魏琪瑤，徐晨晨，王美艷，葉海峰

生物工程與大健康

葉海峰 華東師范大學(xué)研究員、博士生導(dǎo)師。2007–2013年于瑞士蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院(ETH Zurich) 從事博士和博士后研究工作。2013年被授予ETH Zurich最高榮譽(yù)獎?wù)隆癊TH Silver Medal”。2014年入選國家“青年千人計劃”。2015年獲國家自然科學(xué)基金“優(yōu)青”項目資助。擔(dān)任中國生物工程學(xué)會合成生物學(xué)專業(yè)委員會委員、中國生物工程學(xué)會青年工作委員會委員、上海市生物工程學(xué)會第七屆理事會理事、上海市生物工程學(xué)會合成生物學(xué)專業(yè)委員會副主任委員。主要從事合成生物學(xué)與生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域的研究。主要研究內(nèi)容為光遺傳學(xué)與疾病治療、代謝疾病智能診療器件、腫瘤免疫治療智能診療器件、合成生物學(xué)與再生醫(yī)學(xué)。相關(guān)研究成果以第一或通訊作者身份發(fā)表在、(2篇封面)、、(2篇) 等期刊。申請發(fā)明專利10項。

光遺傳學(xué)工具的開發(fā)及其應(yīng)用研究

魏琪瑤，徐晨晨，王美艷，葉海峰

華東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 上海市調(diào)控生物學(xué)重點實驗室 華東師范大學(xué)醫(yī)學(xué)合成生物學(xué)研究中心，上海 200241

細(xì)胞所處微環(huán)境的動態(tài)變化對細(xì)胞分化、細(xì)胞信號通路、個體生長以及疾病等有很大影響。光遺傳學(xué)技術(shù)利用基因編碼蛋白質(zhì)表達(dá)并結(jié)合光控的手段為動態(tài)調(diào)控細(xì)胞信號通路、細(xì)胞定位和基因表達(dá)等方面提供了一種全新、無損、可逆、非侵入、時空特異性的研究手段。文中總結(jié)了光遺傳學(xué)元件的類型以及涉及的細(xì)胞信號通路，并探討了光控細(xì)胞信號通路的應(yīng)用與未來發(fā)展前景。

合成生物學(xué)，光遺傳學(xué)，光控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，光控基因開關(guān)，時空特異

細(xì)胞自身雖然會產(chǎn)生胞內(nèi)信號動態(tài)變化，但環(huán)境的動態(tài)變化使細(xì)胞接受刺激會隨著時間、空間變化作出響應(yīng)，從而影響胞內(nèi)信號的動態(tài)變化。觀察信號通路的動態(tài)變化對于信號通路研究有極大的幫助。經(jīng)典的信號通路研究常常通過基因的抑制/沉默或是過表達(dá)以觀察信號通路的變化[1]。但這樣的研究僅涉及單一條件下的調(diào)控，如不同基因表達(dá)調(diào)控直接導(dǎo)致的胞內(nèi)信號網(wǎng)絡(luò)改變的靜態(tài)結(jié)果，而無法研究目標(biāo)通路在時間或空間動態(tài)變化下的調(diào)控過程。此外，利用小分子藥物或蛋白配體進(jìn)行的調(diào)控由于擴(kuò)散困難以及脫敏效應(yīng)等原因而無法實現(xiàn)精確調(diào)控。相比之下，光控在時間、空間、強(qiáng)度各方面都具備極大優(yōu)勢。

光遺傳學(xué)元件的引入推動了人們對于光響應(yīng)蛋白的研究，它們一般來自植物、真菌、水母、珊瑚、細(xì)菌和藻類等[2-4]。光控研究最早在神經(jīng)科學(xué)中被應(yīng)用，被稱為光遺傳學(xué)。光遺傳學(xué)是指結(jié)合光學(xué)與遺傳學(xué)手段，精確控制特定神經(jīng)元活動的技術(shù)?？茖W(xué)家們將光敏蛋白通過基因融合引入細(xì)胞，利用光控系統(tǒng)調(diào)控神經(jīng)活動，在亞細(xì)胞水平定位蛋白活動，調(diào)控蛋白功能，促進(jìn)或抑制基因表達(dá)，或者誘導(dǎo)蛋白降解 (圖1)[5]。

然而，當(dāng)下光遺傳學(xué)的定義已經(jīng)有所擴(kuò)展，并不局限于神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域，科學(xué)家們可以利用和改造多種類型的光敏蛋白控制細(xì)胞的活動。光敏蛋白響應(yīng)特定波長的光，經(jīng)過一系列構(gòu)象改變、蛋白間可逆結(jié)合以及聚合反應(yīng)，驅(qū)動特異性生理反應(yīng)，包括 (去) 激活特異性蛋白活動、激活或抑制轉(zhuǎn)錄、亞細(xì)胞定位、局部活性氧生產(chǎn)和其他功能 (表1)。隨著光遺傳學(xué)研究的發(fā)展，科學(xué)家們在體外到體內(nèi)、細(xì)胞組織到動物個體或群體等不同水平引入改造的光控開關(guān)進(jìn)行研究，加深了對生物體微觀機(jī)理以及相應(yīng)生物功能的挖掘與理解，因此光遺傳學(xué)元件的研究將推動著生物學(xué)一系列領(lǐng)域的共同發(fā)展。

1 光遺傳學(xué)工具

近年來，光遺傳學(xué)工具被廣泛應(yīng)用于人工改造信號通路，成為細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中重要的調(diào)控元件。光控蛋白主要可分為兩大類：視蛋白依賴光受體(Opsin-based photoreceptor) 和光敏蛋白 (Photosensitive protein)。視蛋白 (Opsin) 是一種光敏跨膜蛋白，廣泛存在于各種生物中，根據(jù)其分布特點可分為Ⅰ型微生物類和Ⅱ型脊椎/非脊椎動物類[6]。光敏蛋白屬于非視蛋白依賴光遺傳學(xué)元件，其分子機(jī)制是通過吸收激發(fā)光的光子能量導(dǎo)致構(gòu)象變化或者促進(jìn)蛋白質(zhì)之間的互作與 重排[7]。

圖1 光遺傳學(xué)元件的工作示意圖

表1 光遺傳學(xué)元件的基本原理

Abbreviations: aa, amino acid; FAD, flavin adenine dinucleotide; FMN, flavin mononucleotide; λ, wavelength; Ta1/2, half-life of association; Td1/2, half-life of dissociation; *endogenous.

對光反應(yīng)蛋白新功能的擴(kuò)展將進(jìn)一步拓寬其應(yīng)用范圍。雖然最佳光反應(yīng)蛋白的設(shè)計取決于實際需求，但它們有一些共性特點：1) 易于被遺傳編碼和表達(dá)；2) 光響應(yīng)活性具有較大的動態(tài)變化范圍，且在黑暗條件下幾乎沒有或僅有較低的背景噪音；3) 對細(xì)胞內(nèi)源性蛋白功能和亞細(xì)胞定位造成的影響?。?) 光激活波長具備特異性和快速反應(yīng)性。根據(jù)不同作用機(jī)理，我們將光敏蛋白分為以下幾類。

1.1 光控二聚化系統(tǒng)

1.1.1 光敏色素

植物光敏色素是一類可響應(yīng)紅光調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的蛋白。在種子植物中有兩類光敏色素——Ⅰ型和Ⅱ型。目前在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)5種屬于Phy家族的蛋白 (PhyA–PhyE)[15]。其中光敏色素A (PhyA) 是唯一一種Ⅰ型光敏色素，其在光照條件下降解，在黑暗條件下積累[16]。區(qū)別于其他紅光激活的Ⅱ型Phy蛋白，PhyA在716–720 nm遠(yuǎn)紅光條件下被激活，并在與遠(yuǎn)紅光受體伴侶蛋白FHY1 (Far-red elongated hypocotyl1) 或FHL蛋白 (FHY-LIKE) 相互作用下轉(zhuǎn)運入核[17]；在紅光條件下，核內(nèi)的重組蛋白解聚，PhA被重新循環(huán)至胞漿[18](圖1A)。

在Ⅱ型光敏色素中，紅光是最有效的響應(yīng)觸發(fā)光，其工作機(jī)理已被深入研究且被廣泛應(yīng)用于合成生物學(xué)領(lǐng)域。以光敏色素B (PhyB) 為例，其包含兩個主要的結(jié)構(gòu)域：N端光吸收結(jié)構(gòu)域和C端效應(yīng)結(jié)構(gòu)域[19]。光敏色素二聚系統(tǒng)的局限在于Phy的發(fā)色團(tuán)PCB不能在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)自然合成[20]，需要外源引入。但與PhyA不同的是，PhyB通過結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子PIF或自身核定位信號入核，不需要運輸?shù)鞍?。在紅光照射下PCB介導(dǎo)PhyB可逆構(gòu)象變化從而結(jié)合光敏色素互作因子PIF (圖1A)。同時在遠(yuǎn)紅光 (760 nm) 照射下可以抑制PhyB與PIF的結(jié)合[21]。

光敏色素不僅存在于植物中，近年來科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)細(xì)菌中也存在類似的光敏色素。2016年，Vladislav V Verkhusha課題組Kaberniuk等[8]在沼澤紅假單胞菌中發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌光敏色素BphP1可與天然配體PpsR2可逆結(jié)合 (圖1B)，建立了近紅外光調(diào)控系統(tǒng)。與Phy/PIF系統(tǒng)相比，其優(yōu)點是所需色素PCB在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)天然存在，無需額外引入。BphP1-PpsR2光控系統(tǒng)對740–780 nm近紅外光敏感，650 nm紅光可以促進(jìn)BphP1與PpsR2蛋白分離。但只有在完全黑暗的條件下，兩蛋白才完全分離[8]。該系統(tǒng)可用于調(diào)控基因表達(dá)、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞形變與時空控制等[22-23]。但其實驗數(shù)據(jù)表明，該BphP1-PpsR2系統(tǒng)調(diào)控基因表達(dá)效率較低，限制了其廣泛應(yīng)用。因此后期該課題組Redchuk等[23]科學(xué)家對PpsR2蛋白進(jìn)行人工截短改造從而獲得更小的PpsR2變體QPAS1，通過將BphP1-QPAS1系統(tǒng)與藍(lán)光調(diào)控元件AsLOV2的LOV結(jié)構(gòu)域結(jié)合，建立了藍(lán)光與近紅外光分別獨立調(diào)控的胞內(nèi)蛋白定位系統(tǒng)。

1.1.2 隱花色素

隱花色素 (Cryptochrome) 最早在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，主要參與光調(diào)節(jié)細(xì)胞伸長、開花的光周期等。隱花色素2 (CRY2) 是一種藍(lán)光響應(yīng)蛋白，其天然結(jié)合配體為具有螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)的CIB蛋白。在光激活條件下，CRY2與CIB形成二聚物，并且在黑暗條件下二聚體解聚 (圖1C)。同時Kennedy等[9]發(fā)現(xiàn)，CRY2蛋白中N端光裂合酶同源區(qū)域 (PHR) 與光響應(yīng)結(jié)合CIB緊密相關(guān)，其在藍(lán)光調(diào)控下可與缺失螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)的CIB1 (CIBN) 或全長CIB1發(fā)生聚合或解聚作用。Taslimi等[24]發(fā)現(xiàn)一些CRY2的截短版本：CRY2 (515) 與CRY2 (535)，可以很大程度地降低黑暗條件下二聚作用產(chǎn)生的本底；L348F 與 W349R位點的突變分別可以減緩或加強(qiáng)CRY2-CIB1二聚物的解聚。此外在藍(lán)光條件下高表達(dá)的CRY2蛋白自身可發(fā)生寡聚[24-25]。

1.1.3 紫外響應(yīng)受體8

UVR-8 (UV response locus 8) 也是一種光敏蛋白，其作為植物UV-B響應(yīng)信號通路的組成部分，幫助植物適應(yīng)自然生長過程中的UVB (Ultraviolet B, 280–315 nm)，并緩解UV-B產(chǎn)生的DNA損傷[26-27]。相較于其他光敏蛋白，UVR-8的優(yōu)點在于，它通過色氨酸殘基吸收UVB，激活不需要共因子[28]，但其劣勢在于不可逆性以及UV的較強(qiáng)光毒性和細(xì)胞損傷能力。在黑暗條件下，UVR-8以同型二聚體形式存在，而光形態(tài)建成調(diào)控因子 (COP1) 是一種E3泛素連接酶，通過結(jié)合降解UVB響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子阻遏紫外響應(yīng)作用的產(chǎn)生；在UVB存在條件下，UVR-8解聚為單體轉(zhuǎn)運到核內(nèi)，結(jié)合COP1的C端WD-40結(jié)構(gòu)域并釋放COP1轉(zhuǎn)錄結(jié)合因子，該過程是不可逆的[29-31](圖1D)。

1.1.4 變構(gòu)蛋白

變構(gòu)蛋白二聚化或解聚也可應(yīng)用于光誘導(dǎo)蛋白互作，一般情況下依賴于LOV結(jié)構(gòu)域。光-氧-電勢結(jié)構(gòu)域 (LOV) 最早是從植物光電感受器phot1中分離出的閉鎖結(jié)構(gòu)域 (Caging domain)，通過響應(yīng)藍(lán)光調(diào)控植物生長[32-33]。

黑暗條件下AsLOV2 (LOV2) 或AtLOV2 (LOV2) 結(jié)構(gòu)域與C末端螺旋Jα結(jié)合；藍(lán)光激活條件下，由于半胱氨酸殘基的高度保守，使LOV核心與黃素蛋白FMN之間的非共價作用轉(zhuǎn)變?yōu)楣矁r作用，由此發(fā)生光誘導(dǎo)構(gòu)象變化，解除Jα螺旋結(jié)構(gòu)對LOV核心結(jié)構(gòu)域的抑制作用[34-35](圖1E)。因此可以通過在LOV結(jié)構(gòu)域N端或Jα螺旋的C端融合效應(yīng)蛋白，調(diào)控藍(lán)光釋放原來閉鎖在LOV結(jié)構(gòu)域中的目的蛋白，從而將該系統(tǒng)應(yīng)用于光控信號通路的改造[36]。此外，Strickland等[37]通過理性設(shè)計在AsLOV中引入4個突變位點，增強(qiáng)了Jα螺旋LOV結(jié)構(gòu)域結(jié)合的穩(wěn)定性。

雖然以上天然含有LOV結(jié)構(gòu)域 (光-氧-電結(jié)構(gòu)域) 的光受體蛋白本身就具有藍(lán)光誘導(dǎo)異構(gòu)的能力[26]，但大部分情況下使用的是經(jīng)過人工改造的具有多重異構(gòu)結(jié)構(gòu)域的變構(gòu)蛋白。它可以感應(yīng)光從而對下游通路產(chǎn)生影響。如TULIP系統(tǒng)利用LOV結(jié)構(gòu)域響應(yīng)藍(lán)光發(fā)生構(gòu)象變化，釋放目標(biāo)蛋白誘導(dǎo)二聚化的產(chǎn)生[38-39]。此外，LOV結(jié)構(gòu)域相關(guān)的光遺傳學(xué)工具開關(guān)的開啟和關(guān)閉靈敏度取決于蛋白融合，對融合的方向和連接蛋白的長度較為敏感。

在真菌的光受體中，VVD是最小的含有LOV結(jié)構(gòu)域的蛋白，其N端螺旋結(jié)構(gòu)在光刺激的條件下發(fā)生空間構(gòu)象變化[40]，導(dǎo)致同源二聚化從而在空間上使互相作用的結(jié)構(gòu)域靠近。但天然同源二聚化具有局限性且解聚半衰期長[10,41]，因此后續(xù)通過改造VVD蛋白，在其N末端螺旋處加上正電性氨基酸 (pMag) 與負(fù)電性氨基酸 (nMag)利用藍(lán)光激活LOV結(jié)構(gòu)域，釋放pMag與nMag殘基，誘導(dǎo)正負(fù)電性的氨基酸相互吸引發(fā)生異源二聚化 (圖1F)；而該系統(tǒng)中帶同種電荷氨基酸殘基之間存在相互排斥，因此可以很大程度上消減自然情況下的同源二聚化作用[10,42]。

此外，離子通道相關(guān)的光遺傳學(xué)元件在機(jī)制上也屬于變構(gòu)蛋白，其蛋白種類主要屬于Ⅰ型微生物類視蛋白家族，常應(yīng)用于神經(jīng)光遺傳學(xué)領(lǐng)域調(diào)控神經(jīng)元功能[4]。例如ChR2 (Channelrhodopsin-2)是一種光門控非特異性陽離子通道，可由藍(lán)光介導(dǎo)使Na+、Ca2+、K+等陽離子泵入細(xì)胞內(nèi)，Deisseroth課題組將其用來控制神經(jīng)元活動[43-44](圖1G)。此外，Kushibiki等通過在小鼠胰腺β-細(xì)胞中表達(dá)ChR2，建立了β-細(xì)胞分泌胰島素的光依賴通路，并證明利用藍(lán)光激活ChR2通道誘導(dǎo)胞內(nèi)儲存的Ca2+釋放內(nèi)流到小鼠胰腺β-細(xì)胞中，產(chǎn)生信號級聯(lián)，可調(diào)節(jié)體內(nèi)血糖水平[45]。

1.2 寡聚系統(tǒng)

隱花色素CRY2PHR除了可與其結(jié)合蛋白CIBN在藍(lán)光刺激下發(fā)生二聚作用以外，2013年，Bugaj等[25]發(fā)現(xiàn)CRY2自身具有寡聚作用 (圖1H)，并且在10 s內(nèi)即在動物細(xì)胞中產(chǎn)生肉眼可見的蛋白質(zhì)聚集，蛋白聚集量隨著光照強(qiáng)度的增強(qiáng)與光照時間的增長而增多；在黑暗條件下，CRY2蛋白聚集隨時間指數(shù)級減少，半衰期小于5.5 min。

該CRY2寡聚系統(tǒng)可應(yīng)用于時空調(diào)控目的蛋白同源寡聚化，從而探究蛋白間相互作用以及細(xì)胞信號通路；并且該寡聚系統(tǒng)的穩(wěn)定與否直接與CRY2蛋白濃度以及標(biāo)記蛋白的種類和結(jié)構(gòu)相關(guān)[46]。2017年，Park等[47]通過與CRY2融合表達(dá)不同的熒光蛋白發(fā)現(xiàn)融合蛋白或標(biāo)記蛋白的四級結(jié)構(gòu)對CRY2的寡聚效率存在顯著影響，并且利用短肽標(biāo)記構(gòu)建了穩(wěn)定高效的CRY2聚合系統(tǒng) (CRY2clust)，該系統(tǒng)能夠有效地調(diào)控活細(xì)胞在對光的響應(yīng)過程中的精確胞內(nèi)信號。但目前該系統(tǒng)CRY2蛋白寡聚機(jī)理仍未被揭示，并且無法有效應(yīng)用于分子量較大的蛋白寡聚化調(diào)控，因此，該系統(tǒng)仍有很大的探索空間。

2 光控細(xì)胞信號通路

在細(xì)胞的增殖、分化、衰老、凋亡等生理過程中，細(xì)胞信號通路起著主要調(diào)控作用且介導(dǎo)細(xì)胞執(zhí)行一系列生物功能。細(xì)胞信號通路的相關(guān)研究是目前生物科學(xué)研究的主流，且功能性蛋白和信號網(wǎng)絡(luò)間的互作關(guān)系的探究已獲得一定成果與進(jìn)展。然而，傳統(tǒng)研究方法在空間與時間上缺乏靈活調(diào)控且應(yīng)用面較為狹隘，因此導(dǎo)致細(xì)胞信號通路的探究仍具有很大局限性。

通過合成生物學(xué)手段人為構(gòu)建改造的胞內(nèi)信號通路，在原有信號通路中引入光遺傳學(xué)元件來替代胞內(nèi)響應(yīng)蛋白和基因或作為額外的調(diào)控因子感受和響應(yīng)外界刺激，可實現(xiàn)時空特異性的調(diào)控，也可通過光控蛋白調(diào)控多元信號通路探索信號網(wǎng)絡(luò)間的聯(lián)系。采用光遺傳學(xué)改造胞內(nèi)信號通路的應(yīng)用已被廣泛報道，其關(guān)鍵是選擇合適的元件進(jìn)行調(diào)控，以下舉例闡述幾條主要的胞內(nèi)信號通路以及光遺傳學(xué)工具在通路改造中的應(yīng)用。

2.1 絲裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 通路

絲裂原活化蛋白激酶 (Mitogen-activated protein kinase，MAPK) 通路及其引起的一系列信號級聯(lián)效應(yīng)調(diào)控著細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生理過程。MAPK的信號級聯(lián)在胞內(nèi)可被大量的細(xì)胞表面受體激活，如受體酪氨酸激酶 (RTK)、細(xì)胞因子受體和G蛋白偶聯(lián)受體 (GPCRs)；并且該信號級聯(lián)主要由MAPK3K、MAP2K和MAPK相互激活、產(chǎn)生信號放大效應(yīng)[48]。

MAPK信號通路相關(guān)的光遺傳學(xué)改造最早以酵母為底盤細(xì)胞，成功實現(xiàn)了藍(lán)光調(diào)控膜招募支架蛋白Ste5，從而激活下游一系列MAPK信號級聯(lián)效應(yīng)，在生物功能上表現(xiàn)為對酵母生長的抑制[38,49](圖2A)。在動物細(xì)胞中，Toettche等[50]建立了紅光響應(yīng)的Opto-SOS系統(tǒng)，通過引入光控系統(tǒng)PhyB-PIF (光敏色素互作因子) 從而招募SOS至細(xì)胞膜，實現(xiàn)紅光誘導(dǎo)激活MAPK信號級聯(lián)反應(yīng) (Ras/Raf/MEK/ERK) (圖 2B)。

此外，藍(lán)光調(diào)控系統(tǒng)CRY2-CIBN也被應(yīng)用于Raf/MEK/ERK信號通路的改造，該系統(tǒng)中CIBN定位于細(xì)胞膜，CRY2PHR與Raf1融合表達(dá)，通過藍(lán)光激活調(diào)控蛋白CRY2PHR與CIBN二聚化招募Raf1激酶靶向細(xì)胞膜，從而激活下游激酶[51](圖 2C)；Kim等則通過在FGFR (成纖維細(xì)胞生長因子受體) 上引入可響應(yīng)藍(lán)光發(fā)生寡聚化的CRY2PHR蛋白，改造并建立了Opto-FGFR1系統(tǒng)。在藍(lán)光激活條件下，F(xiàn)GFR二聚化并自磷酸化，從而對下游MAPK、PI3K、PLC等激酶產(chǎn)生影響，在Opto-FGFR1系統(tǒng)中表現(xiàn)為對FGFR受體的調(diào)控從而調(diào)控細(xì)胞的極化與遷移[52-53]。

圖2 光控蛋白與細(xì)胞信號通路

2.2 細(xì)胞凋亡信號通路 (Caspase cascade)

程序性細(xì)胞死亡 (Programming cell death，PCD)，又稱凋亡，是一種由基因編碼的存在于所有細(xì)胞中的信號通路，在死亡信號介導(dǎo)下誘導(dǎo)細(xì)胞主動有序地生理性死亡。細(xì)胞凋亡是維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵，凋亡通路的失調(diào)可能導(dǎo)致許多疾病，如癌癥、自身免疫病和神經(jīng)退行性疾病等，因此對于細(xì)胞凋亡通路的人為調(diào)控也是突破癌癥等疾病治療的關(guān)鍵所在[54]。

在PCD過程中，半胱氨酸-天冬氨酸蛋白水解酶 (Caspase) 是決定性的調(diào)控因子，根據(jù)不同的Caspase家族可分為執(zhí)行者和效應(yīng)者，對凋亡通路的級聯(lián)起著重要作用。Mills等[55]通過引入LOV2結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建了藍(lán)光響應(yīng)Opto-caspase-7系統(tǒng)，非激活狀態(tài)下LOV2閉鎖的空間結(jié)構(gòu)抑制caspase-7活性，藍(lán)光照射下誘導(dǎo)LOV2結(jié)構(gòu)域構(gòu)象變化釋放caspase活性，并且系統(tǒng)可以在1 h內(nèi)高效地引起細(xì)胞凋亡過程。Zheng等[56]通過將稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米顆粒 (UCNPs) 與藍(lán)光調(diào)控系統(tǒng)CRY2-CIB相結(jié)合，建立了受紅光間接調(diào)控的凋亡途徑，實現(xiàn)調(diào)控凋亡通路下游一系列Caspase級聯(lián)效應(yīng)用于腫瘤治療(圖2D)。但該系統(tǒng)中光轉(zhuǎn)換納米顆粒存在潛在的不穩(wěn)定性與不可估測性，因此在臨床腫瘤治療中還存在諸多待解決問題。

2.3 磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路 (PI3K/AKT)

PI3Ks激酶可以使磷脂酰肌醇磷酸化從而產(chǎn)生PIP3，PIP3則可激活下游相關(guān)通路AKT、PKC、Rac/actin來調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、生存、遷移和細(xì)胞周期等過程[57-58]。同時控制著胞內(nèi)多條重要的生存信號級聯(lián)反應(yīng)的AKT信號通路，其中蛋白激酶B (AKT/PKB) N端的PH結(jié)構(gòu)域響應(yīng)膜上PIP3水平的變化，隨著PIP3水平的上升，PKB被激活并引發(fā)一系列細(xì)胞效應(yīng)如細(xì)胞遷移極化、增殖和分化[59]。

利用光遺傳學(xué)方法改造的PI3K/AKT通路目前已分別在紅光系統(tǒng)與藍(lán)光系統(tǒng)中實現(xiàn)。紅光調(diào)控的PI3K/AKT通路通過利用光遺傳學(xué)元件PhyB-PIF6，引入融合表達(dá)的PIF6因子與PI3K結(jié)合蛋白p85α的SH2結(jié)構(gòu)域，從而在紅光條件下膜招募SH2結(jié)構(gòu)域，進(jìn)而招募PI3K激酶，上調(diào)PIP3水平并激活下游AKT通路[60](圖2E)。Chang等[61]利用藍(lán)光響應(yīng)蛋白CRY2的寡聚效應(yīng)，將TrkB (原肌球蛋白受體激酶B) 與CRY2PHR (CRY2光解酶同源區(qū)域) 融合表達(dá)構(gòu)建了Opto-trkB系統(tǒng) (圖2F)，實現(xiàn)AKT/PI3K等酶表達(dá)水平的上調(diào)。此外，CRY2-CIB1系統(tǒng)也被用于改造PI3K/AKT信號通路，目前已建立了Opto-ish2、Opto-5-磷酸酶等系統(tǒng)，可分別用于調(diào)控網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用以及細(xì)胞骨架的重組[62]。

2.4 Rho家族GTP酶相關(guān)通路

Rho家族GTP酶是真核細(xì)胞中調(diào)控多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的分子開關(guān)，可以誘導(dǎo)細(xì)胞極化，調(diào)控微管動力學(xué)、膜運輸通路、細(xì)胞器發(fā)育等，其中GTP酶最主要的生物功能是調(diào)控肌動蛋白細(xì)胞骨架的形成[63]。目前研究最為廣泛的3種GTP酶分別為Rac1、Cdc42和RhoA，且它們之間的調(diào)控作用存在著非常緊密的聯(lián)系——Cdc42可激活Rac1，Rac1與RhoA互相拮抗[64]，3個酶對細(xì)胞骨架動力學(xué)調(diào)控具有重要影響。

光控Rho GTP酶系統(tǒng)的激活主要依賴于鳥苷酸交換因子 (GEFs) 的光響應(yīng)膜招募過程，通過將光敏蛋白PhyB錨定于胞膜，融合表達(dá)PIF與多種GEFs (Rac1/Cdc42/Rho) 從而構(gòu)建Opto-GTPase，在紅光調(diào)控下產(chǎn)生一定生物效應(yīng)，如Tiam蛋白(Rac GEF) 與交叉蛋白 (Cdc42 GEF) 的招募促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生板狀與絲狀偽足，Tim蛋白 (Rho GEF) 的膜招募可誘導(dǎo)細(xì)胞體積的收縮[7]。Yazawa等[65]利用擬南芥的FKF1-GI蛋白建立了藍(lán)光激活二聚化系統(tǒng) (BLAD)，可招募小G蛋白Rac1至細(xì)胞膜，同時誘導(dǎo)光照區(qū)域局部形成板狀偽足 (圖2G)。此外，LOV-PDZ以及LOV變構(gòu)系統(tǒng) (LOV uncaging system) 也被應(yīng)用于Rho GTP酶的改造[11,37-38]。

2.5 STING信號通路

干擾素刺激因子 (Stimulator of interferon genes, STING)，也稱為MITA或MPYS，由TMEM 173基因編碼，是一種與內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (ER) 相關(guān)的信號分子，可識別細(xì)胞質(zhì)內(nèi)異常DNA或環(huán)狀二核苷酸 (CDNs)，從而調(diào)控激活多種宿主防御基因的轉(zhuǎn)錄，其中包括Ⅰ型干擾素 (IFNs) 和促炎癥細(xì)胞因子等[66-68]。早期研究表明，STING是人類天然免疫中的一種新分子，可響應(yīng)入侵的DNA病毒、細(xì)菌以及轉(zhuǎn)染的DNA，從而激活內(nèi)源免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[69-70]；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)STING可作為環(huán)二核苷酸傳感器 (cGAMP，c-di-GMP，c-di-AMP)，通過cGAMP合成酶 (cGAS) 介導(dǎo)合成cGAMP，從而可以檢測胞漿DNA及胞內(nèi)病原體釋放的第二信使 (c-di-AMP，c-di-GMP)[71]。STING被激活后在TKB1激酶 (Tank-binding Kinase 1) 介導(dǎo)下分別使干擾素調(diào)節(jié)因子3 (Interferon-regulatory Factor 3, IRF3) 與核因子 (Nuclear factor-κB, NF-κB) 磷酸化，從而使這些轉(zhuǎn)錄因子入核激活下游內(nèi)源基因轉(zhuǎn)錄[72-73]。

2014年，F(xiàn)olcher等[74]通過改造STING通路，利用腦電圖腦-機(jī)接口BCI (EEG-based brain-computer interface) 開發(fā)了光誘導(dǎo)連接的無線電植入裝置來調(diào)控分泌型堿性磷酸酶SEAP (Secreted alkaline phosphatase) 的表達(dá)。該人造STING通路包含的元件有紅光響應(yīng)的細(xì)菌BphG1突變體蛋白、細(xì)菌二鳥苷環(huán)化酶DGCL結(jié)構(gòu)域 (Diguanylate cyclase)以及STING受體蛋白，可用于檢測細(xì)胞內(nèi)c-di-GMP水平并調(diào)控干擾素IFN-β啟動子激活，驅(qū)動特定轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄 (PIFN(AC+)-SEAP-pA) (圖2H)。

2017年，本課題組利用合成生物學(xué)技術(shù)將STING通路改造為光控信號通路，利用干擾素基因刺激因子 (STING) 作為細(xì)胞內(nèi)環(huán)二核苷酸傳感器的原理，采用細(xì)菌光敏蛋白BphS (c-di-GMP合酶) 以及c-di-GMP的專一磷酸二酯酶YhjH調(diào)控信號通路[75-77]，將IFN的響應(yīng)元件 ((hIFN-RE)- (ISRE)3) 作為GLP-1和Insulin的啟動響應(yīng)元件，建立了遠(yuǎn)紅光響應(yīng)的GLP-1和Insulin分泌系統(tǒng)用于糖尿病治療[76](圖2H)。但該系統(tǒng)的弊端在于對內(nèi)源性STING通路的嚴(yán)格依賴，系統(tǒng)易與人體免疫的重要內(nèi)源性過程 (如環(huán)鳥苷的激增) 產(chǎn)生交叉干擾，在應(yīng)用上有潛在不可控性。因此，我們后續(xù)改進(jìn)并提出了正交性更強(qiáng)、調(diào)控性能更好的改進(jìn)系統(tǒng)，詳見3.3。

3 光控細(xì)胞信號通路的應(yīng)用

生物體的發(fā)展高度依賴于空間和時間的信號級聯(lián)與基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，一個信號分子的定位可能引發(fā)細(xì)胞不對稱分裂或向組織層的特異性遷移，特定時間的基因表達(dá)也可能決定細(xì)胞分化過程中的命運，異常的時空變化產(chǎn)生的信號配體或基因表達(dá)可能是癌癥、遺傳性相關(guān)疾病的基礎(chǔ)。通過光遺傳學(xué)工具能夠精確了解到至少刺激多少特定種類的神經(jīng)元才能啟動目標(biāo)生物體，并能確定神經(jīng)元對特定神經(jīng)遞質(zhì)永久脫敏的信號劑量或持續(xù)時間；同時光遺傳學(xué)工具具備精確調(diào)控目標(biāo)通路的空間、時間和強(qiáng)度的能力。因此，光遺傳學(xué)工具在細(xì)胞信號通路中的引入能夠在多種基礎(chǔ)研究如神經(jīng)生物學(xué) (調(diào)控神經(jīng)興奮的發(fā)生、突觸可塑性研究)、基因修飾與調(diào)控、干細(xì)胞再生與分化、細(xì)胞信號通路和蛋白定位等研究中提供定制化的技術(shù)支持，并能夠突破傳統(tǒng)研究的限制，推動其他相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)發(fā)展，如光感蛋白的發(fā)現(xiàn)，顯微技術(shù)、成像技術(shù)和微創(chuàng)技術(shù)的發(fā)展等。此外，目前已經(jīng)解析了異常的細(xì)胞信號通路變化與疾病間聯(lián)系，而如何實現(xiàn)精確調(diào)控細(xì)胞信號通路將基礎(chǔ)研究的成果轉(zhuǎn)化到醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，光控細(xì)胞信號通路可能會成為這一突破的關(guān)鍵所在。

3.1 光控在神經(jīng)生物學(xué)研究中的應(yīng)用

光遺傳學(xué)最早就被應(yīng)用于調(diào)控神經(jīng)興奮，而實現(xiàn)對突觸的調(diào)控是也光遺傳工具目前應(yīng)用最深入的研究領(lǐng)域[78]。2005年，Karl Deisseroth等在哺乳動物神經(jīng)元中引入ChR2，實現(xiàn)了藍(lán)光光照下1 ms內(nèi)引發(fā)單個神經(jīng)興奮和一系列神經(jīng)興奮，在當(dāng)時引起了巨大的轟動。由此衍生出的研究工作也被廣泛報道，如全息光學(xué)刺激視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞恢復(fù)視力[79]以及光遺傳學(xué)工具在測量微秒級亞細(xì)胞電生理的發(fā)展等。2019年Claire N. Bedbrook[80]等結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)建立計算機(jī)模型從而改造了大量ChR變體，其中變體ChRger1、ChRger3展現(xiàn)出優(yōu)良的神經(jīng)系統(tǒng)的光遺傳學(xué)激活，尤其ChRger2無需光纖植入即可實現(xiàn)神經(jīng)元的光遺傳學(xué)激活，初步解決了哺乳動物顱內(nèi)光遺傳學(xué)外源電子元件植入帶來的問題。

3.2 光控系統(tǒng)在基因表達(dá)調(diào)控中的應(yīng)用

光遺傳是一種能夠?qū)崿F(xiàn)時空特異性地調(diào)控基因表達(dá) (轉(zhuǎn)錄、翻譯和基因編輯) 的強(qiáng)大工具。不同于傳統(tǒng)的擴(kuò)散性高、控制性低的化學(xué)誘導(dǎo)劑，特殊波長的光觸發(fā)基因調(diào)控系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)精確正交調(diào)控，且無明顯脫靶效應(yīng)。Shimizu-Sato等[81]通過在光敏色素上融合Gal4-DNA結(jié)合域 (Phy-GBD)，在Gal4-DNA激活域上融合PIF3 (PIF3-GAD)，實現(xiàn)在紅光照射下Phy-GBD結(jié)合PIF3-GAD融合蛋白，從而在Gal4啟動子控制下刺激基因轉(zhuǎn)錄；遠(yuǎn)紅光則能關(guān)閉轉(zhuǎn)錄。Ravi S Kane等[82]利用CRY2PHR-CIBN蛋白在藍(lán)光下使翻譯激活蛋白eIF4E定位至目標(biāo)mRNA，從而激活其翻譯過程。

然而上述方法都存在一個限制因素：需要向胞內(nèi)基因外源引入復(fù)雜的啟動子區(qū)域。近期，光控研究也被用來招募效應(yīng)器到內(nèi)源性基因組位點而應(yīng)用于基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和基因組編輯。Polstein等[83]利用Gigantea和FKF1相互作用的光控系統(tǒng)，引入鋅指結(jié)構(gòu)DNA結(jié)合蛋白 (Zinc finger protein，ZFP) 以招募VP16轉(zhuǎn)錄激活子至目標(biāo)DNA序列，并在藍(lán)光下開啟轉(zhuǎn)錄過程。Konermann等[84]設(shè)計了利用轉(zhuǎn)錄激活因子類似效應(yīng)器DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄激活子VP64結(jié)合構(gòu)建的CRY2-CIB1光控系統(tǒng)，實現(xiàn)修改組蛋白乙?；瑥亩宫F(xiàn)出其潛在的協(xié)調(diào)表觀遺傳狀態(tài)和翻譯后修飾的功能。

雖然調(diào)控基因表達(dá)的Cre/、CRISPR/Cas9等系統(tǒng)能夠高效調(diào)控基因表達(dá)，但想要對系統(tǒng)進(jìn)行更加精確的調(diào)控，實現(xiàn)在時間、空間上特異性調(diào)控基因表達(dá)，光遺傳學(xué)元件給了人們很多啟發(fā)。

3.2.1 光控Cre系統(tǒng)調(diào)控基因表達(dá)

Cre/系統(tǒng)來源于F1噬菌體，能夠介導(dǎo)位點特異的DNA重組。該系統(tǒng)含有兩種組分：位點 (Locus of X-over P1) 和Cre重組酶 (Cyclization recombination)。位點作為重組酶識別的位點，是一段長34 bp的DNA序列，含有兩個13 bp的反向重復(fù)序列和一個8 bp的核心序列；Cre重組酶是一種由343個氨基酸組成的單體蛋白，生物活性較穩(wěn)定，能在生物體不同的組織內(nèi)、不同的生理條件下引發(fā)位點的DNA重組。Cre/系統(tǒng)不需要細(xì)胞或者生物體提供其他的輔助因子，重組酶的編碼基因受響應(yīng)啟動子調(diào)控。

近期Won Do Heo課題組開發(fā)了一種高度光敏和高效的光活化Flp重組酶 (PA-Flp)[85]，可用于體內(nèi)基因調(diào)控。該系統(tǒng)中重組酶PA-Flp可由病毒載體介導(dǎo)與Cre-系統(tǒng)結(jié)合，形成Flp依賴性Cre表達(dá)系統(tǒng)，可同時激活Flp和Cre；并且實驗證明了PA-Flp依賴性、Cre介導(dǎo)的內(nèi)側(cè)隔膜中的Cav3.1沉默增加了小鼠的物體探索行為。PA-Flp是非侵入性的、高效的、易于使用的光遺傳模塊，其高度光敏特性能通過無創(chuàng)發(fā)光二極管照明激活小鼠大腦深部區(qū)域，為神經(jīng)科學(xué)研究提供了無副作用和可擴(kuò)展的基因操作工具[86]。

3.2.2 光控CRISPR/Cas9系統(tǒng)調(diào)控基因編輯

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是細(xì)菌在長期演化過程中為了對抗入侵的病毒及外源DNA而形成的一種適應(yīng)性免疫防御[87]。在利用CRISPR/Cas9進(jìn)行基因編輯過程中，可以通過外源導(dǎo)入Cas9和sgRNA對靶基因進(jìn)行剪切從而實現(xiàn)基因定點敲除、突變或敲入。

有關(guān)光響應(yīng)的CRISPR/Cas9基因編輯方式已經(jīng)有了很多報道。如單體無活性的Split Cas9系統(tǒng)可融合光開光蛋白pMag和nMag后在光照下使Cas9活性重組[88]。2018年Felix Bubeck等利用LOV2藍(lán)光元件，引入了李斯特菌原噬菌體中的AcrIIA4蛋白作為效應(yīng)蛋白改造了抗CRISPR變體 (Anti-CRISPR)。在藍(lán)光刺激下，該CASANOVA系統(tǒng)可以很容易地在Cas9抑制狀態(tài)和活性狀態(tài)之間進(jìn)行精確地外部切換，可用于研究活細(xì)胞中Cas9 DNA靶向定位的動力學(xué)。

光控的Cas9系統(tǒng)改變了過去單向的、不可控的基因編輯，實現(xiàn)了時空特異性的、非侵入性的、可控的基因編輯模式，擴(kuò)展了基因編輯工具箱。

3.2.3 光控CRISPR/dCas9系統(tǒng)調(diào)控基因表達(dá)

dCas9是Cas9突變 (D10A和H840A) 后失去核酸酶活性的蛋白，但其仍具有結(jié)合基因組的能力，因而將dCas9與其他效應(yīng)蛋白融合可用于內(nèi)源基因修飾、調(diào)控以及DNA位點的標(biāo)記等[89-90]。為了實現(xiàn)特定時間、特定細(xì)胞的基因調(diào)控表達(dá)，Cas9或dCas9系統(tǒng)被不斷優(yōu)化。近幾年里很多化學(xué)藥物調(diào)控dCas9系統(tǒng)不斷被提出，但多數(shù)化學(xué)藥物調(diào)控存在藥物擴(kuò)散難以控制、反應(yīng)速度慢、反應(yīng)效率低、毒性大、無法滿足時空特異性和可逆調(diào)控的問題。而光在時間、空間、強(qiáng)度各方面都能很容易地實現(xiàn)調(diào)控，因而能夠很好地解決化學(xué)藥物調(diào)控存在的一些問題。一些光響應(yīng)蛋白對特異性波長光觸發(fā)的基因調(diào)控系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)精確正交調(diào)控。

近期研究已經(jīng)開發(fā)了光響應(yīng)的CRISPR/dCas9基因編輯方式。2015年有研究報道[75]，dCas9介導(dǎo)的藍(lán)光響應(yīng)系統(tǒng)被用于靶向內(nèi)源基因組位點調(diào)控其轉(zhuǎn)錄。融合CIB1的dCas9在sgRNA引導(dǎo)下靶向內(nèi)源基因組位點，融合轉(zhuǎn)錄激活子的CRY2在藍(lán)光響應(yīng)下與CIB1結(jié)合，從而調(diào)控目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄。靶向內(nèi)源基因修飾和轉(zhuǎn)錄表達(dá)的光響應(yīng)系統(tǒng)在近幾年已經(jīng)有較多的研究報道[91-92]。

3.3 光控系統(tǒng)在干細(xì)胞研究中的應(yīng)用

光遺傳學(xué)元件也可應(yīng)用于干細(xì)胞的改造，通過內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子組成的通信網(wǎng)絡(luò)控制細(xì)胞的可塑性、多能性，并且該網(wǎng)絡(luò)可持續(xù)對內(nèi)環(huán)境與信號作出反應(yīng)從而重調(diào)細(xì)胞類型特異性基因表達(dá)[92-93]。傳統(tǒng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)需要一系列生長因子的激活，其過程低效、復(fù)雜且可重復(fù)性低，通過光遺傳學(xué)手段在基因或信號水平控制分化關(guān)鍵基因可有效解決該問題。例如Sokolik等[94]利用藍(lán)光響應(yīng)VVD結(jié)構(gòu)域的二聚化，上調(diào)神經(jīng)分化因子Brn2的表達(dá)，高表達(dá)的Brn2可競爭性抑制Oct4、促進(jìn)Sox2上調(diào)從而誘導(dǎo)神經(jīng)分化基因的表達(dá)[94-95]。本課題組通過引入外源光敏蛋白 (BphS)以及相關(guān)響應(yīng)蛋白 (BldD)，構(gòu)建了完全絕緣的遠(yuǎn)紅光響應(yīng)的人造基因回路調(diào)控轉(zhuǎn)錄激活子，進(jìn)而構(gòu)建了遠(yuǎn)紅光調(diào)控的CRISPR-dCas9系統(tǒng) (Far-red light-activated CRISPR-dCas9 effector, FACE)[96]。該系統(tǒng)可高效誘導(dǎo)內(nèi)源或外源基因表達(dá)，通過上調(diào)單個神經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子有效促進(jìn)多能干細(xì)胞向功能神經(jīng)元的分化。此外，利用干細(xì)胞改造原理建立人工改造腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞 (CSC)，其中天然CSC細(xì)胞是誘導(dǎo)腫瘤復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素，通過光遺傳系統(tǒng)調(diào)控Sox2、OCT4、KIf4和c-Myc的表達(dá)可以控制分化細(xì)胞轉(zhuǎn)化為iCSC，可應(yīng)用于篩選CSCs靶向藥物，為進(jìn)一步研究腫瘤藥物抗性以及腫瘤再生提供技術(shù)支持[97-99]。

3.4 光控細(xì)胞信號通路與疾病治療

隨著合成生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因治療與細(xì)胞治療成為了新一代藥物研發(fā)的潛力股。通過結(jié)合光遺傳學(xué)方法與合成生物學(xué)理念而建立的精準(zhǔn)治療的創(chuàng)新體系，能夠改善傳統(tǒng)藥物或基因治療的失準(zhǔn)或脫靶效應(yīng)，并且現(xiàn)已有多種體系實現(xiàn)了以光為調(diào)控因素，在體外與體內(nèi)水平達(dá)到較好的時空特異性與細(xì)胞行為學(xué)調(diào)控[100-101]。此外，通過結(jié)合交叉領(lǐng)域生物電子藥物技術(shù)與原理，從而系統(tǒng)性地將分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物工程、電子信息技術(shù)串聯(lián)一體，建立智能化藥物診療體系。目前，光控細(xì)胞信號通路在癌癥、糖尿病以及神經(jīng)性疾病 (見3.1) 等重大疾病中都有良好的進(jìn)展。

在癌癥治療方面，近幾年來免疫療法如過繼細(xì)胞療法等技術(shù)迅速發(fā)展，在多種癌癥治療的臨床應(yīng)用中呈現(xiàn)出顯著療效，但傳統(tǒng)細(xì)胞療法存在組織特異弱、穿透性差等局限[102-104]。而引入光遺傳學(xué)系統(tǒng)可以精確調(diào)控免疫細(xì)胞有效識別腫瘤特異性抗體從而消除腫瘤細(xì)胞；應(yīng)用特定光譜的光遺傳學(xué)工具，可以一定程度上提高組織穿透能力，有效解決了傳統(tǒng)細(xì)胞療法存在的問題。He等[105]建立了Opto-CRAC系統(tǒng) (光控鈣離子釋放-激活鈣離子通道)，通過引入響應(yīng)藍(lán)光發(fā)生構(gòu)象變化的LOV2結(jié)構(gòu)域來模擬基質(zhì)互作分子 (STIM) 自然體內(nèi)構(gòu)象變化的過程，從而通過光誘導(dǎo)LOV2釋放STIM與膜上CRAC蛋白ORAI1結(jié)合，產(chǎn)生Ca2+并且介導(dǎo)免疫細(xì)胞內(nèi)一系列特征性鈣依賴反應(yīng) (圖3A)[106-107]。該系統(tǒng)除了可用于精確控制CAR-T細(xì)胞中的Ca2+/NFAT信號；引入Opto-CRAC系統(tǒng)改造的細(xì)胞與小鼠模型都呈現(xiàn)樹突狀細(xì)胞加速成熟且抗原遞呈能力上調(diào)的特點，從而促進(jìn)T細(xì)胞活化[105]。另一基于CAR-T (Chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy) 治療的光控系統(tǒng)PA-CXCR4，利用趨化因子受體與光響應(yīng)視紫紅質(zhì)之間的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，通過505 nm光激活誘導(dǎo)產(chǎn)生胞內(nèi)趨化因子的信號，控制T細(xì)胞遷移與運輸 (圖3A)。Xu等通過體外實驗證明經(jīng)過PA-CXCR4改造的CD8+T細(xì)胞在光照條件下，能顯著減緩腫瘤細(xì)胞增殖[108]。此外2019年Molly E Allen等[109]引入邏輯門-“與”門，設(shè)計了TamPA-Cre系統(tǒng)。通過將藍(lán)光響應(yīng)蛋白 (pMag,nMag) 與他莫昔芬 (Tamoxifen) 依賴性核定位結(jié)構(gòu)域整合Split-Cre重組酶，構(gòu)建了藥物小分子他莫昔芬與藍(lán)光共同調(diào)控嵌合抗原受體的表達(dá)，實現(xiàn)CAR-T細(xì)胞的特異性調(diào)控，進(jìn)一步改善了CAR-T治療脫靶的問題。

影響著全球約4.6億的不死“癌癥”——糖尿病，其引起的一系列并發(fā)癥以及慢性疾病的無法根治性帶來的痛苦不亞于腫瘤[110]。糖尿病治療的傳統(tǒng)手段是通過嚴(yán)格的飲食控制和終生注射胰島素 (Ⅰ型糖尿病) 或GLP-1 (Ⅱ型糖尿病) 來實現(xiàn)血糖穩(wěn)態(tài)的控制。目前運用合成生物學(xué)思路建立的光控糖尿病治療系統(tǒng)已實現(xiàn)。2011年，本課題組[111]構(gòu)建了藍(lán)光調(diào)控光遺傳學(xué)裝置來調(diào)控血糖內(nèi)穩(wěn)態(tài)，通過在細(xì)胞中異位表達(dá)藍(lán)光響應(yīng)G蛋白偶聯(lián)受體黑視素 (Melanopsin)，在藍(lán)光響應(yīng)下可以介導(dǎo)一系列胞內(nèi)信號級聯(lián)磷酸化激活轉(zhuǎn)錄因子NFATs，因此該系統(tǒng)可以通過光控NFAT控制特異性GLP-1啟動子來驅(qū)動GLP-1的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。華東理工大學(xué)楊弋課題組[96]構(gòu)建了另一光控胰島素分泌的系統(tǒng)，利用藍(lán)光激活下LOV蛋白VVD結(jié)構(gòu)域二聚化，通過將DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域Gal4 (1–65) 與VVD結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域VP16融合表達(dá)構(gòu)建了GAVV。藍(lán)光條件下GAVV二聚化從而入核結(jié)合啟動子Gal啟動胰島素的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。近期Zhang等[112]將光敏腺苷酸環(huán)化酶 (PAC) 引入胰腺β細(xì)胞中，通過藍(lán)光激活上調(diào)胞內(nèi)cAMP水平，從而增強(qiáng)葡萄糖刺激胰島素分泌過程 (Glucose-stimulated insulin secretion, GSIS) 來實現(xiàn)控制血糖穩(wěn)態(tài)。

圖3 光控細(xì)胞信號通路的改造應(yīng)用

為了解決藍(lán)光組織透性低、光毒性較大、體內(nèi)應(yīng)用局限性大等問題，本課題組[76]成功構(gòu)建了一種遠(yuǎn)紅光調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達(dá)的控制開關(guān)。利用紅細(xì)菌中響應(yīng)遠(yuǎn)紅光的受體蛋白BphS作為感受器, BphS在遠(yuǎn)紅光照射下可產(chǎn)生c-di-GMP分子。進(jìn)一步設(shè)計合成了c-di-GMP調(diào)控的雜交型轉(zhuǎn)錄激活子p65-VP64-BldD及其相對應(yīng)的啟動子，最終獲得了遠(yuǎn)紅光調(diào)控基因表達(dá)的光控基因線路 (圖3B)。最后通過利用合成生物學(xué)、光遺傳學(xué)、電子軟件工程等多學(xué)科交叉技術(shù)，巧妙地開發(fā)了一種集糖尿病診斷和治療為一體的半自動化診療新系統(tǒng) (圖4)。首次實現(xiàn)通過智能手機(jī)APP超遠(yuǎn)程調(diào)控胰島素表達(dá)就能實現(xiàn)遠(yuǎn)程控制血糖穩(wěn)態(tài)的目的。這一研究將為糖尿病患者提供極大的便捷性，顛覆了傳統(tǒng)口服和注射藥物治療糖尿病的方法。這種通過無線信號超遠(yuǎn)程控制藥物精準(zhǔn)釋放的電子藥物膠囊系統(tǒng)將是未來電子藥物的新趨勢。

圖4 人工改造光控信號通路應(yīng)用于精準(zhǔn)化治療、干細(xì)胞誘導(dǎo)分化、藥物篩選的示意圖

4 總結(jié)與展望

光控細(xì)胞信號通路的研究對現(xiàn)代生物學(xué)具有深遠(yuǎn)意義。目前，光控改造細(xì)胞信號通路的應(yīng)用已擴(kuò)展到實現(xiàn)控制蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用、觀察信號網(wǎng)絡(luò)動態(tài)、上調(diào)或下調(diào)基因表達(dá)或蛋白活性、亞細(xì)胞定位甚至走向轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)與疾病治療的道路。

時空特異性是光遺傳學(xué)工具的最大優(yōu)勢，這一特性恰好彌補(bǔ)了傳統(tǒng)研究方法中的缺點和劣勢。但是，光控系統(tǒng)也不是完美無缺，目前主要面臨著移植元件的組織損傷性、光毒性以及光控特異性與高效性等問題。盡管現(xiàn)有的手段已經(jīng)在不斷降低元件植入的創(chuàng)傷，但仍無法完全忽略創(chuàng)口給實驗或是臨床應(yīng)用帶來的影響。同時，應(yīng)用在活體生物內(nèi)時，需要考慮不同光遺傳學(xué)工具對應(yīng)不同光譜，其組織穿透能力的差異也是一個極大的影響因素。此外，在照射細(xì)胞一段時間后，光毒性仍是一個需要考慮的因素。而且光響應(yīng)蛋白的大小、特性對光遺傳學(xué)工具的開發(fā)也均有著很大的影響。

針對以上問題，為了實現(xiàn)更加安全精準(zhǔn)的調(diào)控，光遺傳學(xué)工具的開發(fā)目標(biāo)應(yīng)集中于研發(fā)設(shè)計更為精確、智能化的控制手段，例如結(jié)合顯微技術(shù)、醫(yī)學(xué)影像技術(shù)、軟件工程、電子信息工程等交叉領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)宏觀元件對微觀分子水平的高效調(diào)控。近年來結(jié)合交叉領(lǐng)域優(yōu)化光控系統(tǒng)在一定程度上改善了光控的部分問題。一方面，光學(xué)元件、軟件編程和電子信息技術(shù)的發(fā)展為可控光源提供了技術(shù)支持[113-117]；動物手術(shù)和臨床手術(shù)技術(shù)的不斷優(yōu)化使微創(chuàng)成為可能；另一方面，一些靈敏度高、響應(yīng)強(qiáng)烈以及毒性低、組織穿透性強(qiáng)的光控系統(tǒng)也不斷地被開發(fā)出來[118-119]。值得關(guān)注的是，近幾年來研究者們在嘗試整合多個光發(fā)生系統(tǒng)實現(xiàn)多方向、多方面地調(diào)控細(xì)胞信號網(wǎng)絡(luò)。利用不同波長的光設(shè)計構(gòu)建的多個光調(diào)控系統(tǒng)將能用來探索兩個信號通路、一個通路中的兩個節(jié)點或多個蛋白激活的組合、順序或正交激活的下游效應(yīng)等[120]。

近年來光遺傳學(xué)領(lǐng)域在工具開發(fā)和擴(kuò)展方面有了很大的發(fā)展，為細(xì)胞在不同空間和時間的動態(tài)變化的研究提供了新的研究手段，也為細(xì)胞信號通路的基礎(chǔ)研究提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持，對未來在轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)方面的研究也有著廣闊的應(yīng)用前景。

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Development and application of optogenetic tools

Qiyao Wei, Chenchen Xu, Meiyan Wang, and Haifeng Ye

Biomedical Synthetic Biology Research Center, Shanghai Key Laboratory of Regulatory Biology, School of Life Sciences, East China Normal University, Shanghai 200241, China

Dynamic variations of the cell microenvironment can affect cell differentiation, cell signaling pathways, individual growth, and disease. Optogenetics combines gene-encoded protein expression with optical controlling, and offers a novel, reversible, non-invasive and spatiotemporal-specific research tool to dynamically or reversibly regulate cell signaling pathways, subcellular localization and gene expression. This review summarizes the types of optogenetic components and the involved cellular signaling pathways, and explores the application and future prospects of the light-controlled cell signaling pathways.

synthetic biology, optogenetics, light-controlled signal transduction, light-controlled gene switch, spatiotemporal control

July 4, 2019;

November 29, 2019

The National Key R&D Program of China (No. 2016YFA0100300), the National Natural Science Foundation of China (Nos. 31971346, 31861143016, 31870861), the Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (No. 18JC1411000), the Thousand Youth Talents Plan of China.

Haifeng Ye. Tel: +86-21-54341058; E-mail: hfye@bio.ecnu.edu.cn

科技部重大專項基金 (No. 2016YFA0100300)，國家自然科學(xué)基金 (Nos. 31971346, 31861143016, 31870861)，上海市科委 (No. 18JC1411000)，青年千人計劃資助。

2019-12-05

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.q.20191203.1645.001.html

魏琪瑤, 徐晨晨, 王美艷, 等. 光遺傳學(xué)工具的開發(fā)及其應(yīng)用研究. 生物工程學(xué)報, 2019, 35(12): 2238–2256.

Wei QY, Xu CC, Wang MY, et al. Development and application of optogenetic tools. Chin J Biotech, 2019, 35(12): 2238–2256.

(本文責(zé)編 郝麗芳)