郭 剛，李長文，王文輝，陳 良

0 引 言

神經(jīng)病理性疼痛（neuropathic pain，NP）是由中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或病變引起的一種慢性疼痛［1-2］，該病嚴(yán)重影響患者的日常生活、睡眠及社會活動(dòng)，也是限制癌癥化療劑量與進(jìn)程的關(guān)鍵因素［3］，由于病程長、治療難等給患者帶來了很大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和生活壓力［4］。目前由于NP的發(fā)病機(jī)制的不明確性與復(fù)雜性，對于NP缺乏積極有效的治療［5］，所以探討維持疼痛狀態(tài)的分子和細(xì)胞機(jī)制及積極有效的治療方法具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元活動(dòng)誘導(dǎo)的Wnt信號刺激疼痛神經(jīng)回路中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的表達(dá)［6］；WNT/β-catenin 信號通路參與了疼痛反應(yīng)過程［7］。同時(shí)神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生與神經(jīng)炎癥的發(fā)生發(fā)展有很大的關(guān)系［8-9］，因此阻斷維持疼痛狀態(tài)的WNT/β-catenin信號通路及抗炎治療是緩解NP的關(guān)鍵思路。目前NP主要用西藥阿片類和右美托咪定等止痛抗炎類藥物［10-12］，但是西藥的不良反應(yīng)大且價(jià)格昂貴，給患者帶來很大的身體與經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，不適合長期使用。傳統(tǒng)中藥具有藥食同源的優(yōu)勢且不良反應(yīng)小，雷公藤甲素（triptolide）是由傳統(tǒng)中草藥衛(wèi)矛科植物雷公藤的根、葉、花及果實(shí)中提取，具有抗炎和免疫抑制作用［13-14］，治療NP的報(bào)道不多且機(jī)制尚不明確；脈沖射頻廣泛應(yīng)用于治療各種條件下神經(jīng)疼痛［15-16］，但是脈沖射頻治療具有效率低、鎮(zhèn)痛時(shí)間短等缺點(diǎn)［17］，將脈沖射頻與藥物抗炎鎮(zhèn)痛聯(lián)合使用是否可延長鎮(zhèn)痛時(shí)間，提高鎮(zhèn)痛效率，降低藥物使用劑量和由此帶來的副作用，是治療神經(jīng)病理性疼痛的一個(gè)新突破點(diǎn)。因此，本研究將雷公藤甲素與脈沖射頻聯(lián)合應(yīng)用于治療SNL大鼠，探索治療效果，并通過檢測Wnt/βcatenin信號通路和相關(guān)炎性因子的變化，從而闡明雷公藤甲素、脈沖射頻治療法單獨(dú)治療及兩者聯(lián)合治療3種方法的治療效果及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器雷公藤甲素（38748-32-2，Med-ChemExpress）；RIPA裂解液（P0013B，Beyotime，中國江蘇）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（P0010，Beyotime）、增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑（P0018，Beyotime）、PVDF膜（HVHP29325，Merck Millipore）、SDS-PAGE凝膠試劑盒（P0012A，Beyotime）；兔抗 GAP-43多克隆抗體（ab12274，Abcam）；兔抗iNOS多克隆抗體（ab15323，Abcam）；兔抗COX-2多克隆抗體（ab15191，Abcam）；Trizol（9109，Takara）；PrimeScript TM RT reagent Kit with gDNA Eraser（RR047A，Takara）；SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（RR820L，Takara）。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組健康8周齡SD雄性大鼠，135只，體重180～200 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號：SCK（甘）2015-0001，采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為5組：假手術(shù)組、模型組、雷公藤甲素組、脈沖射頻組、聯(lián)合治療組，每組27只。

1.3方法

1.3.1大鼠脊神經(jīng)結(jié)扎（spinal nerve ligation,SNL）模型建立將假手術(shù)組、模型組、雷公藤甲素組、脈沖射頻組、聯(lián)合治療組的大鼠麻醉后沿L4-S1棘突做后正中偏右切口，暴露橫突的根部，用彎成直角的針頭向頭端插入孔內(nèi)。當(dāng)針頭觸及DRG或神經(jīng)根可引起同側(cè)后肢肌肉輕微抽動(dòng)，退出針頭。結(jié)扎神經(jīng)，縫合，腹腔連續(xù)3 d注射青霉素。假手術(shù)組除不進(jìn)行背根神經(jīng)結(jié)結(jié)扎外，其余操作同其他組。

1.3.2干預(yù)治療雷公藤甲素組術(shù)后第1天開始（SNL當(dāng)天視第0天）進(jìn)行藥物［雷公藤甲素，100 μg/（kg.d）］和脈沖射頻組給予脈沖射頻治療［在背根神經(jīng)結(jié)扎近端（距線結(jié)5 mm處］脈寬20 ms、頻率500 kHz，脈沖頻率2 Hz，溫度42℃，持續(xù)時(shí)間8 min。假手術(shù)組與模型組給予等量等滲鹽水灌胃。

1.3.3機(jī)械痛閾測量所有大鼠在造模前1d及術(shù)后第1、3、5、7、14天給藥或/和脈沖射頻干預(yù)治療2 h后，對各組大鼠進(jìn)行機(jī)械縮足反應(yīng)閾值（mechanical withdrawal threshold，MWT）。每只大鼠每次檢測3次，記下數(shù)值后求其均值，每次間斷開5 min。

1.3.4樣品采集各組大鼠SNL術(shù)后3、7、14 d行為能力測試結(jié)束后，各組取6只大鼠麻醉后處死，快速而準(zhǔn)確的切取各組大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglio，DRG）的L4-6節(jié)段，立即置于液氮中凍存用于Western blot及PCR檢測。另取3只大鼠麻醉后，開胸經(jīng)左心室插管進(jìn)入主動(dòng)脈根部，剪開右心耳，灌注PBS沖盡血液，然后采用4℃，4%多聚甲醛300 mL灌注固定1 h。取L4-6節(jié)段背根神經(jīng)節(jié)，用于免疫組化檢測。

1.3.5RT-PCR檢測取收集到的DRG，采用Trizol法提取DRG中總RNA。并將RNA濃度統(tǒng)一稀釋至500 ng/mL，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA作為模板，擴(kuò)增Wnt-3α、β-catenin及內(nèi)參GAPDH基因。擴(kuò)增引物序列如下：GAPDH 5'-3'AGGGCTGCTTTTAACTCTGGT，5'-3'CCCCACTTGATTTTGGAGGGA；Wnt-3α 5'-3'GTCTCGTGGCTGGGTGGA，5'-3'GGGCTCGCAGAAGTTAGGTC；βcatenin 5'-3'GGTGAAAATGCTTGGGTCG，5'-3'TGAAGGCAGTCTGTCGTAATAGC。循環(huán)條件：94℃ 4 min，94℃ 20 s，94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃30 s，35個(gè)循環(huán)。其中在72℃30 s階段中獲取數(shù)據(jù)進(jìn)行熔解曲線分析反應(yīng)結(jié)束后，由儀器自帶軟件計(jì)算出Ct值并給出定量結(jié)果。計(jì)算基因的相對表達(dá)量F=2-△△Ct，公式如下：

1.3.6Western blot檢測取收集到的DRG，向DRG中加入200 μL蛋白裂解液（含1 mmol/L PMSF），置冰上20 min后4℃、離心半徑6.2 cm，12 000 r/min離心15 min，取上清液。用BCA測定蛋白濃度后調(diào)節(jié)至統(tǒng)一濃度。取20 μg蛋白樣品（12%SDS-PAGE，5% 脫脂奶粉；90 V，轉(zhuǎn)膜 60 min）室溫封閉1 h，一抗4℃孵育過夜兔抗iNOS和COX-2多克隆抗體，TBST洗膜3次，10 min/次，二抗室溫孵育1 h（二抗：山羊抗兔1∶8000），TBST洗膜3次，10 min/次，用Western blot印跡法觀察并進(jìn)行半定量分析。條帶采用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.3.7免疫組化檢測取收集到的DRG，將DRG放入4℃4%多聚甲醛中固定6 h，再放入30%蔗糖4℃過夜，然后將組織包埋成石蠟塊，切片、爬片、脫臘后按照免疫組化試劑盒進(jìn)行免疫組化。在倒置顯微鏡下觀察GAP-43蛋白表達(dá)情況。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ± s）表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)分析，方差不齊時(shí)用Dunnett's方法分析，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1機(jī)械痛閾測定行為測試結(jié)果顯示，假手術(shù)組MWT隨時(shí)間無明顯變化，其他各組MWT在術(shù)后持續(xù)下降，后出現(xiàn)回升；聯(lián)合治療組下降幅度最小，而上升幅度最大。與假手術(shù)組相比，其他各組MWT在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)均降低（P＜0.05）。雷公藤甲素組、脈沖射頻組、聯(lián)合治療組術(shù)后MWT均高于模型組（P＜0.05），聯(lián)合治療組術(shù)后MWT顯著高于雷公藤甲素組和脈沖射頻組（P＜0.05）。見圖1。

2.2 RT-PCR檢測與假手術(shù)組造模后3、7、14 d相比，模型組、雷公藤甲素組、脈沖射頻組、聯(lián)合治療組Wnt-3α、β-catenin mRNA表達(dá)量均顯著升高（P＜0.05）；與模型組造模后3、7、14 d相比，雷公藤甲素組、脈沖射頻組、聯(lián)合治療組Wnt-3α、β-catenin mRNA表達(dá)量降低（P＜0.05），見表1。

圖1 機(jī)械痛閾值評估大鼠行為Figure 1 Mechanical withdrawal threshold（MWT）test to evaluation animal behavioral

2.3Western blot檢測與模型組相比，在造模第14天后，雷公藤甲素組、脈沖射頻組、聯(lián)合治療組iNOS和COX-2蛋白的表達(dá)隨著治療時(shí)間的增長而顯著降低（P＜0.05），其中在同一時(shí)間下聯(lián)合組比雷公藤甲素組和脈沖射頻組下降幅度大。與假手術(shù)組相比，模型組iNOS和COX-2蛋白的表達(dá)均顯著升高，并具有時(shí)間依賴性，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2、圖3。

2.4免疫組化檢測GAP-43陽性表達(dá)為棕黃色顆粒，術(shù)后3d雷公藤甲素組、脈沖射頻組及聯(lián)合治療組，GAP-43陽性表達(dá)染色較深較多，模型組GAP-43陽性表達(dá)較弱。與假手術(shù)組相比，模型組GAP-43蛋白相對表達(dá)量明顯升高，并隨時(shí)間的增長逐漸升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組相比，各治療組GAP-43蛋白相對表達(dá)量隨著治療時(shí)間的增長而顯著升高，其中在同一時(shí)間下（在造模第14 d）聯(lián)合治療組比雷公藤甲素組和射頻治療組升高幅度大。見圖4、圖5。

圖2 脊髓背根神經(jīng)節(jié)中iNOS蛋白的相對表達(dá)量Figure 2 The relative expression of iNOS in dorsal root ganglion

1：假手術(shù)組；2：模型組；3：雷公藤甲素組；4：脈沖射頻組；5：聯(lián)合治療組與假手術(shù)組相比，#P＜0.05；與模型組相比，*P＜0.05、**P＜0.01

表1 脊髓背根神經(jīng)節(jié)中Wnt-3α、β-catenin mRNA的相對表達(dá)量（xˉ± s，n=27）Table1 The relative expression of Wnt-3α,β-catenin mRNA in dorsal root ganglion（xˉ± s，n=27）

圖4 鏡下觀察脊髓背根神經(jīng)節(jié)中GAP-43蛋白的表達(dá)（免疫組化染色×400）Figure 4 The relative expression of GAP-43 in dorsal root ganglion（IHC ×400）

圖5 脊髓背根神經(jīng)節(jié)中GAP-43蛋白表達(dá)的比較（×400）Figure 5 The relative expression of GAP-43 in dorsal root ganglion（×400）

3 討 論

神經(jīng)病理性疼痛（neuropathic pain，NP）是化療最常見的副作用，這種副作用是一種可導(dǎo)致化療停止的嚴(yán)重病理事件［18］，該病因其病因復(fù)雜疼痛程度嚴(yán)重，給患者帶來極大的痛苦與生存壓力［19-21］，目前全世界約有1.0～5.6億人受到NP的困擾［19］，影響社會的穩(wěn)定，因此研究NP的機(jī)制與治療方案具有重要的意義。讓NP患者避免長期服用鎮(zhèn)痛藥產(chǎn)生的不良反應(yīng)和改善生活質(zhì)量，聯(lián)合用藥是近年來比較有效的治療NP的途徑［22］，本研究在前人的研究基礎(chǔ)上構(gòu)建SNL大鼠NP模型，觀察雷公藤甲素聯(lián)合脈沖射頻法治療對Wnt/β-catenin信號通路及其炎性因子的影響。

研究發(fā)現(xiàn)MWT能準(zhǔn)確地反映機(jī)械痛敏感性的變化，Liu等［23］通過建立SD大鼠神經(jīng)性疼痛模型，發(fā)現(xiàn) miR-155靶基因表達(dá)影響 MWT，Antal等［24］將部分坐骨神經(jīng)結(jié)扎小鼠全身暴露于非均勻靜磁場下，發(fā)現(xiàn)可以抑制在神經(jīng)性疼痛保持對機(jī)械性刺激的較高敏感性。本研究通過脊神經(jīng)結(jié)扎使大鼠MWT值顯著降低，并隨時(shí)間的增加MWT值持續(xù)維持在較低的水平，采用雷公藤甲素、脈沖射頻法以及雷公藤甲素聯(lián)合脈沖射頻法干預(yù)一段時(shí)間后，均可阻止并逆轉(zhuǎn)SNL大鼠MWT值的持續(xù)較低水平，但聯(lián)合治療組效果明顯高于其他組，提示雷公藤甲素與脈沖射頻法聯(lián)合治療對大鼠NP的緩解作用優(yōu)于雷公藤甲素和脈沖射頻法單獨(dú)治療。雷公藤甲素是一個(gè)具有多種生物活性的天然產(chǎn)物，具有抗氧化、抗類風(fēng)濕、抗老年性癡呆癥、抗癌及消炎止痛等功效，而神經(jīng)炎癥是導(dǎo)致神經(jīng)病理性疼痛形成的關(guān)鍵因素［25］。

進(jìn)一步的本研究發(fā)現(xiàn)各治療組的iNOS和COX-2蛋白均隨著治療時(shí)間的增長而逐漸降低，其中雷公藤甲素聯(lián)合脈沖射頻治療組的下降幅度最大，提示聯(lián)合治療組對大鼠脊神經(jīng)結(jié)扎后神經(jīng)疼痛與炎癥具有很好的治療效果；而GAP-43蛋白隨著治療時(shí)間的增長而逐漸升高，其中雷公藤甲素聯(lián)合脈沖射頻治療組的上升幅度最大，提示聯(lián)合治療組能更好的促進(jìn)神經(jīng)元發(fā)育和再生。這種下降與升高均表現(xiàn)出時(shí)間依賴性，提示雷公藤甲素聯(lián)合脈沖射頻療法對炎性因子的治療效果顯著，同時(shí)能顯著的促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生，但作用機(jī)制尚不明確。

隨著研究日漸深入，證實(shí)Wnt/β-catenin信號通路在神經(jīng)病理性疼痛炎癥的形成和維持中具有重要作用［26］，本研究發(fā)現(xiàn)與模型組相比，各治療組Wnt-3α和β-catenin mRNA表達(dá)量均隨時(shí)間增長而顯著下降，其中在同一時(shí)間下聯(lián)合治療組下降幅度最大，提示雷公藤甲素與脈沖射頻法聯(lián)合治療對大鼠神經(jīng)病理性疼痛的治療效果優(yōu)于雷公藤甲素和脈沖射頻法單獨(dú)治療。Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是一條在生物進(jìn)化中極為保守的通路，但是當(dāng)細(xì)胞外Wnt信號被激活后，Wnt信號分子與細(xì)胞膜上特異性受體Frizzled蛋白結(jié)合，使β-catenin在胞質(zhì)中積累起來。β-catenin的積累抑制下游蛋白質(zhì)復(fù)合物（β-catenin降解復(fù)合物）的表達(dá)，而這些蛋白復(fù)合物可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)信號分子β-catenin的降解。此外，當(dāng)“β-catenin降解復(fù)合物”被抑制后，Wnt/β-catenin信號通路轉(zhuǎn)為活化狀態(tài)。以上提示，雷公藤甲素聯(lián)合脈沖射頻法可能通過調(diào)節(jié)frizzled相關(guān)蛋白的功能，使其與Wnt競爭性地同Wnt受體Frizzled結(jié)合，從而拮抗Wnt信號，當(dāng)Wnt信號失活后β-catenin被磷酸化，導(dǎo)致β-catennin降解，達(dá)到治療SNL大鼠神經(jīng)痛的作用。

綜上所述，雷公藤甲素與脈沖射頻法聯(lián)合治療大鼠NP的治療效果優(yōu)于雷公藤甲素和脈沖射頻法單獨(dú)治療，即聯(lián)合治療對SNL大鼠Wnt/β-catenin信號通路及炎性因子的影響效果優(yōu)于單獨(dú)治療，提示聯(lián)合治療對神經(jīng)炎癥具有更強(qiáng)的緩解作用及促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的再生，為臨床治療NP提供新的思路。