胡 靜綜述，李章華審校

0 引 言

隨著人口老齡化和肥胖人群激增，關(guān)節(jié)軟骨退變損傷，如關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）等已成為常見的慢性疾病之一，預(yù)計(jì)到2020年OA將成為全球第4位的致殘?jiān)颍?］。OA表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨降解和結(jié)構(gòu)破壞，常年疼腫、僵硬使患者苦不堪言，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量［2］。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一類具有自我復(fù)制能力和多向分化潛能的多能干細(xì)胞，能向軟骨分化治療軟骨相關(guān)疾病已成為共識(shí)［3］。其通過旁分泌和自分泌（內(nèi)分泌）系統(tǒng)分泌多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，抑制局部免疫系統(tǒng)，參與受損組織的修復(fù)與再生［4］。外泌體是由細(xì)胞分泌的直徑為30～150nm的囊泡，內(nèi)含來源于細(xì)胞的相關(guān)蛋白質(zhì)與核苷酸等生物分子，作為通訊的媒介對(duì)細(xì)胞間的交流有非常重要的作用［5］。MSCs來源的外泌體在免疫調(diào)節(jié)作用下可有效轉(zhuǎn)運(yùn)mRNA、miRNAs和蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)，具備減少細(xì)胞凋亡、減輕炎癥反應(yīng)、促進(jìn)基質(zhì)合成和提高組織修復(fù)潛能等生物學(xué)功能［6］。眾多研究表明，攜帶miRNAs的MSCs來源外泌體在軟骨修復(fù)和再生中具有恢復(fù)細(xì)胞生物學(xué)活性、增加細(xì)胞數(shù)量和提高細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)能力的作用［7-8］。本文就攜帶miRNAs的MSCs來源外泌體在軟骨損傷退變性疾病修復(fù)與再生中發(fā)揮的作用作一綜述。

1 軟骨退變損傷治療現(xiàn)狀

軟骨退變損傷十分常見，據(jù)流行病學(xué)顯示，65歲以上中老年人群中50%以上有骨性關(guān)節(jié)炎，且隨著年齡增長(zhǎng)發(fā)病率會(huì)越來越高［9］。骨性關(guān)節(jié)炎通常是體育、娛樂活動(dòng)以及衰老致關(guān)節(jié)軟骨損傷引起的后遺癥，其特征為關(guān)節(jié)軟骨降解、半月板和韌帶退變、軟骨下骨增厚和骨贅形成，是造成中老年人骨關(guān)節(jié)疼痛和致殘的主要原因［10］。軟骨退變損傷目前尚無有效藥物治療，只能針對(duì)疼痛、腫脹和僵硬等癥狀進(jìn)行對(duì)癥處理，常見治療方法有補(bǔ)充氨基葡萄糖、口服非甾體抗炎藥、局部針灸、理療、中藥熏洗以及電刺激等［11］，但這些治療方法對(duì)軟骨退變損傷的治療效果未能盡如人意。近年來外泌體、miRNAs的研究取得了突破性的進(jìn)展，為軟骨退變損傷的修復(fù)提供了一種新思路。

2 外泌體

2.1外泌體來源最近的研究發(fā)現(xiàn)，胞外囊泡根據(jù)粒徑大小可分為外泌體、微泡和自噬小體三種細(xì)胞外載體，功能各異，外泌體大多參與生理性的調(diào)控，微囊泡則更多介導(dǎo)病理性調(diào)節(jié)，至此外泌體發(fā)展到一個(gè)新的高度［12］。相對(duì)于其他組織，骨和軟骨組織中外泌體的研究時(shí)間較短。1975年，首次在骨髓中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外膜顆粒，這表明多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞外囊泡與骨組織損傷之間可能存在聯(lián)系［13］。1979年，通過顯微鏡檢測(cè)到牙槽骨衍生的細(xì)胞外基質(zhì)囊泡，這是首次發(fā)現(xiàn)正常骨衍生的胞外囊泡［14］。1980年，通過超微結(jié)構(gòu)技術(shù)研究了成骨細(xì)胞衍生的基質(zhì)囊泡。直到21世紀(jì)初，骨髓基質(zhì)衍生的外泌體成為研究的焦點(diǎn)，其在向軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞等分化過程中起著重要的作用［15］。2017年以來，高通量、基因芯片等技術(shù)成熟，深入尋找外泌體內(nèi)含的miRNAs及其相關(guān)功能成為研究的熱點(diǎn)和前沿。

2.2外泌體的組成和功能外泌體的功能和生物學(xué)特性由其內(nèi)在的含量決定。在外泌體成分中，有脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸三種主要成分，決定外泌體的特異性并將其與其他細(xì)胞外囊泡相區(qū)分［16］。外泌體的結(jié)構(gòu)和分選很大程度上依賴于脂質(zhì)，過去的幾十年中，已對(duì)36個(gè)不同類別癌細(xì)胞的520多種脂質(zhì)進(jìn)行鑒定［17］。脂質(zhì)通常富含外泌體膜，質(zhì)膜中的主要非極性脂質(zhì)是甾醇，是來自晚期體內(nèi)高度富集的多泡體［18］。鞘磷脂是鞘質(zhì)的主要成分，在外泌體膜的構(gòu)建中發(fā)揮重要作用，還參與了貨物的分選［19］。此外，鞘磷脂還富集于膜脂筏中，神經(jīng)酰胺和二?；视偷南抡{(diào)介導(dǎo)外泌體處于平衡狀態(tài)［20］。在miRNA分選中，中性鞘磷脂酶2是第一個(gè)被認(rèn)為與該機(jī)制相關(guān)的分子；通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析，在所有哺乳動(dòng)物外泌體中發(fā)現(xiàn)了多種蛋白質(zhì)，如細(xì)胞骨架成分（微管蛋白，肌動(dòng)蛋白，cofilin，profilin）、膜聯(lián)蛋白（膜聯(lián)蛋白Ⅰ，Ⅱ，Ⅳ，Ⅴ和Ⅶ）以及GTP酶家族成員rab7和rab11等。見圖1。在外泌體蛋白質(zhì)中，細(xì)胞質(zhì)外泌體富集蛋白如Alix和TSG101，四跨膜蛋白如CD9、CD63和CD81是區(qū)分外泌體與其他細(xì)胞外顆粒的標(biāo)志物，這些蛋白質(zhì)的檢測(cè)使研究人員能夠快速評(píng)估外泌體的特征［21］。

外泌體還廣泛存在于核酸中，編碼和非編碼RNA，單鏈和雙鏈DNA均在外泌體中被發(fā)現(xiàn)。有研究顯示，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞來源的外泌體中檢測(cè)到1600個(gè)mRNA和700個(gè)miRNA，其中的miRNAs通常與細(xì)胞增殖、蛋白質(zhì)合成和RNA轉(zhuǎn)錄后修飾密切相關(guān)［22］。此外，富含miRNAs的外泌體還能激活免疫系統(tǒng)，刺激T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和樹突細(xì)胞的釋放，并參與T淋巴細(xì)胞和抗原遞送細(xì)胞之間的相互作用［23］。在腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和耐藥性的研究中發(fā)現(xiàn)，外泌體miRNAs在某些疾病中會(huì)發(fā)生特異性變異，可用于部分疾病的早期檢測(cè)診斷［24］。上述可知，外泌體miRNAs對(duì)機(jī)體的調(diào)節(jié)是多系統(tǒng)的，其發(fā)揮作用的機(jī)制尚未完全可知，是目前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

圖1 外泌體的組成與功能示意圖Figure 1 Composition and function diagram of exosomes

3 MSCs來源外泌體

MSCs是非造血基質(zhì)干細(xì)胞，具有多向分化的潛能，能夠分化為成骨細(xì)胞、肌腱細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等［25］。許多研究表明，MSCs通過自分泌和旁分泌釋放多種細(xì)胞因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子介導(dǎo)組織修復(fù)［26］。Murphy等［27］在研究MSCs對(duì)軟骨細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，人骨髓MSCs通過分泌營(yíng)養(yǎng)因子促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)合成。隨著蛋白質(zhì)分離和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)展，發(fā)現(xiàn)MSCs分泌物的種類越來越多，包括細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、外泌體和miRNAs等［28］，這些活性成份能促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化和生存，促進(jìn)軟骨生成和減少炎癥反應(yīng)［29］。MSCs來源外泌體內(nèi)含MSCs的相關(guān)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核苷酸等生物分子，在功能上延續(xù)了MSCs的特性。Zhang等［30］研究發(fā)現(xiàn)，在免疫活性大鼠軟骨缺損模型中，人胚胎MSCs源性外泌體加速了新組織的填充，增強(qiáng)Ⅱ型膠原基質(zhì)合成和硫酸化糖胺聚糖，外泌體處理的大鼠軟骨和軟骨下骨完全恢復(fù)，具有良好表面規(guī)則性的透明軟骨、與相鄰軟骨完全粘合、細(xì)胞外基質(zhì)沉積。相反，等滲鹽水治療的對(duì)照組中僅存在纖維性修復(fù)。此外，外泌體miRNAs的表達(dá)水平與關(guān)節(jié)炎高度契合，強(qiáng)大的miRNAs家族通過IL-1β、IGF、NF-κb等信號(hào)通路參與到炎癥的反應(yīng)中［31］。前述可知，MSCs源性外泌體對(duì)骨關(guān)節(jié)炎有調(diào)節(jié)作用，具體機(jī)制可能和內(nèi)含的miRNAs和相應(yīng)的通路密切相關(guān)。

4 軟骨損傷相關(guān)的miRNAs及其信號(hào)通路

4.1 miRNAs家族與軟骨損傷miRNAs是一類廣泛存在的生物基因組，參與了生命中的一系列重要過程，如早期胚胎發(fā)育，細(xì)胞增殖、凋亡、死亡和脂肪代謝等［32］。miRNAs序列、結(jié)構(gòu)和表達(dá)方式的特殊性，使其可能作為mRNAs編碼蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)因子，對(duì)基因表達(dá)、細(xì)胞周期調(diào)控等產(chǎn)生重要影響［33］。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-140在斑馬魚、小鼠等的關(guān)節(jié)軟骨中顯示出特異性高表達(dá)，并且在骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨中的表達(dá)較正常關(guān)節(jié)軟骨中的表達(dá)明顯降低，這可能和一系列的信號(hào)通路和靶基因調(diào)控有關(guān)［34］。吳松寒等［35］用木瓜蛋白酶注射膝關(guān)節(jié)腔造成SD大鼠骨性關(guān)節(jié)炎模型，同時(shí)體外用IL-1β刺激骨性關(guān)節(jié)炎的軟骨細(xì)胞模擬體外炎性環(huán)境，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-25對(duì)抑制軟骨細(xì)胞凋亡過表達(dá)明顯而對(duì)促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡表達(dá)不足。Kim等［36］發(fā)現(xiàn)，骨關(guān)節(jié)炎患者中，miR-223的表達(dá)在OA早期比正常對(duì)照組顯著升高，在OA軟骨細(xì)胞中，PEX-16顯著降低的同時(shí)miR-223表達(dá)增加；當(dāng)沉默PEX-16的表達(dá)，細(xì)胞凋亡明顯升高，同時(shí)過表達(dá)的miR-223促進(jìn)人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞死亡并加重大鼠關(guān)節(jié)軟骨的破壞。綜上所述，miRNAs家族眾多成員與軟骨退變損傷密切相關(guān)，隨著研究的深入其機(jī)制也越來越明了。

4.2 miRNAs在軟骨損傷中的信號(hào)通路miRNAs家族可特異性表達(dá)于軟骨組織中，并在OA發(fā)病進(jìn)程中起著重要作用，通過影響多條信號(hào)傳導(dǎo)通路及多種信號(hào)分子對(duì)OA的發(fā)病過程進(jìn)行調(diào)控［37］。Mao等［38］研究發(fā)現(xiàn)，外源性miRNA-95-5p過表達(dá)在軟骨的形成過程中可有效抑制組蛋白去乙?；?/8，上調(diào)軟骨表型特異基因二型膠原、sox9等。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，外泌體miRNA-95-5p可經(jīng)HDAC調(diào)節(jié)組蛋白的修飾進(jìn)而促進(jìn)軟骨形成，具體機(jī)制可能是抑制Ⅰ類HDAC來發(fā)揮作用，這在外泌體miRNA和HDACi在軟骨形成的調(diào)節(jié)上是一個(gè)新的認(rèn)識(shí)。Tao等［39］發(fā)現(xiàn)，滑膜MSCs過表達(dá)miRNA-140后來源的外泌體能夠攜帶Wnt5a和Wnt5b，Wnt5a和Wnt5b可替代Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活yes相關(guān)蛋白（yes associated protein，YAP）蛋白并增強(qiáng)軟骨細(xì)胞的增殖和遷移能力，同時(shí)減少胞外基質(zhì)分泌帶來的不良反應(yīng)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中此方法也成功阻止了大鼠模型中的OA發(fā)展。OA的進(jìn)展中，IL-1β扮演著十分重要的角色，可通過促進(jìn)軟骨細(xì)胞變性和凋亡影響OA。Ma等［40］發(fā)現(xiàn)，用白細(xì)胞介素-1β預(yù)處理軟骨細(xì)胞后，miRNA-10a-5P的表達(dá)量增加。同時(shí)熒光素酶活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，加入siRNA處理miRNA-10a-5P的同源基因HOXA1可逆轉(zhuǎn)miRNA-10a-5P抑制劑對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡的挽救作用，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)同樣證實(shí)了這一現(xiàn)象。參與軟骨退變損傷的通路還有很多，諸如NF-κB、BMP、SOX9、IGF、P53、ER等，這些信號(hào)通路在OA過程中參與調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞新陳代謝、細(xì)胞增殖、分化、凋亡，和細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解，以及炎癥反應(yīng)等過程［41］，共同組建了一個(gè)龐大的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)參與到軟骨損傷的調(diào)節(jié)中。

5 攜帶miRNAs的MSCs來源外泌體是極具優(yōu)勢(shì)的新一代軟骨損傷治療劑

綜合大量文獻(xiàn)報(bào)道來看，MSCs治療疾病具有廣泛的適應(yīng)證，關(guān)節(jié)軟骨退變損傷是其中之一。雖然MSCs還未被批準(zhǔn)用于人體試驗(yàn)，但在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已廣泛用于軟骨損傷的治療［42］。MSCs治療存在時(shí)間、濃度和生物活性衰退等問題，一經(jīng)干預(yù)產(chǎn)生不良反應(yīng)時(shí)不能被立即清除［43］。但外泌體不同，MSCs來源外泌體耐受性較直接用MSCs好，且具有最小的免疫源性和毒性風(fēng)險(xiǎn)［43］。Wang等［44］研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)比滑膜MSCs和胚胎MSCs來源外泌體作用于手術(shù)造成的小鼠內(nèi)側(cè)半月板不穩(wěn)模型。結(jié)果顯示，外泌體組ColⅡ上調(diào)明顯，ADAMTS5和蛋白聚糖下調(diào)較單純EMSC明顯。體內(nèi)還證實(shí)了外泌體在炎性微環(huán)境中通過影響胞外基質(zhì)的合成與降解來治療骨關(guān)節(jié)炎，同時(shí)SO染色結(jié)果也支持外泌體組優(yōu)于單純細(xì)胞組。MSCs來源外泌體富含大量miRNAs，能夠調(diào)控多條軟骨合成分解代謝重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，這些miRNAs在介導(dǎo)MSCs源性外泌體的功效中發(fā)揮重要作用，如miRNA-140、miRNA-92等可通過調(diào)節(jié)軟骨增值和軟骨形成來治療軟骨損傷［45］。Tao等［39］通過miRNA-140過表達(dá)MSCs，來源外泌體激活YAP蛋白促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和表行維持，且純化的外泌體所需的量更小，免疫原性和癌變可能較單純細(xì)胞小。促炎細(xì)胞因子等快速上調(diào)可導(dǎo)致基質(zhì)降解和軟骨損傷，MSCs來源外泌體可調(diào)節(jié)受損軟骨區(qū)域的炎性環(huán)境，是重要的軟骨再生治療手段［46］。此外，MSCs外泌體的蛋白質(zhì)組富含生物化學(xué)活性管理酶，可恢復(fù)體內(nèi)平衡到最重要的活動(dòng)細(xì)胞和組織微環(huán)境。MSCs來源外泌體通過細(xì)胞間交流釋放生物活性因子促進(jìn)膠原合成、抑制凋亡、刺激細(xì)胞增殖和傳遞免疫調(diào)節(jié)信號(hào)，招募或重組組織修復(fù)和再生所需要的細(xì)胞［47］。綜上，MSCs來源外泌體含多種miRNAs，相互之間經(jīng)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮治療作用，目前是軟骨損傷最具前景的治療方式。

6 結(jié) 語

多年來，細(xì)胞釋放的雙層磷脂膜囊泡不被認(rèn)為具有生物學(xué)意義，隨著細(xì)胞外囊泡（外泌體或EV）作為生物活性分子載體被識(shí)別，改變了人們的看法。這些細(xì)胞釋放的載體可攜帶細(xì)胞相關(guān)的貨物傳遞到局部或遠(yuǎn)處目標(biāo)并執(zhí)行特定的生物學(xué)功能，隨著各類型的細(xì)胞外囊泡鑒定及生物學(xué)功能、貨物裝載、釋放途徑、靶向機(jī)制和囊泡加工復(fù)雜性升級(jí)，該領(lǐng)域的維度已經(jīng)擴(kuò)展［48］。MSCs來源外泌體在包括軟骨組織在內(nèi)的許多組織中均有修復(fù)和再生作用，近年來分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展解密了更多miRNAs的功效，攜帶miRNAs的MSCs來源外泌體在軟骨損傷修復(fù)極具前景。但是用于臨床還有一些問題亟待解決，如胞外囊泡尺寸的多樣性怎么規(guī)范，不同尺寸具有不同的生物學(xué)功能，介導(dǎo)的細(xì)胞——細(xì)胞通信系統(tǒng)遠(yuǎn)超出現(xiàn)有認(rèn)識(shí)；胞外囊泡是一起發(fā)揮作用還是各個(gè)間協(xié)同作用還不得而知，需要開發(fā)一種單囊泡分析工具進(jìn)一步研究［49］。綜上所述，外泌體在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用極具前景，但還有一系列問題尚需深入研究。