洪偉，饒鳳琴，吳昌學(xué)**，趙行行，程玉梅，張婷，齊曉嵐，禹文峰，官志忠

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室&貴州省分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 ICU，貴州 貴陽(yáng) 550004)

艱難梭菌(Clostridioidesdifficile)是一種革蘭染色陽(yáng)性且專(zhuān)性厭氧的產(chǎn)芽孢桿菌，是導(dǎo)致艱難梭菌相關(guān)性腹瀉的主要病原菌[1]，艱難梭菌感染(Clostridioiesdifficileinfection，CDI)的臨床表現(xiàn)可從輕度自限性腹瀉到可致命的偽膜性結(jié)腸炎[2-3]。正常情況下，人群腸道內(nèi)微生物處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，抗生素的使用會(huì)擾亂腸道內(nèi)微生物群落的平衡，進(jìn)而導(dǎo)致有益微生物種類(lèi)和數(shù)量減少，對(duì)艱難梭菌的阻遏效應(yīng)被解除。阻遏效應(yīng)解除后，艱難梭菌迅速占據(jù)腸道生態(tài)位，大量繁殖并產(chǎn)生毒素A(toxinA，TcdA)和毒素B(toxinB，TcdB)，這些毒素?fù)p傷腸上皮細(xì)胞、導(dǎo)致腸道炎癥，最終導(dǎo)致CDI的發(fā)生[4]。在CDI發(fā)生的過(guò)程中，艱難梭菌黏附于腸細(xì)胞，引發(fā)免疫反應(yīng)[5]。真核細(xì)胞核因子(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信號(hào)通路被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)調(diào)控細(xì)胞炎癥產(chǎn)生的主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[6-7]，研究認(rèn)為T(mén)cdA可在體外激活單核細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路[8]，用純化的艱難梭菌毒素感染巨噬細(xì)胞會(huì)激活炎癥相關(guān)通路NF-κB信號(hào)通路、且艱難梭菌毒素會(huì)引起小鼠腸道炎癥反應(yīng)[9-10]。目前尚無(wú)艱難梭菌感染人克隆結(jié)腸腺癌細(xì)胞(Caco-2)是否會(huì)引起NF-κB信號(hào)通路激活的研究報(bào)道，本研究探討艱難梭菌感染Caco-2細(xì)胞與NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)關(guān)系，為防治CDI提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基和胰酶購(gòu)自Hyclone公司，胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；革蘭染料和BHI腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自Solarbio公司，艱難梭菌純化毒素A、毒素B、兔抗IκBα、P-p65、p65、IKKα及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗均購(gòu)自Abcam公司；SuperSignal West Pico化學(xué)發(fā)光底物、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自Absin公司，細(xì)胞核熒光染料DAPI購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，PVDF膜購(gòu)自Immobilon公司，厭氧產(chǎn)氣袋購(gòu)自日本三菱公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)菌培養(yǎng) 艱難梭菌菌株由貴州醫(yī)科大學(xué)重癥監(jiān)護(hù)科患者糞便樣品分離[11]，接種于新鮮配制的BHIS培養(yǎng)基，37 ℃厭氧(80% N2，10% H2，10% CO2)培養(yǎng)48 h，生化鑒定、傳代。液體培養(yǎng)24 h后2 000 r/min、4 ℃離心10 min，收集細(xì)菌、重懸于無(wú)抗生素 DMEM 培養(yǎng)液中，紫外分光光度計(jì)測(cè)量OD600的吸光度值，將菌懸液調(diào)至1×1010CFU/L備用。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) Caco-2 細(xì)胞用10%胎牛血清細(xì)胞培養(yǎng)液(DMEM)培養(yǎng)在5% CO2，37 ℃環(huán)境，然后將Caco-2細(xì)胞鋪于6孔板或者T25培養(yǎng)瓶。

1.2.3顯微鏡觀(guān)察艱難梭菌與細(xì)胞黏附 用6孔板做細(xì)胞爬片，將Caco-2細(xì)胞鋪于6孔板，待細(xì)胞完全貼滿(mǎn)爬片時(shí)，更換新鮮培養(yǎng)基，加入艱難梭菌至感染復(fù)數(shù)(MOI=100)，分別共培養(yǎng)3、6、9、12及24 h，PBS洗2次，用甲醇于-20 ℃固定5～10 min，分別用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和革蘭染料染色，使用油鏡觀(guān)察(放大倍數(shù)100倍，每個(gè)樣本取30個(gè)視野)，單盲法計(jì)數(shù)，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.4Western blot 實(shí)驗(yàn) Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)至鋪滿(mǎn)T25培養(yǎng)瓶，倒掉培養(yǎng)基，用PBS洗2次，更換新鮮培養(yǎng)基，分別用毒素TcdA、TcdB和艱難梭菌直接感染。毒素感染處理分組如下：TcdA毒素感染Caco-2細(xì)胞組(TcdA+Caco-2組)，TcdB毒素感染Caco-2細(xì)胞組(TcdB+Caco-2組)，不加任何毒素的Caco-2細(xì)胞對(duì)照組(Caco-2 24 h組)。TcdA+Caco-2組加入終濃度為30 mg/L 的TcdA毒素蛋白，TcdB+Caco-2組加入終濃度為30 mg/L 的TcdB毒素蛋白，Caco-2 24 h組不加任何毒素，培養(yǎng)24 h；艱難梭菌直接感染分組為：艱難梭菌直接感染Caco-2組(C.difficile+Caco-2組)和不加艱難梭菌的Caco-2對(duì)照組(Caco-2 12組)。C.difficile+Caco-2組以MOI=100加入艱難梭菌感染Caco-2細(xì)胞，Caco-2組不加艱難梭菌，培養(yǎng)12 h。所有分組培養(yǎng)后，均提取蛋白，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，取20 μg蛋白樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 艱難梭菌與Caco-2黏附

艱難梭菌與細(xì)胞黏附后，分別用細(xì)胞核熒光染料DAPI染色和革蘭染色。顯微鏡觀(guān)察可見(jiàn)小桿狀的艱難梭菌和類(lèi)似卵圓形的Caco-2細(xì)胞核。見(jiàn)圖1。

未加艱難梭菌的Caco-2細(xì)胞對(duì)照組 艱難梭菌黏附于Caco-2細(xì)胞組圖1 DAPI和革蘭染色艱難梭菌與Caco-2細(xì)胞黏附情況(1 000×)Fig.1 Microscopic observation of DAPI staining and Gram staining of C. difficile adherence to Caco-2 cells

為統(tǒng)計(jì)艱難梭菌與Caco-2細(xì)胞的黏附情況，將艱難梭菌感染Caco-2細(xì)胞3 h、6 h、9 h、12 h及24 h，革蘭染色、制片，在1 000×油鏡下觀(guān)察，統(tǒng)計(jì)黏附細(xì)菌與細(xì)胞比值，見(jiàn)圖2?？梢?jiàn)感染3、6、9、12及24 h時(shí)，平均每個(gè)Caco-2 細(xì)胞上黏附的艱難梭菌個(gè)數(shù)分別為2.7、3.2、4.2、5.5及4.3。

圖2 艱難梭菌黏附Caco-2細(xì)胞 Fig.2 Clostridioides difficile adherence to Caco-2 cells

2.2 毒素A和B感染Caco-2細(xì)胞后NF-κB信號(hào)通路p65蛋白表達(dá)

用艱難梭菌毒素A和毒素B感染Caco-2細(xì)胞后，蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路磷酸化p65蛋白(P-p65)和p65總蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，TcdA和TcdB感染組P-p65蛋白均升高(P<0.05)，p65總蛋白水平降低。見(jiàn)圖3。

注：(1)與Caco-2組比較，P<0.05。圖3 艱難梭菌毒素感染Caco-2細(xì)胞對(duì)P-p65和p65表達(dá)水平的影響Fig.3 The effect of C. difficile Toxins on the expression levels of p-P65 and P65 proteins in Caco-2 cells

2.3 艱難梭菌感染Caco-2細(xì)胞后NF-κB通路P-p65、p65總蛋白、IKKα及IκBα 蛋白表達(dá)

艱難梭菌與Caco-2細(xì)胞共培養(yǎng)12 h，蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路磷酸化p65蛋白、p65總蛋白、IKKα及IκBα蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，細(xì)菌共培養(yǎng)組P-p65和IKKα均升高(P<0.05)，IκBα和p65總蛋白表達(dá)均降低(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

注：(1)與Caco-2細(xì)胞比較，P<0.05。圖4 艱難梭菌感染Caco-2細(xì)胞對(duì)P-p65、p65、IKKα及IκBα表達(dá)水平的影響Fig.4 The effect of C. difficile on the expression of P-p65, p65, IKKα and IκBα in Caco-2 cells

3 討論

近年來(lái)，艱難梭菌感染引起的腸道炎癥越來(lái)越受到研究者的關(guān)注[12-14]。偽膜性結(jié)腸炎是以艱難梭菌為病原體引起的炎癥性腸道疾病，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡[15-16]。NF-κB在機(jī)體的細(xì)胞增殖、凋亡及免疫反應(yīng)等方面起到關(guān)鍵作用。生理狀態(tài)下，NF-κB 與其抑制因子(inhibitor of kappa B，IκB)結(jié)合為復(fù)合體存在于胞質(zhì)中，處于相對(duì)休眠狀態(tài)，在細(xì)菌入侵或者其他信號(hào)刺激下，IκB 在蛋白水解酶的作用下降解，NF-κB被激活，從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，引發(fā)其他炎癥因子釋放，導(dǎo)致腸道炎癥的發(fā)生[17-18]。Batah Jameel等人發(fā)現(xiàn)艱難梭菌菌株中提取的鞭毛蛋白可通過(guò)Toll-like receptor 5(TLR5)促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞中NF-κB和MAPKs信號(hào)通路的激活[19-20]，提示了艱難梭菌的存在可能會(huì)引起腸道上皮細(xì)胞的激活。為了驗(yàn)證這一猜想，本研究首先驗(yàn)證了用TcdA和TcdB感染Caco-2細(xì)胞24 h會(huì)引起NF-κB信號(hào)通路蛋白p65磷酸化升高，總p65蛋白表達(dá)降低，提示了艱難梭菌毒素能夠激活NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)炎癥的發(fā)生。

為了驗(yàn)證艱難梭菌直接感染是否有相同的促炎作用，本研究首先建立了艱難梭菌黏附Caco-2細(xì)胞的感染模型，發(fā)現(xiàn)感染12 h黏附細(xì)菌數(shù)最多。使用免疫印跡檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路蛋白P-p65、p65、IKKα及IκBα，結(jié)果顯示，P-p65和IKKα蛋白表達(dá)增加，總p65蛋白和IκBα蛋白表達(dá)降低。當(dāng)NF-κB信號(hào)通路被激活時(shí)，激活I(lǐng)KKα，IKKα將IκBα蛋白磷酸化，使其蛋白酶體降解，IκBα表達(dá)降低，核外總p65蛋白被部分磷酸化，還有部分會(huì)入核，故P-p65蛋白表達(dá)增加，而p65總蛋白在核外表達(dá)減少[21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示了艱難梭菌直接感染Caco-2細(xì)胞可能激活NF-κB信號(hào)通路，此通路是炎癥反應(yīng)通路中很重要的一環(huán)。炎癥反應(yīng)是一把“雙刃劍”，可能使疾病更加嚴(yán)重，成為轉(zhuǎn)化為腫瘤的標(biāo)志，也可能使機(jī)體發(fā)揮免疫防御，成為清除病原體的標(biāo)志[22-23]。因此，進(jìn)一步研究艱難梭菌感染的免疫機(jī)制，對(duì)于CDI的防治提供新的參考具有重要意義。

綜上，本研究建立了艱難梭菌感染的體外模型，揭示了艱難梭菌直接感染Caco-2細(xì)胞后可上調(diào)P-p65和IKKα蛋白的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)總p65蛋白和IκBα蛋白的表達(dá)，從而激活NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)了炎癥反應(yīng)的發(fā)生。