吳 元，張文濤，馬文超，王瑞良，郭亞東，劉 濟(jì)，毛士玉，張俊峰，姚旭東

0 引 言

膀胱癌是最常見的泌尿系惡性腫瘤之一，全球范圍內(nèi)在新發(fā)惡性腫瘤中居第10位，在男性新發(fā)惡性腫瘤中居第6位，在男性腫瘤死亡率中居第9位［1］。臨床中70%～75%的新發(fā)膀胱癌為非肌層浸潤(rùn)性，經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)輔助術(shù)后膀胱灌注化療為其主要治療方案，然而該類患者5年復(fù)發(fā)率高達(dá)50%～70%，且有10%～15%會(huì)進(jìn)展為肌層浸潤(rùn)性膀胱癌。肌層浸潤(rùn)性膀胱癌約占每年新發(fā)膀胱癌的25%左右，其5年腫瘤特異性生存率僅50%左右［2，3］。因此篩選新的膀胱腫瘤生物學(xué)標(biāo)志物，對(duì)膀胱癌預(yù)防，診斷及治療有重要意義。

DNA啟動(dòng)子甲基化異常是表觀遺傳學(xué)改變重要形式之一，與膀胱腫瘤的發(fā)生，發(fā)展有密切關(guān)系［4］。SOX7是SOX家族之一，參與多種發(fā)育過程，包括造血［5］、心血管生成［6］、內(nèi)胚層分化［7］、肌衛(wèi)星細(xì)胞生成［8］等。最近研究表明其在腎癌［9］、肺癌［10］、乳腺癌［11］、前列腺癌［12］等作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮抑癌作用，并受到啟動(dòng)子甲基化的調(diào)控。在膀胱癌中SOX7發(fā)揮的作用具體機(jī)制仍不明確。本研究采用甲基化特異性PCR技術(shù)檢測(cè)膀胱癌患者尿中SOX7基因甲基化情況，并研究去甲基化藥物5-氮雜-2′脫氧胞苷（5-aza-dc）對(duì)膀胱癌細(xì)胞系的影響。

1 資料與方法

1.1數(shù)據(jù)庫(kù)分析GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析TCGA和GTEx項(xiàng)目中的9736個(gè)腫瘤和8587個(gè)正常樣本的RNA測(cè)序表達(dá)數(shù)據(jù)。包含33種惡性腫瘤。用于分析尋找腫瘤組織和正常組織中差異表達(dá)的基因，本研究中選擇使用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)。Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)收集729個(gè)基因數(shù)據(jù)集，90000多個(gè)癌癥組織和正常組織的樣本數(shù)據(jù)。本研究中設(shè)置的檢索條件：①Analysis type：“carcinoma vs normal analysis”；②設(shè)定條件：“Under-expression”。從Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選基因，選擇SOX7基因后，設(shè)定條件為：“Gene SOX7”，余條件同前。

MethHC數(shù)據(jù)庫(kù)包括18個(gè)人類癌癥、6548個(gè)芯片和12 567個(gè)RNA的超過6000個(gè)樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)。在MethHC數(shù)據(jù)庫(kù)中，選擇“BLCA”，在“gene search”中輸入“SOX7”，在“gene region”中選擇“promoter”（https：//methhc.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php）。cBioPortal（http：//www.cbioportal.org）整合了126個(gè)腫瘤基因組研究的數(shù)據(jù)，涵蓋了28 000例標(biāo)本數(shù)據(jù)，此外部分樣品還包括臨床預(yù)后的信息。在網(wǎng)站中選擇“bladder cancer”，“TCGA”，“tumor sample with methylation data”，“SOX7”，在結(jié)果中選擇“survival”。

1.2臨床資料收集2017年1月至10月在上海市第十人民醫(yī)院泌尿外科40份尿液標(biāo)本。其中膀胱癌患者20例，正常對(duì)照20例。新鮮的尿液標(biāo)本立即在液氮中迅速冷凍，保存于-80℃。本研究獲得上海市第十人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：2019-k-113），患者均簽署知情同意書。

1.3細(xì)胞及試劑人膀胱癌移行細(xì)胞株（T24，UMUC3，J82，5637）及人永生化尿路上皮細(xì)胞（SVHUC-1）均購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、轉(zhuǎn)染試劑Lipifectin3000購(gòu)自美國(guó)life technologies公司。胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gemini公司。甲基化酶抑制劑5-氮雜-2'脫氧胞苷（5-aza-2'deoxycytidine，5-aza-dc）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。CCK-8試劑盒購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司。SOX7抗體購(gòu)自美國(guó)R&D公司，ACTIN，GAPDH，Bcl2、Bax、Cleaved Caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白，羊抗兔二抗，驢抗羊二抗均購(gòu)自美國(guó)Abcam。

1.4方法

1.4.1患者尿液甲基化特異性PCR 取50 mL尿液，4℃、3000轉(zhuǎn)/min，離心15 min，留沉淀?xiàng)壣锨逵肈NA提取。運(yùn)用自動(dòng)核酸提取儀采用磁珠法進(jìn)行核酸提取，經(jīng)裂解與亞硫酸氫鹽的轉(zhuǎn)化并純化。用甲基化特異性PCR進(jìn)行擴(kuò)增，最后將擴(kuò)增出的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳條帶的結(jié)果分析目的基因甲基化狀態(tài)。甲基化引物序列：F，5'-GTTTTGGACGTCGAGTTGTC-3'，R，5'-AACC-CAAACCATAAAAACGTT-3'。非甲基化引物：F，5'-GGTTTTGGATGTTGAGTTGTTG-3'R，5'-CTTAACCCAA-ACCATAAAAACATT-3'。PCR反應(yīng)條件：95℃，預(yù)變性10 min，1個(gè)循環(huán)；94℃，變性，45 s，53℃（甲基化）/57℃（非甲基化），退火45 s，72℃，延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。

1.4.2膀胱癌細(xì)胞系培養(yǎng)及5-aza-da處理用含有10%胎牛血清、雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)及傳代，在6孔板上進(jìn)行鋪板。細(xì)胞密度達(dá)到30%～40%，5-aza-dc組T24細(xì)胞中加入含有5-aza-dc的培養(yǎng)基，使其藥物濃度分別為10、20 μmol/L，對(duì)照組T24細(xì)胞加入同體積的DMSO。連續(xù)處理3 d，每天更換新鮮配置的藥物。

1.4.3膀胱癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)染SOX7質(zhì)粒膀胱癌細(xì)胞在6孔板上鋪板，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)30%～40%，按照轉(zhuǎn)染試劑Lipifectin3000說明書進(jìn)行操作，轉(zhuǎn)染SOX7質(zhì)粒（Ubiquitin 3FLAG GFP IRES-Puromycin，購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因公司）為質(zhì)粒組，轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒為空載組。

1.4.4 Western blot 每孔加入60 μg蛋白樣品，電泳后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜中，5%脫脂奶粉封閉60 min，4℃冰箱中孵育一抗16～20 h，TBST洗滌5次，二抗孵育60 min，顯影曝光。

1.4.5 CCK8實(shí)驗(yàn)采用CCK-8試劑檢測(cè)細(xì)胞的增殖速率。在96孔板上以每孔1000個(gè)細(xì)胞的密度接種，細(xì)胞貼壁后，用5-aza-dc連續(xù)處理5 d，每天更換新鮮配置的藥物。每孔加入10 μL的CCK-8試劑，37℃培養(yǎng)箱孵育2 h，2 h后用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm的吸光度。

1.4.6平板克隆實(shí)驗(yàn)采用平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性。在6孔板上鋪板，每孔細(xì)胞數(shù)量為1000個(gè)。細(xì)胞貼壁后，每天更換含有5-aza-dc藥物的培養(yǎng)基。當(dāng)培養(yǎng)7～10 d，6孔板中肉眼可見克隆形成時(shí)，停止培養(yǎng)。

1.4.7細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)在6孔板上鋪板，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)30%～40%時(shí)，更換含有5-aza-dc培養(yǎng)基，連續(xù)處理5 d，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)90%～95%，用胰蛋白酶消化，轉(zhuǎn)移至流式管中，加入400 μL的結(jié)合緩沖液混勻后，與PI和Annexin V-FITC反應(yīng)后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)庫(kù)中的Kaplan-Meie曲線采用Log Rank法分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD法；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SOX7在數(shù)據(jù)庫(kù)中的表達(dá)情況TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)和Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中可以發(fā)現(xiàn)SOX7在膀胱癌中的表達(dá)下調(diào)，見圖1。MethHC數(shù)據(jù)庫(kù)中，SOX7有1個(gè)轉(zhuǎn)錄本（NM_031439），其在膀胱癌組織中甲基化水平明顯高于正常組織（P＜0.005）。通過cBioPortal結(jié)果可得，SOX7高甲基化的患者無進(jìn)展生存期較低甲基化患者明顯降低（P＜0.05）。見圖2。

2.2 SOX7在膀胱癌患者的尿液中甲基化水平膀胱癌患者尿液中15例（75%）SOX7甲基化水平增高，而正常人尿液中僅7例（35%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 SOX7基因在不同膀胱癌細(xì)胞株中的表達(dá)Western blot結(jié)果顯示，與SV-HUC-1細(xì)胞株相比，SOX7蛋白在T24、UMUC3、J82、5637細(xì)胞株中表達(dá)均顯著降低（P＜0.05）。見圖3。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株選擇T24細(xì)胞。

圖1 SOX7基因在數(shù)據(jù)庫(kù)中的表達(dá)情況Figure 1 The expression of SOX7 gene in database

圖2 數(shù)據(jù)庫(kù)中膀胱癌SOX7基因甲基化及預(yù)后情況Figure 2 Methylation and prognosis of bladder cancer SOX7 gene in the database

圖3 SOX7基因在膀胱癌中的表達(dá)情況Figure 3 SOX7 gene expression in bladder cancer cell lines

2.4過表達(dá)SOX7質(zhì)粒及5-aza-dc處理后SOX7蛋白的表達(dá)上調(diào)5-aza-dc組SOX7蛋白的表達(dá)量較對(duì)照組上調(diào)，當(dāng)濃度達(dá)到20 μmol/L時(shí)，SOX7蛋白表達(dá)量相對(duì)較高。因此選擇5-aza-dc的濃度為20 μmol/L為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度。質(zhì)粒組SOX7蛋白表達(dá)量較空載組上調(diào)明顯，見圖4。

圖4 5-aza-dc及轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后SOX7的表達(dá)Figure 4 SOX7 expression increased after 5-aza-dc treatment and after plasmid transfection

2.5過表達(dá)SOX7質(zhì)粒及5-aza-dc處理后T24細(xì)胞的增殖能力CCK-8結(jié)果顯示，第5天，5-aza-dc組A值較對(duì)照組顯著降低（P＜0.05）；質(zhì)粒組A值較空載組明顯降低（P＜0.05）?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，5-azadc組每孔克隆形成數(shù)［（167.33±13.65）個(gè)］較對(duì)照組［（328.00±20.81）個(gè)］明顯下降（P＜0.05）。質(zhì)粒組每孔克隆形成數(shù)［（136.00±15.00）個(gè)］較空載組［（280.67±13.43）個(gè)］明顯下降（P＜0.05）。見圖5。

圖5 5-aza-dc處理和轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后T24細(xì)胞的增殖能力Figure 5 The ability of cell proliferation decreased after 5-aza-dc treatment and plasmid transfection

2.6過表達(dá)SOX7質(zhì)粒及5-aza-dc處理T24細(xì)胞的凋亡流式細(xì)胞儀凋亡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，5-aza-dc組T24細(xì)胞的凋亡率（27.89%）較對(duì)照組（3.79%）明顯升高（P＜0.05）；質(zhì)粒組細(xì)胞凋亡率（21.28%）較空載組（9.90%）明顯增高（P＜0.05）。見圖6。 Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，5-aza-dc組Bcl2蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，Bax、Cleaved Caspase-3表達(dá)上調(diào)明顯。質(zhì)粒組Bcl2蛋白較空載組表達(dá)明顯下調(diào)，Bax、Cleaved Caspase-3表達(dá)上調(diào)明顯。見圖7。

圖6 5-aza-dc處理和轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后細(xì)胞凋亡情況Figure 6 Apoptosis after 5-aza-dc treatment and plasmid transfection

圖7 5-aza-dc處理和轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后凋亡蛋白表達(dá)情況Figure 7 Expression of apoptotic proteins after 5-aza-dc treatment and transfection of plasmids

3 討 論

本研究中，通過數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證了膀胱癌中SOX7基因高甲基化，SOX7基因低表達(dá)，并且SOX7基因高甲基化可能影響膀胱癌的預(yù)后。而通過40例尿液檢測(cè)，驗(yàn)證了在膀胱癌中SOX7基因甲基化水平高表達(dá)，膀胱癌細(xì)胞系蛋白Western blot檢測(cè)結(jié)果表明SOX7基因在膀胱癌中低表達(dá)。Bca細(xì)胞中SOX7基因的高甲基化狀態(tài)可被5-aza-dc誘導(dǎo)去甲基化。通過Western blot實(shí)驗(yàn)可以驗(yàn)證當(dāng)5-aza-dc濃度達(dá)到20 μmol/L時(shí)，SOX7蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)，通過CCK-8實(shí)驗(yàn)，平板克隆實(shí)驗(yàn)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了SOX7基因高甲基化被逆轉(zhuǎn)后，SOX7蛋白表達(dá)升高后，抑制了膀胱癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)了膀胱癌細(xì)胞的凋亡。同時(shí)通過轉(zhuǎn)染過表達(dá)SOX7質(zhì)粒，進(jìn)一步證明SOX7的高表達(dá)與膀胱癌細(xì)胞的增殖和凋亡相關(guān)。由此我們可以得出SOX7基因在膀胱癌中發(fā)揮重要作用，而其啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化可能是其表達(dá)沉默的機(jī)制之一。

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)修飾的重要形式之一，其主要表現(xiàn)為富含CPG島的啟動(dòng)子區(qū)域甲基化，通過啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化阻礙啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合，從而阻礙基因的轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄水平下降［13］。研究表明，SOX7基因在多種腫瘤中的表達(dá)水平與基因的啟動(dòng)子甲基化水平相關(guān)。Wang等［9］報(bào)道在腎透明細(xì)胞癌中，SOX7基因的表達(dá)受其啟動(dòng)子甲基化水平調(diào)控，并通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮作用。Kostroma等14］報(bào)道在急性髓系白血病SOX7通過啟動(dòng)子甲基化與Wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)生拮抗作用。Xu等15］報(bào)道SOX7甲基化對(duì)骨髓異常增生綜合征的預(yù)后不良，并且與白血病的進(jìn)展相關(guān)。而SOX7基因在膀胱癌中的表達(dá)及啟動(dòng)子甲基化情況報(bào)道較少。本研究首次通過大樣本基因數(shù)據(jù)庫(kù)，患者尿液標(biāo)本，膀胱癌細(xì)胞系從不同角度闡述了SOX7及其甲基化狀態(tài)對(duì)膀胱癌的影響。

DNA甲基化作為腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中非常重要的進(jìn)程［16-17］。因此，基因甲基化狀態(tài)可能作為一個(gè)重要的診斷標(biāo)志物。膀胱作為儲(chǔ)尿器官，通過檢測(cè)尿液中基因的甲基化水平能一定程度上反應(yīng)膀胱的狀態(tài)。有研究通過檢查尿液的一些基因的甲基化狀態(tài)，如 BCL2，CDKN2A，NID2，TWIST1，GDF15，TMEFF2等，可以用于早期診斷膀胱癌，且敏感性高于尿脫落細(xì)胞學(xué)［18-20］。另有研究證實(shí)通過檢測(cè)一組基因的啟動(dòng)子CPG島甲基化狀態(tài)，可以作為膀胱癌進(jìn)展的預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物［21-22］。因此，SOX7啟動(dòng)子甲基化可能是膀胱癌的診斷和預(yù)后的潛在標(biāo)志物。

細(xì)胞中存在不同狀態(tài)甲基化DNA，如在TPC1細(xì)胞株中CITED1基因［23］，通過改變基因啟動(dòng)子甲基化的程度，進(jìn)而影響基因的表達(dá)，因此，在膀胱癌或癌前病變時(shí)通過去甲基化處理，很有可能對(duì)膀胱癌的治療及預(yù)防發(fā)揮積極的作用。5-aza-dc作為一種去甲基化藥物，已有用于腫瘤治療的研究［24］，在膀胱癌中是否發(fā)揮作用及其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示SOX7在膀胱癌低表達(dá)，其表達(dá)受啟動(dòng)子甲基化調(diào)控，是膀胱癌的潛在生物學(xué)標(biāo)志，在膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究還存在不足：樣本偏少，沒有患者的隨訪資料，另外SOX7在膀胱癌中的調(diào)控機(jī)制不明，因此需進(jìn)一步的探討SOX7在膀胱癌中的調(diào)控機(jī)制。