于明明，謝 卓，金 華，王乾興

0 引 言

月經(jīng)周期的規(guī)律與否對(duì)女性的生殖健康影響很大［1］。在婦科臨床上，某些特殊情況下（如參加高考、體育比賽等）需要對(duì)月經(jīng)周期進(jìn)行人工調(diào)節(jié)［2］。黃體酮作為參與女性內(nèi)分泌的孕激素，對(duì)調(diào)整月經(jīng)周期起著重要作用。孕酮雖然可以推遲月經(jīng)發(fā)生，但具有一定時(shí)效性，即月經(jīng)發(fā)生中存在一個(gè)可為孕酮調(diào)控的關(guān)鍵生理時(shí)期，作用機(jī)制知之甚少，利用動(dòng)物模型來進(jìn)行月經(jīng)發(fā)生機(jī)制的解析顯得很有必要。作為生物醫(yī)學(xué)常用的模式動(dòng)物，小鼠也可人工誘導(dǎo)出月經(jīng)樣變化，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，小鼠月經(jīng)發(fā)生也存在一個(gè)可為孕酮回植逆轉(zhuǎn)的關(guān)鍵時(shí)期，即為孕酮撤退后12～16 h，在孕酮撤退后12 h回植孕酮可以逆轉(zhuǎn)月經(jīng)的發(fā)生，而16 h回植則無法阻止子宮內(nèi)膜的崩解［3］。但具體機(jī)制尚不明確。

研究表明，人月經(jīng)期中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）相關(guān)蛋白真核起始因子2α（eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α）及轉(zhuǎn)錄激活因子4（activating transcriptionfactor 4，ATF4）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異性凋亡信號(hào)C/EBP同源蛋白（C/EBP-homologous protein，CHOP）表達(dá)增加，且可被孕酮拮抗劑米非司酮所逆轉(zhuǎn)［4-8］。提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所致的eIF2α相關(guān)信號(hào)可能在月經(jīng)發(fā)生和孕酮對(duì)其的調(diào)控中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。為探索體內(nèi)情況下孕酮是如何調(diào)控上述信號(hào)表達(dá)的，本研究利用生理性孕酮撤退的小鼠月經(jīng)模型進(jìn)行孕酮回植實(shí)驗(yàn)，全面探索小鼠月經(jīng)發(fā)生的關(guān)鍵時(shí)期前后回植孕酮對(duì)小鼠月經(jīng)發(fā)生過程中ERS所致的自噬關(guān)鍵信號(hào)通路成員表達(dá)的調(diào)控情況，為解析月經(jīng)發(fā)生機(jī)制及臨床月經(jīng)調(diào)控的時(shí)機(jī)選擇提供理論支持。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑SPF級(jí)8～10周齡雌性健康C57BL/6J小鼠，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2016-002，光照周期12 h，自由進(jìn)食和攝水，（21±1）℃控溫。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得遵義醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。雌二醇和孕酮分別購自英國(guó)Alfa Aesar公司和美國(guó)Sigma公司；兔抗PERK、CHOP、鼠抗ATF4多抗和鼠抗GADPH單抗購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；兔抗p-PERK、p-eIF2α、eIF2α、Caspase12多抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；IgG二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)開發(fā)公司；所有引物均由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成，序列分別為：PERK（F：GAGATCTGGCTCAAAGACGAAA；R：AAGGAGCTATGACTTCGATCTG）、eIF2α（F：GTCTCAGACCCATCTATCTTGG；R：CATACCTGGGTGGAGCTATTAG）、ATF4（F：GACCGAGATGAGCTTCCTGAACAG；R：CCGCCTTGTCGCTGGAGAACCACC）、CHOP （F：CTCCAGATTCCAGTCAGAGTTC； R： ACTCTGTTTCCGTTTCCTAGTT） 、 Caspase12 （F： TGGCCCATGAATCACATCTAAT； R： TGGACAAAGCTTCAGTGTATCT）、GAPDH （F：TGGTGAAGACGCCAGTGGA；R：GCACCGTCAAGGCTGAGAAC）；RNAiso Plus、real-time PCR試劑盒均購自日本TAKARA公司。

1.2模型建立及孕酮回植參考本課題組前期工作進(jìn)行［1］。將30只C57BL/6J雌鼠在乙醚麻醉下行雙側(cè)卵巢去除術(shù)。小鼠術(shù)后恢復(fù)1周以清除體內(nèi)雌孕激素。連續(xù)3 d在09：30皮下注射雌二醇100 ng，第7天皮下注射50 ng孕酮同時(shí)埋置孕酮皮埋管（1 g/mL孕酮花生油懸濁液填充硅膠管，兩端用乳膠封閉，使其功能長(zhǎng)度為1 cm），并在7～9 d 09：30皮下注射雌二醇5 ng。在第9天11：00，乙醚麻醉下將20 μL花生油注入小鼠的子宮腔中以誘導(dǎo)小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化，49 h后移除孕酮皮埋管，記為孕酮撤退后0 h。將小鼠隨機(jī)數(shù)字表法分為12 h回植組、16 h回植組和未回植組，每組10只，分別在孕酮撤退后12 h（12 h回植組）和16 h（16 h回植組）回植孕酮皮埋管，未回植組則不進(jìn)行回植，各組小鼠均在孕酮撤退后24 h處死，收集雙側(cè)子宮角，等滲鹽水沖洗后液氮速凍或中性甲醛固定待用。

1.3 qPCR檢測(cè)RNAiso Plus試劑盒提取小鼠全子宮總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度后取2 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，20 μL體系進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s、95℃變性5 s、60℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，以2-△△Ct表示目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.4 Western blot檢測(cè)取小鼠全子宮100 mg，加入1 mL混合液（按100份組織裂解液、1份PMSF、1份蛋白酶抑制劑、1份蛋白磷酸酶抑制劑配制）裂解組織提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取40 μg蛋白上樣，80 V恒壓電泳，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，一抗4℃孵育過夜（濃度：t-PERK、p-PERK、t-eIF2α 為 1：1000；p-eIF2α、ATF4 為1：1500；CHOP為1：800；Caspase12為1：2000；GAPDH 為1：5000）。洗膜后二抗常溫孵育2 h，ECL發(fā)光，Image Pro Plus軟件進(jìn)行條帶分析。

1.5免疫組化法檢測(cè)小鼠全子宮經(jīng)10%中性甲醛過夜，石蠟包埋后3 μm層厚連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟、水化后高壓法修復(fù)抗原，一抗（p-PERK、ATF4、Caspase12濃度為1∶100；p-eIF2α濃度為1∶150；CHOP濃度為1∶50）4℃過夜。PBS洗片后，二抗37℃孵育30 min。DAB顯色后用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，梯度乙醇脫水后二甲苯透明，中性樹膠封固后光鏡下觀察。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prime6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示。組間兩兩比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，以P≤0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1小鼠子宮組織中PERK、eIF2α、ATF4的表達(dá)16 h回植組和未回植組PERK、eIF2α和ATF4 mRNA表達(dá)均明顯低于12 h回植組（P＜0.05），且未回植組明顯低于16 h回植組（P＜0.05）。各組總PERK（t-PERK）和總eIF2α（t-eIF2α）蛋白表達(dá)強(qiáng)度相似；但12 h回植組磷酸化形式（p-PERK、p-eIF2α蛋白）明顯高于16 h回植組和未回植組（P＜0.05）。見表1、表2，圖1。p-PERK、p-eIF2α和ATF4 蛋白均表達(dá)于子宮內(nèi)膜基底層與蛻膜化基質(zhì)細(xì)胞交界處基質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)。其中16 h回植組染色強(qiáng)度弱于12 h回植組，主要見于蛻膜化的基質(zhì)細(xì)胞；未回植組則僅在基質(zhì)細(xì)胞中呈散在的弱陽性染色。見圖2。

2.2小鼠子宮組織中CHOP和Caspase12的表達(dá)與12 h回植組相比，16 h回植組和未回植組CHOP、Caspase12 mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05），且未回植組高于16 h回植組（P＜0.05）。見表1、表2，圖1。CHOP和Caspase12蛋白主要表達(dá)于蛻膜化的基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，16 h回植組和未回植組染色強(qiáng)度明顯升高，且未回植組強(qiáng)于16 h回植組。見圖3。與12 h回植組比較，*P＜0.05；與16 h回植組比較，#P＜0.05

表1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與凋亡基因mRNA的表達(dá)變化(xˉ±s)Table 1 mRNA expression of ERS and apoptosis genes(xˉ±s)

表2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與凋亡蛋白的表達(dá)變化(xˉ±s)Table 2 Protein expression of ERS and apoptosis(xˉ±s)

圖1 相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)的變化Figure 1 Protein expression by Western blot

圖2 鏡下觀察p-PERK、p-eIF2α和ATF4蛋白的原位表達(dá)（免疫組化染色）Figure2 In situ expression of p-PERK，p-eIF2α and ATF4 in mouse uterus（IHC染色）

圖3 鏡下觀察CHOP和Caspase12蛋白的原位表達(dá)（免疫組化染色）Figure 3 Insitu expression of CHOPand Caspase12 in mouse uterus（IHC染色）

3 討 論

月經(jīng)周期貫穿于女性的整個(gè)生育期，月經(jīng)規(guī)律與否直接影響其生活質(zhì)量［9］。月經(jīng)發(fā)生機(jī)制的闡明，可為經(jīng)血過多過少、痛經(jīng)等疾病的治療及月經(jīng)周期的干預(yù)提供新的策略和思路。

目前認(rèn)為月經(jīng)發(fā)生存在由血管外周細(xì)胞（孕酮受體陽性）介導(dǎo)的可逆階段和白細(xì)胞（孕酮受體陰性）介導(dǎo)的不可逆階段，在前一階段補(bǔ)充孕酮可阻斷子宮內(nèi)膜的崩解［10］，因而推測(cè)月經(jīng)發(fā)生存在一個(gè)可為孕酮逆轉(zhuǎn)的關(guān)鍵時(shí)期。這已在恒河猴和小鼠模型中得到了證實(shí)［3-11］。但目前并不清楚孕酮是通過什么信號(hào)調(diào)控子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的生存或死亡的。自噬是一個(gè)維持真核細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的、具有復(fù)雜調(diào)控機(jī)制的分解代謝過程［12］。生理狀況下，細(xì)胞通過基礎(chǔ)水平的自噬清除受損的蛋白質(zhì)或細(xì)胞器而維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。自噬缺陷小鼠會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤折疊或受損蛋白的累積［13］。自噬參與人類月經(jīng)發(fā)生已見零星報(bào)道［14］，但尚缺乏系統(tǒng)、全面的研究。蛋白激酶RNA樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase RNA-like ER kinase，PERK）是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白，其活性受到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的一種分子伴侶——葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78）調(diào)節(jié)［13］。正常情況下PERK與GRP78結(jié)合而缺乏活性；當(dāng)發(fā)生ERS時(shí)，可特異性觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR），此時(shí) PERK 與GRP78分離，發(fā)生自身磷酸化而快速激活［15-16］，從而磷酸化eIF2α，下調(diào)蛋白合成的整體水平，減輕UPR來維持細(xì)胞生存；但當(dāng)ERS加劇時(shí)，eIF2α也可通過另外一條信號(hào)通路上調(diào) ATF4［5］，ATF4 可直接上調(diào)CHOP表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［17］。本研究通過在月經(jīng)發(fā)生關(guān)鍵時(shí)期前（12h）、后（16h）回植孕酮，將其與未回植組小鼠進(jìn)行比較，分析小鼠子宮中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的自噬和凋亡信號(hào)表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：雖然各組PERK和eIF2α的總蛋白表達(dá)沒有明顯變化，但在mRNA水平、活性形式的蛋白（p-PERK、p-eIF2α）及ATF4的表達(dá)均表現(xiàn)為以12 h回植組、16 h回植組和未回植組的順序依次遞減，而凋亡信號(hào)的表達(dá)則依次遞增。提示在月經(jīng)發(fā)生關(guān)鍵時(shí)期之前的12h回植孕酮，可以有效維持小鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞的自噬作用并抑制凋亡作用，保持小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的存活；關(guān)鍵時(shí)期之后的16回植孕酮，則只能部分起到維持自噬作用并抑制凋亡作用。其機(jī)制可能是：在12 h回植孕酮，可以有效維持p-PERK/p-eIF2α/ATF4表達(dá)，阻斷ERS的加劇，使小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞能及時(shí)清除累積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的異常蛋白質(zhì)而維持存活；而16 h回植孕酮，則可能在月經(jīng)發(fā)生12～16 h這一時(shí)期中，因ERS的進(jìn)一步加劇，大部分子宮內(nèi)膜細(xì)胞已經(jīng)難以清除異常蛋白質(zhì)的累積，轉(zhuǎn)而啟動(dòng)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異的凋亡信號(hào)CHOP和Caspase12的表達(dá)，因而添加孕酮已無法改變應(yīng)激造成的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的損傷，子宮內(nèi)膜將難以避免地走向崩解脫落。需要注意的是，PERK、eIF2α的mRNA的變化趨勢(shì)與其磷酸化蛋白的表達(dá)趨勢(shì)一致而與總蛋白表達(dá)趨勢(shì)不符，其原因可能是這兩種蛋白的活性調(diào)節(jié)可能并不體現(xiàn)在翻譯水平，而是體現(xiàn)在對(duì)其翻譯后水平上的快速磷酸化上［18-20］。綜上所述，在月經(jīng)發(fā)生關(guān)鍵時(shí)期前回植孕酮，可以阻斷小鼠月經(jīng)發(fā)生的進(jìn)程，其可能機(jī)制是通過維持小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中ERS誘導(dǎo)的自噬信號(hào)通路PERK/eIF2α/ATF4表達(dá)并抑制凋亡關(guān)鍵信號(hào)CHOP和Caspase12表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的，其詳細(xì)的分子機(jī)制還需在今后研究中進(jìn)一步的明確。