王澤洲，吳俊清，章健，陳弟詩，張毅，賀冬梅

(1.四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041；2.成都微瑞生物科技有限公司，四川 成都 611731）

豬圓環(huán)病毒?。≒CV-2）是由圓環(huán)病毒2型引起的一類免疫抑制性傳染病，該病伴隨著藍(lán)耳病、非典型豬瘟等并發(fā)或繼發(fā)，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［1-2］。目前對該病的診斷主要采用PCR、間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）和免疫組織化學(xué)染色法（IHC）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、膠體金技術(shù)等方法［3-5］，這些方法在生產(chǎn)實(shí)際中都不同程度地受到條件制約。為達(dá)到在基層和養(yǎng)殖場實(shí)現(xiàn)快速即時(shí)檢測，本研究應(yīng)用鑭系元素作熒光標(biāo)記物，研制了一種既具有金標(biāo)層析技術(shù)簡單方便、快捷，又具有ELISA 準(zhǔn)確、特異、敏感的豬圓環(huán)病毒抗體高敏熒光免疫層析快速檢測試劑盒（PCV-2-LFICA）。

1 材料與方法

1.1 材料 PCV-2 表達(dá)蛋白抗原、兔抗雞IgY 抗體、雞IgY抗體，鑭系熒光納米微球和Wellray?WR-1608 熒光儀；吸水紙、樣品墊、硝酸纖維素膜，1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC），N-羥基琥珀酰亞胺，切條機(jī)、點(diǎn)膜和噴金膜機(jī)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸道綜合征病毒（PRRSV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬細(xì)小病毒（PPV）、豬乙型腦炎病毒（JEV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）的陽性血清，豬圓環(huán)病毒II型抗體ELISA檢測試劑盒。

此外，制備包被膜、抗原標(biāo)記微球、夾心法建立等均參照說明書或按相關(guān)要求操作。

1.2 熒光免疫層析試紙條的組裝 在濕度小于30%，溫度20～25 ℃的環(huán)境下，把吸水紙、標(biāo)記物墊和樣品墊按順序粘貼在聚氯乙烯底板上形成微反應(yīng)體系，然后將其切割成0.5 cm寬，即成試紙條，將試紙條裝入卡殼中制成檢測卡，裝入鋁箔袋封存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 特異性試驗(yàn) 以建立的判斷標(biāo)準(zhǔn)（標(biāo)準(zhǔn)曲線）與CSFV、PRRSV、PRV、PPV、JEV、PEDV、TGEV陽性血清進(jìn)行豬圓環(huán)病毒病抗體鑭系熒光免疫層析檢測，同時(shí)設(shè)豬圓環(huán)病毒抗體陽性、陰性對照，旨在確定該檢測方法是否發(fā)生交叉反應(yīng)。

1.4 敏感性試驗(yàn) 將PCV-2 標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行1∶4、1∶16、1∶64、1∶256、1∶1 024、1∶4 096、1∶16 384倍比稀釋，每個(gè)稀釋度平行做4個(gè)重復(fù)，用組裝的PCV-2-LFICA試劑盒檢測，將結(jié)果換算成S/P值，判斷抗體檢出效價(jià)。

1.5 重復(fù)性試驗(yàn)

1.5.1 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn) 在相同條件下選取12份PCV-2抗體水平不同的血清樣本，每份樣本平行做8個(gè)重復(fù)，用組裝的PCV-2-LFICA試劑盒檢測（批號為20170626），然后對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5.2 批間重復(fù)性試驗(yàn) 在相同條件下選取12份PCV-2 抗體水平不同的血清，分別用4 批PCV-2-LFICA試劑盒檢測（批號分別為20170626、20170718、20171011、20171219），然后對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.6 比較試驗(yàn) 分別用組裝的PCV-2-LFICA試劑盒和豬圓環(huán)病毒2型抗體ELISA試劑盒同時(shí)檢測同一批臨床樣品200 份，比較兩種方法檢測結(jié)果的符合率。

1.7 試劑盒的組裝及保存期試驗(yàn) PCV-2-LFICA 試劑盒由熒光檢測儀、檢測卡、連接線組成。試劑盒置4 ℃保存，于保存后60、120、180、240、300、360、420、480 d按照PCV-2-LFICA各個(gè)優(yōu)化條件，對PCV-2陽性和陰性參考血清進(jìn)行檢測，并對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.8 應(yīng)用試驗(yàn) 用PCV-2-LFICA試劑盒對收集自四川省內(nèi)各地的2 372 份血清樣本進(jìn)行檢測，了解PCV-2血清抗體陽性率。

2 結(jié)果

2.1 測定條件的選擇

2.1.1 標(biāo)記量的選擇 把標(biāo)記好的質(zhì)量比（抗原/微球）不同的熒光微球稀釋相同倍數(shù)，組裝成檢測卡，在檢測卡加樣孔中分別加入80 μL 參考樣本，室溫下層析15 min，檢測，考察并驗(yàn)證不同標(biāo)記量對標(biāo)記結(jié)果的影響。結(jié)果表明，隨標(biāo)記抗原濃度的增加，各濃度點(diǎn)的結(jié)合率呈現(xiàn)先增后降的趨勢，在抗原/微球的質(zhì)量比為1∶25 時(shí)有最大值。因此，選擇標(biāo)記比例為1∶25的免疫微球進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 加樣量的選擇 在其他條件一致的情況下，考察并驗(yàn)證樣本不同稀釋倍數(shù)對檢測結(jié)果的影響。在檢測卡加樣孔里分別加入稀釋10、20、30、40、50、60、70 倍的參考樣本，室溫下反應(yīng)15min后檢測。結(jié)果表明，隨稀釋倍數(shù)的增加，各濃度點(diǎn)的結(jié)合率均減小。當(dāng)樣本稀釋倍數(shù)為40倍時(shí)，繼續(xù)降低稀釋倍數(shù)，結(jié)合率增加不明顯，免疫反應(yīng)基本飽和。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇樣本稀釋倍數(shù)40倍為加樣量。

2.1.3 檢測時(shí)間的選擇 在檢測卡加樣孔中加入80 μL參考樣本，室溫下反應(yīng)，分別在5、10、15、20、25、30 min 時(shí)檢測，考察不同檢測時(shí)間對結(jié)果的影響。結(jié)果表明，隨著檢測時(shí)間的延長，各濃度點(diǎn)的結(jié)合率基本呈現(xiàn)增加的趨勢，試紙靜置15 min 檢測時(shí)即能達(dá)到較高的結(jié)合率，而隨著檢測時(shí)間的增加，各濃度點(diǎn)的結(jié)合率不再發(fā)生較大的變化，趨于平穩(wěn)，說明在15 min 時(shí)試紙條上的雙抗原夾心吸附基本達(dá)到飽和。因此，本著快速簡便的原則，選擇檢測時(shí)間為加樣后15 min。

2.2 檢測結(jié)果的判讀 加樣后，由于液體向前移動(dòng)，先后與包被在T 線和C 線上的抗原形成復(fù)合物，這時(shí)試紙條經(jīng)熒光檢測設(shè)備掃描顯示出2 條熒光帶（圖1）。C線熒光掃描值基本一致，T線值隨加樣中抗體濃度的增加而升高。相應(yīng)的檢測結(jié)果以濃度為橫坐標(biāo)，熒光值信號為縱坐標(biāo)，經(jīng)對數(shù)函數(shù)數(shù)據(jù)處理程序擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）。當(dāng)樣本為陰性時(shí)，PCV-2抗體濃度很低，T線熒光值很低或完全檢測不到；當(dāng)樣本為陽性時(shí)，PCV-2 抗體濃度越高，T 線熒光值也越高。無論結(jié)果是陽性還是陰性，C線總能顯示熒光，如果C線沒有熒光顯現(xiàn)，無論T 線有無，結(jié)果均判為無效。

圖1 熒光微球免疫層檢技術(shù)檢測PCV-2抗體的掃描圖譜

圖2 熒光微球免疫層析技術(shù)檢測PCV-2抗體的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 特異性試驗(yàn) 本次用PCV-2 蛋白抗原和全病毒建立的PCV-2-LFICA 試劑盒檢測7 種常見豬病的陽性血清，得到的熒光比值均低于0.40（見表1），呈陰性反應(yīng)。表明該方法與7 種常見豬病的陽性血清不發(fā)生交叉反應(yīng)，顯示出很好的特異性。

2.4 敏感性試驗(yàn) 選取3 份豬圓環(huán)病毒2 型抗體強(qiáng)陽性血清進(jìn)行1∶4、1∶16、1∶64、1∶256、1∶1 024、1∶4 096、1∶16 384 倍比稀釋，然后做敏感性比對試驗(yàn)。分別用高敏熒光免疫分析法與酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測同一份血清，得出PCV-2-LFICA 試劑盒的檢測滴度為1∶64，而ELISA 為1∶4，前者比 后 者 高1～2 個(gè) 滴度。表 明 PCV-2-LFICA 試劑盒的敏感性較好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)小于10%（表2），批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)也小于10%（表3）。表明PCV-2-LFICA試劑盒具有良好的重復(fù)性。

2.6 比較試驗(yàn) 用PCV-2-LFICA試劑盒檢測臨床樣品200份，得出177份陽性，20份陰性，3份可疑；用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測200份臨床樣品，得出33 份陰性，167 份陽性。兩種檢測方法的總符合率為91%（表4）。

2.7 保存期試驗(yàn) 如表5所示，PCV-2-LFICA試劑盒在保存480 d后檢測陽性血清、陰性血清，其變異系數(shù)均小于10%，說明該診斷試劑盒在保存12個(gè)月后仍然穩(wěn)定有效，進(jìn)一步的穩(wěn)定性試驗(yàn)還在進(jìn)行中。

表1 特異性試驗(yàn)結(jié)果

表2 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表3 批間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表4 比較試驗(yàn)結(jié)果

表5 保存期試驗(yàn)結(jié)果

2.8 現(xiàn)場應(yīng)用試驗(yàn) 使用本次研制的PCV-2-LFICA 試劑盒檢測收集自四川省內(nèi)各地的2 372份血清樣本，結(jié)果檢出血清抗體陽性1 822份，陽性率為76.8%。

3 結(jié)論與分析

3.1 鑭系熒光免疫層析方法（LFICA）是在時(shí)間分辨熒光免疫分析（TRFIA）基礎(chǔ)上建立起來的一種超微量快速免疫檢測技術(shù)，它集合了酶標(biāo)記技術(shù)、放射標(biāo)記技術(shù)和同位素標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、無污染，且測定范圍寬，試劑盒壽命長，操作簡單和無放射性等優(yōu)點(diǎn)。在人醫(yī)學(xué)界已有文獻(xiàn)報(bào)道，在獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域才起步，需要研究的內(nèi)容和范圍還很多［6］。與國內(nèi)ELISA 試劑盒檢測結(jié)果的符合率和敏感性都在90%以上，說明該方法完全可以用于PCV-2免疫抗體的檢測。

3.2 豬圓環(huán)病毒病是一種免疫抑制性疾病，本身可以引起豬群發(fā)病和死亡，同時(shí)也可以潛伏在機(jī)體中，當(dāng)環(huán)境條件改變或有藍(lán)耳病、豬瘟、副豬嗜血桿菌病發(fā)生的時(shí)候，出現(xiàn)繼發(fā)或并發(fā)感染，使豬群發(fā)病率和死亡率增加，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［7-10］。在圓環(huán)病毒病抗體的常用檢測方法中，ELISA是目前應(yīng)用最廣、發(fā)展最快的免疫檢測方法，也是當(dāng)前檢測豬圓環(huán)病毒病抗體的主要方法，該法具有敏感性高、特異性強(qiáng)、操作簡單、檢測相對快速、檢查微量、無輻射、高通量等優(yōu)點(diǎn)，但需要比較完備的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，操作人員需要具有一定的專業(yè)技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)，檢測一批樣品的整個(gè)流程至少需要2～4 h，對于基層獸醫(yī)站和中小養(yǎng)殖場不適用。間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)和免疫組織化學(xué)染色法(IHC)、PCR 等方法，也都需要專門的實(shí)驗(yàn)室、儀器設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員，并且成本較高。膠體金免疫層析法（GICA）是近年來發(fā)展起來的一種快速檢測方法，該方法操作簡單，使用方便，不需要特殊儀器設(shè)備，肉眼直接觀察和判定結(jié)果，全程只需要幾分鐘，但敏感性較差、重復(fù)性不高，產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，漏檢率和誤診率較高。本研究建立的PCV-2-LFICA 法，既具有膠體金免疫層析法簡單方便、適于基層等優(yōu)點(diǎn)，又具有ELISA敏感、特異、微量等優(yōu)點(diǎn)，檢測時(shí)間從2～4 h縮短到十多分鐘，檢測不需要具有經(jīng)驗(yàn)的專業(yè)人員，檢測設(shè)備小巧便于攜帶，尤其適用于基層獸醫(yī)部門和養(yǎng)殖場的技術(shù)人員。