尉 娜，常耀輝，路 坦

0 引 言

脊髓缺血再灌注損傷（spinal cord ischemia-reperfusion injury，SCII）是一種特殊類型的脊髓損傷，一旦出現(xiàn)，給患者和家庭帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)，因此尋找一條理想的治療SCII的方案是研究重點(diǎn)［1］。本課題組在前期的研究中已經(jīng)證明了脂氧素A4（Lipoxin A4，LXA4）可以通過抑制炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡方面對大鼠脊髓損傷起到了保護(hù)作用，認(rèn)為LXA4可以作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)劑［2］。細(xì)胞自噬是存在于真核細(xì)胞生物中特有的現(xiàn)象，是一種機(jī)體內(nèi)部的適應(yīng)性機(jī)制，在受到外界的刺激，如缺氧、應(yīng)激、營養(yǎng)缺失等情況下，通過溶酶體吞噬降解受損的細(xì)胞器及大分子物質(zhì)等，達(dá)到維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)，起到保護(hù)細(xì)胞的作用，又被認(rèn)為是一種“自食（self-eating）”現(xiàn)象［3-4］。本實(shí)驗(yàn)擬通過檢測細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白在3組模型中脊髓組織的表達(dá)，研究細(xì)胞自噬在脂氧素A4治療大鼠缺血再灌注損傷模型中的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物48只成年雄性SD大鼠，體重180～220 g，雌雄不限，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度24℃，相對濕度50%，保持通風(fēng)，自由食水。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑及儀器脂氧素A4購自美國Cayman公司，Anti-LC3 B antibody購自美國Abcam公司，抗γ-氨基丁酸受體A相關(guān)蛋白（γ-aminobutyric acid type A receptor associated protein，GABARAP）、antibody購自美國Abcam公司，PVDF轉(zhuǎn)印膜購自美國Merck Millipore公司，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Merck Millipore公司，RIPA裂解液、PMSF、BCA蛋白定量試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司，多功能全波長掃描酶標(biāo)儀購自美國Thermo Multiskan公司，倒置顯微鏡購自日本Nikon公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1構(gòu)建大鼠脊髓缺血再灌注損傷模型將48只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為LXA4組、缺血再灌注組、假手術(shù)組，每組16只。假手術(shù)組大鼠只暴露腹主動脈，其他兩組大鼠平臥于實(shí)驗(yàn)臺上，無菌消毒鋪無菌巾后，腹正中線切口，暴露腹主動脈，仔細(xì)游離左腎動脈開口上端水平及左、右髂總動脈分叉水平的腹主動脈，無創(chuàng)動脈夾夾閉腹主動脈上、下端，完全阻斷血流30 min后放開，確認(rèn)遠(yuǎn)端恢復(fù)血流后逐層關(guān)腹。術(shù)中尾靜脈注射肝素鹽水抗凝，用烤燈維持體溫。術(shù)后肌注青霉素預(yù)防感染，正常進(jìn)食水。LXA4組：在關(guān)腹后30 min脊髓鞘內(nèi)注射10 μL LXA4（300 pmol）［2］；缺血再灌注組：在關(guān)腹后 30 min脊髓鞘內(nèi)注射等滲鹽水（0.1 mL/kg）；假手術(shù)組：不注射藥物。

1.2.2 LC3B熒光染色3組大鼠分別于各組處理24 h分別處死，取L2-L5脊髓節(jié)段經(jīng)切片后經(jīng)相同固定液在4℃固定過夜，石蠟固定。切片于二甲苯中進(jìn)行脫蠟，隨后切片分別浸泡在100%、95%、70%的乙醇中進(jìn)行水化，取出后使用去離子水沖洗切片，然后浸泡在抗原修復(fù)工作液中修復(fù)10 min，等冷卻后用PBS洗3次，再加入封閉液室溫封閉30 min，加入一抗，4℃避光過夜，取出后PBS液沖洗3遍，加入稀釋后二抗的室溫避光孵育1 h，將含DAPI的封片劑加到載玻片上，蓋上蓋玻片，室溫避光靜置10 min，封固后4℃保存待檢。使用激光共聚焦顯微鏡對切片進(jìn)行觀察。LC3B在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，呈現(xiàn)綠色，細(xì)胞核由DAPI染色成藍(lán)色，綠色和藍(lán)色熒光共同定位的是自噬陽性細(xì)胞。每張切片在10×10倍視野下隨機(jī)選取6個(gè)視野，對綠色和藍(lán)色共同定位的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，即為自噬陽性細(xì)胞數(shù)。

1.2.3 Western blot檢測脊髓組織的脂氧素受體（FPR2/ALX）蛋白的表達(dá)大鼠分別于再灌注24 h后處死并取出腰段脊髓，加入預(yù)冷的裂解液，充分研磨后離心半徑13.5 cm，13 000 r/min，4℃離心10 min，取上清，轉(zhuǎn)移至新的離心管中置于冰上待用。依照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的蛋白濃度，將上樣緩沖液放入等量蛋白樣品中，97℃加熱6 min變性，室溫冷卻離心后上樣。采用電轉(zhuǎn)儀將蛋白從分離膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜完成后，取出PVDF膜，將PVDF膜放入封閉液（TBST或5%脫脂牛奶）中，室溫封閉30 min。加入一抗（用封閉液稀釋），室溫孵育1 h或4℃雜交過夜。加入適當(dāng)比例稀釋的二抗，室溫孵育1 h，取等體積混合均勻的ECL中的A、B液，滴在PVDF膜上，孵育1 min后暗室顯影。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示。多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 LC3B的熒光染色缺血再灌注組（399.80±18.46）和 LXA4組（240.80±12.76）的 LC3B 陽性細(xì)胞數(shù) 較 假手術(shù)組（73.40±19.42）明顯升高（P＜0.05），LXA4組較缺血再灌注組陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.05）。見圖1。

2.2 Western blot檢測LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、GABARAP蛋白的表達(dá)缺血再灌注組及LXA4組大鼠的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、GABARAP的表達(dá)較對照組明顯增高（P＜0.05）；與缺血再灌注組比較，LXA4組脊髓組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ明顯下降（P＜0.05），但GABARAP的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2、圖3。

圖1 鏡下觀察各組LC3B陽性細(xì)胞數(shù)量（×100）Figure 1 LC3B fluorescence staining of three groups（×100）

圖2 各組大鼠脊髓組織的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達(dá)Figure 2 The LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ expression of spinal cord in three groups

圖3 Western blot檢測各組大鼠脊髓組織中GABARAP蛋白的表達(dá)Figure 3 The GABARAP expression of spinal cord in three groups

3 討 論

細(xì)胞自噬既是一種正常生理過程，也是疾病的發(fā)生和發(fā)展中的重要一環(huán)［5］，細(xì)胞自噬對于機(jī)體維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)是一把“雙刃劍”，一方面，自噬過程可以清除受損細(xì)胞器和異常蛋白的作用，起到維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的作用，即促存活機(jī)制［6］；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)過度的細(xì)胞自噬超出了維持穩(wěn)態(tài)的極限［7-9］，過度清除了正常的細(xì)胞器，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，即“自噬性程序性壞死”。目前細(xì)胞自噬對于機(jī)體的作用及機(jī)制仍存在著爭議，需研究人員深入的研究和探討。大量研究表明細(xì)胞自噬也在神經(jīng)系統(tǒng)中起到重要作用。譬如中樞神經(jīng)退行性疾病的主要病理生理特點(diǎn)是蛋白質(zhì)的異常蓄積或者異常蛋白質(zhì)的發(fā)生，細(xì)胞自噬可以幫助機(jī)體清除異常蓄積的蛋白質(zhì)或異常蛋白質(zhì)，避免這些蛋白質(zhì)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成的損傷［10-11］。在中樞神經(jīng)損傷方面，有研究體外培養(yǎng)腦神經(jīng)元細(xì)胞［12］，給予氧糖剝離24 h后體外模擬缺血缺氧狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡明顯增加，給予一種細(xì)胞自噬抑制劑（3-甲基腺嘌呤，3-MA）處理后可以明顯減輕神經(jīng)元損傷，因此認(rèn)為細(xì)胞自噬在中樞系統(tǒng)損傷中也存在著作用。

如何檢測細(xì)胞自噬現(xiàn)象是研究自噬的基礎(chǔ)，目前常用的細(xì)胞自噬檢測主要分為靜態(tài)檢驗(yàn)和動態(tài)檢驗(yàn)。靜態(tài)檢驗(yàn)?zāi)壳皯?yīng)用較為廣泛是檢測細(xì)胞自噬相關(guān)基因（autophagy related gene，Atg），在哺乳動物中，Atg6、8研究最多，其中常用的Atg6蛋白包括了Beclin-1蛋白，而Atg8包括了微管相關(guān)蛋白3（Microtubule-associated protein light chain3，LC3）、γ-氨基丁酸受體A相關(guān)蛋白（γ-aminobutyric acid type A receptor associated protein，GABARAP）等。LC3是已知的唯一一種與吞噬泡膜、自噬體膜和自噬溶酶體膜均有關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)。在哺乳動物中，LC3均分為LC3A、LC3B、LC3C 3種亞型，而每一種亞型均有Ⅰ、Ⅱ兩種形式，但只有LC3B被證明與細(xì)胞自噬有關(guān)［13］。當(dāng)發(fā)生細(xì)胞自噬時(shí)，LC3B-Ⅰ與自噬體膜表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合成膜結(jié)合形式，即為自噬體相關(guān)形式LC3B-Ⅱ，LC3B-Ⅱ位于自噬體膜上，其含量多少可以用于檢測自噬體的數(shù)量［14］，LC3B-Ⅰ向LC3B-Ⅱ的轉(zhuǎn)化是介導(dǎo)自噬體形成的重要步驟［15］，因此LC3B-Ⅰ與LC3B-Ⅱ的比值可以反映LC3B-Ⅰ向LC3B-Ⅱ動態(tài)變化的過程。本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)給與LXA4后LC3B-Ⅱ陽性細(xì)胞數(shù)量較缺血再灌注組明顯下降。但細(xì)胞自噬是一種高度動態(tài)的過程，而通過免疫熒光檢測LC3B-Ⅱ標(biāo)記陽性細(xì)胞數(shù)量僅僅為靜態(tài)檢測過程，只是反應(yīng)在一個(gè)特定時(shí)間點(diǎn)上的自噬體形成的情況，為了能動態(tài)觀察細(xì)胞自噬的過程，本研究應(yīng)用Western blot檢測LC3B-Ⅱ和LC3B-Ⅰ蛋白含量的比值，發(fā)現(xiàn)在SCII發(fā)生時(shí)自噬流發(fā)生，而給與LXA4后自噬流收到抑制。

GABARAP是另一種酵母Atg8的哺乳類同族，是GABAA受體結(jié)合蛋白，相對分子質(zhì)量為16 000。最近的研究發(fā)現(xiàn)GABARAP與LC3一樣具有與自噬體結(jié)合的能力［16］。在 Hironori等［17］研究中，體外培養(yǎng)脊髓運(yùn)動神經(jīng)元細(xì)胞，并給予缺血再處理，發(fā)現(xiàn)了缺血再處理是細(xì)胞自噬發(fā)生的誘發(fā)因素，并發(fā)現(xiàn)GABARAP蛋白表達(dá)與細(xì)胞自噬有密切相關(guān)性，也提示了GABARAP也可以作為細(xì)胞自噬的標(biāo)記蛋白用于觀察細(xì)胞自噬的發(fā)生。

在本研究中通過對LC3及GABARAP的檢測說明當(dāng)脊髓受到缺血再灌注損傷時(shí)可以誘發(fā)細(xì)胞自噬，細(xì)胞自噬也是SCII的一種損傷機(jī)制，這與國內(nèi)外相關(guān)報(bào)道一致［18］。此外我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)給予LXA4治療后細(xì)胞自噬相關(guān)標(biāo)記蛋白出現(xiàn)下降趨勢，說明細(xì)胞自噬在SCII接受LXA4治療后24h受到抑制，這與國內(nèi)的研究相似［19］。這種現(xiàn)象可能的發(fā)生機(jī)制是：在SCII時(shí)，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬過度發(fā)生，過度的自噬可以對脊髓中的神經(jīng)元細(xì)胞造成損傷［20］，出現(xiàn)神經(jīng)損傷癥狀，并且阻礙了軸突的再生能力，當(dāng)給予LXA4后，一方面脂氧素A4可以抑制SCII的過度發(fā)生，避免了過度的細(xì)胞自噬，也減輕了過度自噬對神經(jīng)細(xì)胞造成的損傷；另一方面LXA4直接抑制了細(xì)胞自噬的發(fā)生，但不是完全清除自噬，這樣既保留了細(xì)胞自噬清楚受損細(xì)胞器的功能，也減輕了保護(hù)過度自噬造成的損傷。因此我們認(rèn)為細(xì)胞自噬到底在SCII方面起到的是保護(hù)作用還是損傷作用，是取決于自噬發(fā)生的量，在一定范圍內(nèi)的細(xì)胞自噬通過清除脊髓內(nèi)的有害物質(zhì)可以達(dá)到保護(hù)脊髓的作用，但一旦過度，其清除范圍超出了保護(hù)的限度，會造成脊髓的進(jìn)一步損害。但這些均是基于動物實(shí)驗(yàn)的假設(shè)，并沒有充足的證據(jù)，需要進(jìn)一步研究探討。