次數(shù)在10到60次)，他們分散在基因的編碼區(qū)或非編碼區(qū)。錯(cuò)配修復(fù)蛋白是一組核酶，在DNA復(fù)制完成后發(fā)揮作用，錯(cuò)配修復(fù)蛋白沿DNA鏈滑動(dòng)，當(dāng)遇到基因錯(cuò)配時(shí)便進(jìn)行修復(fù)。如果缺乏DNA錯(cuò)配堿基修復(fù)酶，導(dǎo)致復(fù)制錯(cuò)誤DNA的堆積在增生的細(xì)胞中不能被修復(fù)，易誘發(fā)腫瘤。錯(cuò)配修復(fù)缺失會(huì)引起基因組中累積重復(fù)幾十到上百次的核酸堿基短序列的異常，稱為MSI，與之相對(duì)應(yīng)的是MSS[55]。在結(jié)直腸癌研究中，MSI高頻型 (MSI-H) 患者預(yù)后較MSI低頻型 (MSI-L) 和MSS患者好，其5年OS率和DFS率顯著高于MSI-L和MSS患者。Kim等進(jìn)一步研究了99例MSI-H胃癌患者中的瘤內(nèi)CD8+和FoxP3+TILs對(duì)患者預(yù)后的影響，研究表明高密度CD8+或FoxP3+TILs的浸潤(rùn)比低密度CD8+或FoxP3+TILs的胃癌患者具有更高的總存活率 (分別為0.017和0.013)；在多變量生存分析中，CD8+和FoxP3+TILs同時(shí)高度浸潤(rùn)與良好的預(yù)后相關(guān) (=0.003)，因此CD8+和FoxP3+TILs可共同作為MSI-H胃癌患者的獨(dú)立預(yù)后因子[56]。另外一項(xiàng)涉及4 942名胃癌患者的Meta分析顯示，瘤內(nèi)CD8+和CD3+T細(xì)胞的高度浸潤(rùn)與延長(zhǎng)的OS顯著相關(guān)[57]。

由此看出FoxP3+Tregs在不同癌癥中的作用有所不同，在胃癌中與良好的預(yù)后有關(guān)，但在肺癌中與更差的預(yù)后相關(guān)。

4.2 TILs在胃癌中的臨床治療

AIT雖然在胃癌治療中得到了廣泛的應(yīng)用，但是臨床治療當(dāng)中仍然存在著很多問題，如對(duì)胃癌患者的治療中仍存在著靶向性不足，腫瘤細(xì)胞免疫逃逸機(jī)制使其無(wú)法發(fā)揮殺傷作用等缺點(diǎn)。因此，如果要達(dá)到充分發(fā)揮免疫細(xì)胞的抗腫瘤作用，需要積極聯(lián)合其他手段增強(qiáng)其對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別能力，避免脫靶效應(yīng)。Peng等利用IL-15基因轉(zhuǎn)染CIK細(xì)胞后，提高了其增殖能力和腫瘤殺傷效果[58]。有隨機(jī)臨床Ⅱ期研究將CIK細(xì)胞、臍帶血來(lái)源的DC和化療3種方式聯(lián)合應(yīng)用于進(jìn)展期胃癌患者，顯著延長(zhǎng)了其無(wú)瘤生存期，治療過程中對(duì)患者無(wú)明顯的毒副作用[59]。由此可見，如果要達(dá)到充分發(fā)揮CIK細(xì)胞的抗腫瘤作用，需要積極聯(lián)合其他手段增強(qiáng)其對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別能力，避免脫靶效應(yīng)。

CAR-T免疫療法已成功應(yīng)用于多種血液系統(tǒng)惡性腫瘤[60-62]，此療法通過在T淋巴細(xì)胞膜直接表達(dá)腫瘤抗原的受體，使T淋巴細(xì)胞的激活不再依賴MHC分子就能激活相應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞，從而達(dá)到殺傷腫瘤的作用[63]。目前針對(duì)胃癌治療的CAR-T細(xì)胞治療仍在探索當(dāng)中，其主要難點(diǎn)在于腫瘤抗原的選擇。目前已有研究針對(duì)CEA、HER-2/neu、NKG2D等作為胃癌腫瘤抗原靶點(diǎn)設(shè)計(jì)了相應(yīng)的CAR[64-66]，但均以針對(duì)胃癌細(xì)胞株的體外實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)為主，部分項(xiàng)目啟動(dòng)了臨床入組計(jì)劃 (NCT02349724、NCT02416466)，大規(guī)模的臨床應(yīng)用研究尚未進(jìn)行，其探索的道路依舊漫長(zhǎng)。

5 TILs與食管癌

5.1 TILs在食管癌預(yù)后評(píng)估中的作用

2018年全球癌癥生存趨勢(shì)監(jiān)測(cè)計(jì)劃CON- CORD-3的研究結(jié)果顯示，近10年來(lái)我國(guó)食管癌生存率增長(zhǎng)了7%左右[67]。食管癌常見的類型為腺癌、鱗癌、肉瘤樣癌等，其中以食管鱗狀細(xì)胞癌最常見[68]。Chen等在對(duì)566例食管鱗狀細(xì)胞癌患者的研究表明，上皮內(nèi)CD4+T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)明顯高于腫瘤基質(zhì)區(qū) (<0.001)。上皮CD4+淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)與較長(zhǎng)的OS (=0.001) 顯著相關(guān)。CD3+和CD8+T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)均與食管鱗狀細(xì)胞癌患者的預(yù)后無(wú)關(guān) (>0.05)。因此上皮CD4+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)可能是食管鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的有利指標(biāo)[69]。另外一項(xiàng)涉及2 909名患者的Meta分析顯示總TILs是食管癌患者OS的有利預(yù)后指標(biāo) (<0.001)。對(duì)于TILs亞群，CD8+TILs與改善的OS (<0.001) 和DFS (<0.001) 相關(guān)；FoxP3+TILs的浸潤(rùn)與患者減少的DFS相關(guān) (=0.003)，CD57+TILs浸潤(rùn)預(yù)示患者的OS更好 (<0.001)。此外，其他TILs亞群包括CD3+、CD4+和CD45RO+TILs與患者的生存期無(wú)關(guān) (>0.05)[70]。因此，一些淋巴細(xì)胞可以作為食管癌預(yù)后的生物標(biāo)志物，但關(guān)于TILs在食管癌免疫治療中的應(yīng)用需要通過大量的臨床研究來(lái)驗(yàn)證。

5.2 TILs在食管癌中的臨床治療

食管癌的治療主要以手術(shù)治療為主，術(shù)后輔以放化療，但放化療對(duì)機(jī)體的免疫功能影響較大，中晚期食管癌治療的預(yù)后仍不樂觀。Fujiwara等從5例食管癌患者的外周血中分離了DC細(xì)胞并進(jìn)行體外培養(yǎng)，用111In標(biāo)記成熟的DC細(xì)胞，并注射到瘤體內(nèi)，再進(jìn)行根治性手術(shù)切除。結(jié)果顯示，注射到腫瘤組織內(nèi)部成熟的DC細(xì)胞并不能有效地向引流淋巴結(jié)遷移，無(wú)法獲得最佳的臨床反應(yīng)[71]。Toh等進(jìn)一步報(bào)道，將來(lái)自食管鱗狀細(xì)胞癌患者的PBMC在體外用自體腫瘤細(xì)胞刺激后，直接注射到原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移部位，同時(shí)給予靜脈注射IL-2。離體產(chǎn)生的自體腫瘤激活的淋巴細(xì)胞每2周共13次局部注射到患者鎖骨淋巴結(jié)，每次注射給藥細(xì)胞的平均數(shù)量為0.8×109個(gè)。在免疫治療期間，觀察到患者2級(jí)腹瀉和發(fā)燒，在所有病變中獲得臨床局部緩解并持續(xù)11個(gè)月。由于臨床毒性較小，因此這種免疫療法可能對(duì)轉(zhuǎn)移晚期食管癌患者有效[72]。針對(duì)食管癌的免疫治療目前多處于臨床研究階段，尚無(wú)成熟的藥物可應(yīng)用于臨床，需要更多的轉(zhuǎn)化研究進(jìn)行探索。

6 TILs與結(jié)直腸癌

6.1 TILs在結(jié)直腸癌預(yù)后評(píng)估中的作用

臨床上普遍采用TNM分期系統(tǒng)評(píng)估結(jié)直腸癌患者的預(yù)后。近年來(lái)，“免疫評(píng)分”技術(shù)逐漸成為研究熱點(diǎn)。1998年，Naito等運(yùn)用半定量方法分析了139例結(jié)直腸癌 (Colorectal cancer，CRC)患者，首次報(bào)道了瘤內(nèi)的CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)可能是其獨(dú)立的預(yù)后因素[73]。Salama等對(duì)967個(gè)Ⅱ期和Ⅲ期CRC病人研究發(fā)現(xiàn)，與正常結(jié)腸粘膜相比，腫瘤組織中的FOXP3+Tregs浸潤(rùn)更多，而CD8+和CD45RO+細(xì)胞浸潤(rùn)很少。FOXP3+Tregs的密度是CRC獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)，CD8+和CD45RO+細(xì)胞則與預(yù)后無(wú)關(guān)。正常粘膜中的FOXP3+Tregs的高度浸潤(rùn)與較差的預(yù)后相關(guān) (=0.019)。相反，腫瘤組織中FOXP3+Tregs的高度浸潤(rùn)與改善的存活率相關(guān) (=0.001)。因此，F(xiàn)OXP3+Tregs在CRC中具有強(qiáng)烈的預(yù)后意義[74]。

近日，一項(xiàng)涉及5 108名患者的Meta分析研究了TILs的亞群組成、位置對(duì)CRC患者的預(yù)后影響，結(jié)腸癌患者結(jié)果顯示，基于TILs細(xì)胞類型分析發(fā)現(xiàn)，CD8+和FOXP3+T淋巴細(xì)胞 (非CD3+T細(xì)胞) 與改善的DFS和OS有關(guān)；此外，關(guān)于TILs的位置研究顯示，只有在腫瘤基質(zhì)中FOXP3+T淋巴細(xì)胞的高度浸潤(rùn)與改善的OS顯著相關(guān) (=?0.000 7)，在腫瘤浸潤(rùn)邊緣中，CD3+T細(xì)胞高度浸潤(rùn)預(yù)示DFS增加 (=0.008)。瘤內(nèi)CD8+T細(xì)胞高度浸潤(rùn)與改善的DFS相關(guān) (<0.000 01)[75]。

總之，腫瘤組織中TILs的密度或亞型與延長(zhǎng)的存活率密切相關(guān)，此外，在特定的浸潤(rùn)部位僅有一些TILs亞型的高度浸潤(rùn)與良好的預(yù)后相關(guān)。仍需要進(jìn)一步的研究來(lái)驗(yàn)證TILs在CRC中的預(yù)后價(jià)值，以進(jìn)一步增加關(guān)于TILs的免疫評(píng)分和免疫療法的有效性。

6.2 TILs在結(jié)直腸癌中的臨床治療

目前，臨床針對(duì)結(jié)直腸癌的主要治療方式仍是手術(shù)治療，但是單純手術(shù)治療效果并不能達(dá)到預(yù)期，術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，且并發(fā)癥多。Takeshi等運(yùn)用NK細(xì)胞免疫療法與IgG1抗體聯(lián)合治療晚期胃癌或結(jié)腸直腸癌來(lái)觀察其有效性和安全性。施用IgG1抗體3 d后，每周向患者輸注擴(kuò)增的NK細(xì)胞3次，以0.5×109、1.0×109和2.0×109細(xì)胞的劑量逐漸遞增。結(jié)果表明，患者體內(nèi)富集NK細(xì)胞 (中位數(shù)92.9%) 且NKG2D (97.6%) 和CD16 (69.6%) 高表達(dá)。聯(lián)合治療結(jié)果顯示此療法耐受性良好，無(wú)嚴(yán)重不良事件。在6名可評(píng)估的患者中，4名呈現(xiàn)疾病穩(wěn)定，2名患者出現(xiàn)疾病進(jìn)展。在4名疾病穩(wěn)定患者中，3名患者腫瘤減小，血液中IFN-γ數(shù)量增加，Tregs減少?？傊@項(xiàng)Ⅰ期試驗(yàn)為先前接受過治療的晚期胃癌和CRC患者提供了有希望的治療方法[76]。DC聯(lián)合CIK是目前腫瘤免疫治療的重要組成部分。DC和CIK共同培養(yǎng)使CIK細(xì)胞溶瘤活性明顯加強(qiáng)，更具特異性殺死腫瘤靶細(xì)胞[77]。國(guó)內(nèi)也有研究探討了DC-CIK免疫療法聯(lián)合化療應(yīng)用于晚期CRC中的臨床療效。結(jié)果顯示，觀察組治療緩解率顯著優(yōu)于對(duì)照組 (＜0.05)[78]。翁海光等的研究也顯示相似的結(jié)果，并且DC-CIK組患者的Ⅲ–Ⅳ度不良反應(yīng)中，血白細(xì)胞下降的發(fā)生率為22.0% (11/50)，低于單純化療組 (<0.05)[79]。說明DC-CIK免疫療法聯(lián)合化療可顯著提高晚期CRC患者的臨床療效，延長(zhǎng)患者生存期，提高生存質(zhì)量。另外在Zhang等的研究中顯示，CAR-T細(xì)胞免疫療法對(duì)胚胎抗原陽(yáng)性結(jié)直腸患者有良好的耐受性，在10名患者中，兩名患者病情穩(wěn)定超過30周，且腫瘤縮?。唤邮芨邉┝緾AR-T療法的患者外周血中CAR-T細(xì)胞的持續(xù)存在，大多數(shù)患者的血清胚胎抗原水平下降明顯[80]。因此，AIT在CRC治療中具有較高的安全性和有效性，具有良好的應(yīng)用前景。

7 TILs與乳腺癌

7.1 TILs在乳腺癌預(yù)后評(píng)估中的作用

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著女性的健康。乳腺癌根據(jù)表達(dá)受體不同分為3個(gè)主要亞型：ER/PR陽(yáng)性型、HER2陽(yáng)性和三陰性乳腺癌 (Triple negative breast cancer，TNBC)。乳腺癌中TILs的數(shù)量是改善患者存活率的有利預(yù)后因素，尤其是在TNBC和HER2過表達(dá)的乳腺癌亞型中[81]。近期一項(xiàng)研究收集了2 148個(gè)患者樣本探究早期TNBC中TILs的預(yù)后價(jià)值，共觀察到736例侵襲性無(wú)病生存和548例無(wú)遠(yuǎn)端疾病生存事件以及533例死亡事件。在多變量模型中，腫瘤基質(zhì)TILs浸潤(rùn)程度的增加與延長(zhǎng)的侵襲性無(wú)病生存 (<0.001)，無(wú)遠(yuǎn)端疾病生存 (<0.001)和OS (<0.001)顯著相關(guān)。在腫瘤基質(zhì)中TILs≥30%的淋巴結(jié)陰性患者，患者3年侵襲性無(wú)病生存率為92%，無(wú)遠(yuǎn)端疾病生存為97%，總生存率為99%[82]。另外一項(xiàng)242例TNBC患者中發(fā)現(xiàn)，與T-bet-腫瘤患者相比，T-bet+腫瘤患者的OS更長(zhǎng) (=0.047)。與CD8+T-bet-腫瘤相比，CD8+和T-bet+的患者具有更好的RFS (=0.037) 和OS (=0.024)[83]。在更深入的研究中，Savas等對(duì)乳腺癌患者中6 311個(gè)T細(xì)胞進(jìn)行了scRNA-seq，結(jié)果顯示乳腺癌患者中含有高度浸潤(rùn)的組織駐留記憶 (Tissue-resident memory T cell，TRM) CD8+T細(xì)胞，并且這些CD8+TRM細(xì)胞表達(dá)高水平的免疫檢查點(diǎn)分子和效應(yīng)蛋白。CD8+TRM細(xì)胞與TNBC中患者存活率的改善顯著相關(guān)，并且比單獨(dú)的CD8+細(xì)胞具有更好的預(yù)后作用[84]。因此，TILs可作為乳腺癌預(yù)后因子。

7.2 TILs在乳腺癌中的臨床治療

TNBC患者具有較高的轉(zhuǎn)移和進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)，醫(yī)生會(huì)根據(jù)腫瘤的分期和患者的身體狀況，酌情采用手術(shù)、放療、化療、內(nèi)分泌治療、生物靶向治療及中醫(yī)藥輔助治療等多種手段。乳腺癌患者的骨髓中含有具有治療潛力的腫瘤反應(yīng)性記憶T細(xì)胞 (Tumor-reactive memory T cells，TC)，過繼性T細(xì)胞輸注會(huì)導(dǎo)致循環(huán)腫瘤抗原反應(yīng)性Ⅰ型TC的產(chǎn)生。Domschke等描述了16名轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的長(zhǎng)期臨床結(jié)果及其與腫瘤特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的相關(guān)性，TC在體外首先與自體DC細(xì)胞和MCF-7乳腺癌細(xì)胞的裂解物共培養(yǎng)從而激活，然后擴(kuò)大培養(yǎng)后輸注回患者體內(nèi)，結(jié)果顯示16名患者中有7名對(duì)治療有響應(yīng)，總隊(duì)列中觀察到總體中位生存期為33.8個(gè)月，其中3例患者在接受AIT治療后存活時(shí)間超過7年。轉(zhuǎn)移的腫瘤反應(yīng)性TC的數(shù)量與患者的總體存活率顯著相關(guān) (=0.017)。AIT治療后外周血具有免疫應(yīng)答的患者的中位生存期明顯長(zhǎng)于無(wú)應(yīng)答者 (中位生存期為58.6個(gè)月對(duì)13.6個(gè)月；=0.009)。AIT治療后產(chǎn)生免疫反應(yīng)的患者OS明顯延長(zhǎng)，此療法有良好的應(yīng)用前景[85]。乳腺癌中常表達(dá)細(xì)胞表面分子C-Met，因此Williams等設(shè)計(jì)了針對(duì)C-Met特異的CAR，進(jìn)行了0期臨床試驗(yàn) (NCT01837602)，以評(píng)估通過腫瘤內(nèi)使用RNA轉(zhuǎn)染的C-Met CAR-T細(xì)胞治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌的安全性和可行性。通過RNA轉(zhuǎn)染使CAR分子的瞬時(shí)表達(dá)限制靶標(biāo)/腫瘤外效應(yīng)來(lái)確保安全性。單次瘤內(nèi)注射量為3×107個(gè)或3×108個(gè)細(xì)胞。在瘤內(nèi)注射后不久，分別在2名和4名患者中檢測(cè)到外周血和腫瘤組織中的低水平CAR-T mRNA，患者均無(wú)細(xì)胞因子釋放綜合征或比研究藥物相關(guān)的1級(jí)更嚴(yán)重的不良事件。因此CAR-T療法在乳腺癌患者治療中具有良好的耐受性[86]。目前，AIT療法在乳腺癌中的研究還較少，仍需要大量臨床試驗(yàn)驗(yàn)證此療法的療效。

8 TILs與宮頸癌

8.1 TILs在宮頸癌預(yù)后評(píng)估中的作用

宮頸癌是威脅全球婦女健康及生命的主要惡性腫瘤之一，目前其發(fā)病率占女性惡性腫瘤第4位，人乳頭狀瘤病毒 (Human papillomavirus，HPV)感染是導(dǎo)致宮頸癌最為常見的因素之一[87]。Carus 等在對(duì)101名宮頸癌患者的研究中發(fā)現(xiàn)，在癌周和腫瘤基質(zhì)中CD66b+中性粒細(xì)胞和癌周CD163+巨噬細(xì)胞的高度浸潤(rùn)與短RFS顯著相關(guān)。多變量分析發(fā)現(xiàn)癌周中性粒細(xì)胞高度浸潤(rùn) (=0.03)，CD8+淋巴細(xì)胞低度浸潤(rùn) (=0.002)，可以作為短RFS的獨(dú)立預(yù)后因素，而CD163+巨噬細(xì)胞與預(yù)后無(wú)顯著相關(guān)性[88]。

Asuka等調(diào)查了148例宮頸癌患者，發(fā)現(xiàn)較高密度的腫瘤浸潤(rùn)性CD204+M2巨噬細(xì)胞與較短的DFS顯著相關(guān)，但CD4+、CD8+、FOXP3+、PD-1+淋巴細(xì)胞和CD68+巨噬細(xì)胞與預(yù)后無(wú)顯著相關(guān)性。且侵襲性腫瘤基質(zhì)中TILs和巨噬細(xì)胞的密度顯著高于原位腫瘤。表達(dá)p16的HPV陽(yáng)性腫瘤中TILs的密度顯著高于HPV陰性的腫瘤。因此腫瘤浸潤(rùn)性CD204+M2巨噬細(xì)胞是宮頸腺癌患者預(yù)后不良的因子[89]。

8.2 TILs在宮頸癌中的臨床治療

宮頸癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，不同地區(qū)之間存在著宮頸癌篩查手段及治療技術(shù)的差異，半數(shù)以上的患者就診時(shí)已處于中晚期。轉(zhuǎn)移性宮頸癌是一種典型的化療耐受型上皮惡性腫瘤，Stevanovi?等研究了AIT治療轉(zhuǎn)移性宮頸癌的療效，患者需之前接受過鉑類化療或放化療，再接受單次輸注腫瘤浸潤(rùn)性T細(xì)胞治療，結(jié)果顯示：9名患者中有3名對(duì)療法產(chǎn)生響應(yīng)，其中2例表現(xiàn)出持久緩解 (分別為22、15個(gè)月)[90]。另外，楊怡等用DC-CIK治療60例宮頸癌患者，結(jié)果顯示與治療前相比，患者的淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)量如CD3+、CD8+、CD56+、CD3+CD8+、CD3+CD56+較治療前顯著升高。顆粒酶B和穿孔素的表達(dá)量顯著上調(diào)；患者的KPS評(píng)分明顯改善(<0.01)，疼痛評(píng)分明顯降低(<0.05)，生活質(zhì)量提高；腫瘤標(biāo)志物SCCA和CA125明顯下降(<0.05)；沒有出現(xiàn)明顯的毒副反應(yīng)(<0.05)；臨床獲益率能夠達(dá)到80%[91]。因此，DC-CIK細(xì)胞免疫療法治療宮頸癌能使患者得到臨床獲益，對(duì)于促進(jìn)患者微小殘留病灶的清除以及防止腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等有一定意義。

9 總結(jié)與展望

TME是一個(gè)高度復(fù)雜且動(dòng)態(tài)變化的環(huán)境，TILs在不同實(shí)體瘤和不同臨床分期中有著不同程度的浸潤(rùn)，大量研究證實(shí)了通過檢測(cè)TILs的亞群組成、數(shù)量和區(qū)域分布情況對(duì)于實(shí)體瘤預(yù)后具有重要價(jià)值。

目前在不同實(shí)體瘤中T細(xì)胞的研究最多且研究體系較為成熟。且不論是在腫瘤基質(zhì)、瘤內(nèi)還是癌旁/周，CD45+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)大多與實(shí)體瘤良好的預(yù)后相關(guān)。FOXP3+TILs目前在不同腫瘤中的預(yù)后作用報(bào)道不一，比如結(jié)直腸癌和胃癌瘤內(nèi)FOXP3+TILs的浸潤(rùn)表明患者的預(yù)后良好，而在肝癌和食管癌的報(bào)道中，F(xiàn)OXP3+TILs在瘤內(nèi)的浸潤(rùn)顯示患者的預(yù)后更差；肺癌和結(jié)腸癌腫瘤基質(zhì)中FOXP3+TILs的浸潤(rùn)，表明患者具有更好的預(yù)后，而在結(jié)直腸癌癌周部位FOXP3+TILs的浸潤(rùn)則顯示更差的預(yù)后。因此FOXP3+TILs在實(shí)體瘤的預(yù)后作用仍有待進(jìn)一步探究。CD66+中性粒細(xì)胞和CD204+M2巨噬細(xì)胞在瘤內(nèi)浸潤(rùn)均與宮頸癌不良的預(yù)后相關(guān)。因此，多個(gè)指標(biāo)的聯(lián)合使用，用于預(yù)測(cè)腫瘤患者的預(yù)后是今后的發(fā)展方向。

不僅如此，抗腫瘤的TILs介導(dǎo)的過繼性免疫治療方法已在多種實(shí)體瘤中取得了良好的療效。TILs作為效應(yīng)細(xì)胞來(lái)自患者自體，其殺傷腫瘤細(xì)胞作用強(qiáng)。AIT通過增強(qiáng)實(shí)體瘤患者免疫系統(tǒng)的功能，使腫瘤縮小，患者病情穩(wěn)定時(shí)間可以超過數(shù)十周甚至更長(zhǎng)時(shí)間，因此AIT是治療實(shí)體瘤患者非常有前景的治療方法。但TILs在實(shí)體瘤臨床治療中仍然存在一些問題：①其治療對(duì)象有一定的限制。患者如果具有嚴(yán)重的自身免疫性疾病、臟器移植病史、哺乳期或妊娠期內(nèi)、對(duì)細(xì)胞因子過敏、罹患T淋巴細(xì)胞瘤等情況中的一種或幾種時(shí)，是不適于接受AIT的。②AIT過程中免疫活性細(xì)胞的制備、擴(kuò)增、回輸?shù)拳h(huán)節(jié)復(fù)雜，可能免疫效應(yīng)產(chǎn)生之前對(duì)治療效果發(fā)生顯著影響。目前不同種類免疫活性細(xì)胞的制備尚無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，不同研究單位選用的材料、方法不同，細(xì)胞擴(kuò)增后細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量無(wú)法保障，這也是當(dāng)前臨床試驗(yàn)需要解決的問題。③在不同腫瘤類型中，AIT還存在缺乏合適的腫瘤特異性靶標(biāo)的問題，尋找如EGFRvIII和CD19這樣的特異性靶點(diǎn)是提高AIT治療實(shí)體瘤有效性和安全性的重要手段。

綜上，TILs過繼治療與傳統(tǒng)治療 (如手術(shù)和放化療) 和新興療法 (免疫檢查點(diǎn)抑制劑和基因改造) 聯(lián)合是未來(lái)臨床治療的發(fā)展趨勢(shì)。不同腫瘤中TILs亞群及功能的進(jìn)一步研究鑒定，是開發(fā)腫瘤免疫治療新方法的基礎(chǔ)。

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Function of tumor infiltrating lymphocytes in solid tumors – a review

Suhang Bai, Xiaoyue Yang, Nan Zhang, Fuhan Zhang, Zongyi Shen, Na Yang, Wensai Zhang, Changyuan Yu, and Zhao Yang

,,100029,

Tumor is one of the major diseases threatening human health in the 21st century. Surgical resection, radiotherapy, chemotherapy and targeted therapy are the main clinical treatments for solid tumors. However, these methods are unable to eradicate tumor cells completely, and easily lead to the recurrence and progression of tumor. Tumor immunotherapy is a novel treatment that uses human immune system to control and kill tumor by enhancing or restoring anti-tumor immunity. Tumor immunotherapy has shown to produce long-lasting responses in large numbers of patients, and thereby adoptive immunotherapy and immune checkpoint inhibitors could induce remarkable antigen-specific immune responses. Tumor infiltrating lymphocytes (TILs) are highly heterogeneous lymphocytes existing in tumor tissues and play a crucial role in host antigen-specific tumor immune response. Recent studies show that TILs are closely related to the prognosis of patients during the processes of tumorigenesis and treatment. Adoptive immunotherapy mediated by TILs has displayed favorable curative effect in many solid tumors. This paper reviews the recent progress of TILs in solid tumors.

tumor infiltrating lymphocytes, solid tumors, immunotherapy, prognosis

July6, 2019;

October21, 2019

National Natural Science Foundation of China (No. 81602644), Basic Scientific Research Operating Expenses for Central Universities (No. buctrc201910), National Key Research and Development Program (No. 2017YFA0105900).

Zhao Yang. Tel: +86-10-64438058; E-mail: yangzhao@mail.buct.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 81602644)，中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)(No. buctrc201910)，國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(No. 2017YFA0105900)資助。

2019-11-11

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20191108.1111.001.html

白素杭, 楊曉悅, 張楠, 等. 腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞在實(shí)體腫瘤中作用的研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(12): 2308–2325.

Bai SH, Yang XY, Zhang N, et al. Function of tumor infiltrating lymphocytes in solid tumors – a review. Chin J Biotech, 2019, 35(12): 2308–2325.

(本文責(zé)編 郝麗芳)