徐依人，劉鵬飛，賈慧敏，高 昳，王芳軍，沈衛(wèi)東，李騰飛

0 引 言

食管癌早期診斷率低、預(yù)后不良等特征成為了健康的巨大威脅［1-2］。目前確診食管癌以胃鏡檢查與病理結(jié)果為主，臨床上與食管癌相關(guān)的血清篩查指標(biāo)較少，主要包括鱗狀細(xì)胞癌抗原（serum squamous cell carcinoma antigen，SCC）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）。然而，單一指標(biāo)診斷價(jià)值有限［3-4］。故需要更高靈敏的篩查指標(biāo)以提高食管癌檢出率。

泛素（ubiquitin，UB）是一種可共價(jià)結(jié)合并修飾細(xì)胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)的小分子蛋白［5］。有研究表明，UB在結(jié)腸癌［6］、宮頸癌［7］及肝癌［8］等多種腫瘤組織中異常高表達(dá)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)UB基因在肺癌細(xì)胞中明顯高表達(dá)，下調(diào)UB的表達(dá)可促進(jìn)肺癌細(xì)胞的凋亡，從而抑制其增殖，并提高放射敏感性［9］。然而目前UB在食管癌中的表達(dá)情況及功能尚不明確。本研究以血清UB為切入點(diǎn)，研究其在食管鱗癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）中的表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性，為ESCC的診斷提供參考。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象選取2018年2月至2019年5月我院收治的88例ESCC患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：均經(jīng)病理學(xué)檢查確診為食管癌；均未接受過放療、化療及靶向治療；女性均為非妊娠期。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤；合并自身免疫系統(tǒng)疾??；合并嚴(yán)重肝功能不全；合并精神類疾病。88例ESCC患者中，男71例、女17例，平均（67.36±0.97）歲。臨床分期根據(jù)內(nèi)鏡檢查、影像學(xué)檢查、術(shù)后病理結(jié)果等，按照AJCC第八版指南綜合判定。結(jié)果顯示，本組納入Ⅰ期16例，男12例、女4例，平均年齡（71.44±2.68）歲；Ⅱ期24例，男19例，女5例，平均年齡（67.79±2.13）歲；Ⅲ期31例，男25例，女6例，平均年齡（65.55±1.43）歲；Ⅳ期17例，男15例，女2例，平均年齡（66.24±1.60）歲。ESCC患者均于治療前采集外周血標(biāo)本，并收集ESCC患者的SCC、CEA等臨床資料。另選取同時(shí)期在南通大學(xué)附屬江陰醫(yī)院進(jìn)行食管癌篩查的40例胃鏡下無明顯異常者作為對(duì)照組，其中男33例、女7例，平均（65.25±0.85）歲，胃鏡檢查后采集外周血標(biāo)本。本研究通過南通大學(xué)附屬江陰醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)［批件號(hào)：（2018）倫審研第（002）號(hào)］，受試者均簽署知情同意書。

1.2血清UB、SCC、CEA水平測定抽取患者晨起空腹靜脈血5 mL，靜置20 min后以3000×g離心力離心5 min，分離血清，收集后置于-80℃冰箱內(nèi)保存。采取ELISA法檢測血清UB水平。試劑盒（Human Ubiquitin ELISA Kit）由武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司提供，按試劑盒說明說進(jìn)行檢測，主要步驟包括：稀釋樣品、酶標(biāo)板孵育、生物素化抗體孵育、洗滌、酶結(jié)合物抗體孵育、洗滌、底物反應(yīng)、終止反應(yīng)、酶標(biāo)儀450 nm處檢測A值。采取電化學(xué)發(fā)光法測定SCC與CEA。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prism7.0、SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（xˉ± s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)值間比較采用單因素方差分析。采用Logistic回歸建立聯(lián)合檢測新變量，并繪制ROC曲線。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1血清UB在ESCC患者中表達(dá)ESCC患者與對(duì)照組年齡、性別間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。UB 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［（41.96±3.273）ng/mL vs（80.86±7.99）ng/mL，P＜0.05］。

2.2血清UB與ESCC患者臨床病理特征關(guān)系88例ESCC患者中，男性患者血清UB表達(dá)水平高于女性患者，年齡＜60歲患者血清UB表達(dá)水平高于年齡≥60歲患者，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0737、P=0.4118）。腫瘤不同位置、腫瘤局部浸潤程度與血清UB表達(dá)水平間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.4214、P=0.081）。伴淋巴轉(zhuǎn)移患者血清UB水平與無淋巴轉(zhuǎn)移患者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0165）。TNM分期為Ⅲ-Ⅳ期患者血清UB水平顯著高于Ⅰ-Ⅱ期患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。見表1。

2.3診斷ESCC效能比較血清UB單獨(dú)診斷ESCC的靈敏度和ROC曲線下面積均大于SCC與CEA，兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）；三者單獨(dú)診斷ESCC的特異度相近，兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。UB、SCC、CEA對(duì)應(yīng)最大約登指數(shù)處 Ct值分別為 46.65、1.25、2.85。對(duì)血清 UB、SCC、CEA蛋白水平進(jìn)行Logistic回歸，得到各組預(yù)測因子回歸模型Y=1/［1+EXP（截距+BUB×UB+BSCC×SCC+BCEA×CEA）］，最終得到一個(gè)新指標(biāo)Y代表聯(lián)合檢測。結(jié)果顯示聯(lián)合指標(biāo)診斷ESCC的靈敏度為76.1%、特異度為72.5%，ROC曲線下面積為0.795（95%CI：0.714～0.875），AUC值明顯高于各指標(biāo)單獨(dú)診斷。見圖1，表2。

表1 本組食管鱗癌患者血清UB與ESCC臨床病理特征的關(guān)系（ng/mL）Table 1 Associationbetween serum UB and clinicopathological characteristics of ESCC patients（ng/mL）

圖1 UB、SCC、CEA聯(lián)合診斷ESCC的ROC曲線Figure 1 ROC curve estimating combined detection performance in the diagnosis of ESCC

表2 UB、SCC、CEA以及三者聯(lián)合診斷ESCC的效能比較Table 2 The effectiveness of UB,SCC,CEA and the three combined diagnosis of ESCC

3 討 論

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)參與幾乎所有的細(xì)胞調(diào)控過程，如細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖與分化、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)調(diào)控等［10］。在多種良性及惡性腫瘤組織中，如結(jié)腸癌［6］、宮頸癌［7］、肝癌［8］等，可發(fā)現(xiàn)UB過表達(dá)。最近一項(xiàng)研究顯示，通過下調(diào)泛素基因UBB的表達(dá)，在若干體外培養(yǎng)的細(xì)胞株中，尤其是對(duì)乳腺癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞具有促進(jìn)凋亡作用［11］。同時(shí)Shirahashi等［6］研究表明，UB 在結(jié)腸癌組織中表達(dá)水平與腫瘤浸潤深度、血液及淋巴管轉(zhuǎn)移相關(guān)。除可在組織中檢測到UB外，正常血清中也包含低水平的UB［12］。在個(gè)體受到外傷、多種自身免疫性疾病時(shí)，血清UB水平會(huì)顯著增高2～30倍［13-14］。Zhang J等［15］研究顯示，血清UB會(huì)引起腫瘤標(biāo)志物的上調(diào)以及免疫細(xì)胞數(shù)量的減少，從而降低腫瘤細(xì)胞的凋亡率，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。此外，Steagall R J等［16］發(fā)現(xiàn)血清UB通過增加血管調(diào)控因子VEGF-A和MMP-2的蛋白表達(dá)水平，導(dǎo)致微血管的增生，從而形成有利于腫瘤生長的微環(huán)境。尹博等［17］研究證實(shí)，食管癌血清中確實(shí)有較高的VEGF水平，且與食管癌淋巴轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)。因此推測血清UB與食管癌存在密不可分的聯(lián)系。

本研究采用ELISA法發(fā)現(xiàn)ESCC患者血清UB水平明顯高于對(duì)照組，從而推斷UB可能與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。在食管癌變的過程中腫瘤細(xì)胞會(huì)向血液釋放更多的游離UB。通過分析UB與ESCC臨床特征的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平與患者年齡、性別、腫瘤位置、浸潤深度無關(guān)，而在淋巴轉(zhuǎn)移、TNM分期中差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ⅲ-Ⅳ期患者血清UB水平與Ⅰ-Ⅱ期患者相比呈現(xiàn)跨越式增長，這說明UB與食管癌的進(jìn)展密切相關(guān)，故可作為一項(xiàng)預(yù)測腫瘤惡性程度的指標(biāo)。

本研究中UB單獨(dú)檢測ESCC的靈敏度為65.9%，特異度為70.0%，靈敏度明顯高于SCC與CEA，特異度略低于兩者。結(jié)合AUC結(jié)果提示UB作為篩查指標(biāo)整體上優(yōu)于SCC與CEA。CEA作為消化系統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物，其外周血濃度易受肝臟降解影響［4，18］。SCC存在于鱗癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，對(duì)于宮頸癌的檢測敏感性較高［19］，其次為肺鱗狀細(xì)胞癌、食管鱗癌［20］。腫瘤指標(biāo)SCC、CEA在診斷ESCC時(shí)，實(shí)驗(yàn)臨界值低于臨床臨界值，考慮與樣本量范圍較局限有關(guān)。UB、SCC、CEA聯(lián)合診斷ESCC時(shí)，靈敏度上升至76.1%，特異度為72.5%，在不影響特異度的同時(shí)，明顯提高了食管癌的檢出率，優(yōu)于既往研究中其他聯(lián)合指標(biāo)的診斷率［21-22］。

本研究也存在不足之處。研究時(shí)間較短；未能納入患者的治療及預(yù)后情況；缺乏UB與食管癌患者的治療、預(yù)后之間的關(guān)系。這些將在今后的研究中加以明確。

綜上所述，血清UB與食管癌的進(jìn)展密切相關(guān)。其簡單、便捷、快速、高靈敏度的特點(diǎn)在食管癌的篩查診斷中具有較高的臨床價(jià)值。其上游調(diào)控基因在后續(xù)研究中是否可作為食管癌的潛在治療靶點(diǎn)值得進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)。