王慎驕，祁 賢，鄧 斐，彭杰夫，余慧燕，秦圓方，戴啟剛，鮑倡俊

0 引 言

流行性感冒（簡稱流感）一直是人類健康的重大威脅，據(jù)WHO估計，每年全球約有6億人感染流感病毒，占總?cè)丝诘?0%。流感病毒是屬于正粘病毒科，分為甲、乙、丙和丁4個屬。其中除了丁型病毒，其它流感病毒都可感染人類，構(gòu)成了人季節(jié)性流感主要病原。流感病毒基因組屬于單股負鏈RNA病毒，其最主要的特點是變異頻率極高，有助于病毒逃避宿主免疫系統(tǒng)的清除，反復的突破免疫屏障，在人群中廣泛流行。1968年世界范圍流感大流行之后，H3N2亞型流感病毒一直人群中流行的一個主要亞型［1-2］，其血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）的氨基酸替換頻頻發(fā)生，導致H3N2流感病毒疫苗有效性普遍低于甲型H1N1和乙型流感病毒的疫苗［3］。2017-2018流感監(jiān)測顯示每年2個流行高峰：冬春季高峰和夏季高峰。夏季流感高峰的毒株為季H3，而冬季高峰通常由新甲H1、季H3和B型中的一種或多種亞型毒株共同構(gòu)成。因此本研究旨在分析江蘇H3N2亞型流感分離株的分子特征以及耐藥性的改變，為預防和預警流感的流行提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1標本來源從江蘇省13個流感監(jiān)測點流感毒株中選取17株H3N2亞型毒株，其中12株為2017年夏季高峰期分離株，4株為非高峰期分離株，1株為2016年度分離株（作為1株參考株）。

1.2核酸提取采用商品化核酸提取試劑盒（ABI 5X MagMAX-96 Viral Isolation Kit）于 ABI自動核酸提取儀中提取17株H3N2亞型流感毒株核酸，每個樣本量為50 μL，洗脫液為100 μL，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 H3N2亞型流感病毒全基因組測序采用季節(jié)性流感病毒H3N2亞型全基因擴增試劑盒（伯杰）。PCR反應體系按試劑盒說明書配制，反應條件為：50℃，30 min；94℃，3 min；35個循環(huán)（94℃，30 s，60℃，30 s，72℃ 1.5 min）然后72℃，7 min。取擴增產(chǎn)物5 μL，1%瓊脂糖凝膠電泳。電壓80 V，電泳時間為40 min，凝膠成像儀觀察電泳結(jié)果。可疑陽性條帶送公司測序。

1.4基因序列分析從全球共享流感序列網(wǎng)站GISAID下載構(gòu)建甲型H3N2亞型流感毒株HA（血凝素）系統(tǒng)進化樹的骨架參考序列，包括2014-2015年北半球H3N2流感疫苗株A/Texas/50/2012（vaccine 3c.1），2015至2016年北半球H3N2流感疫苗代表株 A/Switzerland/9715293/2013（vaccine 3c.3a），2017至2018年北半球H3N2流感疫苗株A/HongKong/4801/2014（vaccine 3c.2a），2016 至 2017流感年引起香港流行高峰的H3N2亞型代表株（A/HongKong/2293/2017），2016年歐洲流行H3N2亞型代表株A/Norway/3806/2016（3c.2a1）等。使用MEGA軟件對序列進行比對，然后構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。構(gòu)建時選用鄰接法Neighbor-Joining（NJ）方法，Bootstrap設置為1000。氨基酸置換分析使用Lagergene 7.01軟件包中的MegAlign對HA編碼的氨基酸進行比較，查看HA抗原決定簇區(qū)域氨基酸置換情況。

1.5 H3N2亞型流感病毒耐藥性檢測NA抑制試驗檢測病毒對神經(jīng)氨酸酶抑制藥物的敏感性。按全國流感監(jiān)測方案技術(shù)指南，采用熒光發(fā)光法（Fluorescence-based assay，F(xiàn)L）進行檢測，試劑盒采用NA-Flour TM流感病毒NA檢測試劑盒（Thermo Fisher，Cat No.4457091）。步驟：①檢測 H3N2毒株的NA活性：用緩沖液在96孔檢測板中2倍系列稀釋待檢病毒和參考病毒病毒。每個病毒的初始稀釋倍數(shù)為1∶2，最后1孔為空白對照；從第12列開始至第1列依次加入底物工作液后，37℃孵育1 h。孵育完后加終止液終止反應，用儀器檢測熒光信號值，選取接近靶信號值的熒光信號值來確定病毒的稀釋倍數(shù)；②NA抑制試驗：在第12列加50 μL緩沖液，第11列加25 μL緩沖液，由高濃度到低濃度在第1-10列中，各自加入對數(shù)稀釋的25 μL的神經(jīng)氨酸酶抑制藥物。用多道移液器從11列到第1列加入25 μL稀釋好的病毒充分混勻；37℃孵育45 min；用多道移液器按照第12-1列的順序在每孔中加入50 μL底物工作液，充分混勻；37℃孵育1 h；加入終止液后，用儀器檢測熒光信號值，得到的數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 5或類似的軟件繪制曲線，計算半數(shù)抑制濃度（IC50），即NA酶活性被抑制50%時的藥物濃度。

2 結(jié) 果

2.1進化樹分析16株病毒HA和NA基因核苷酸相似性分別為98.9%～99.6%、99.2%～99.3%，同源性較高。HA進化樹分析顯示，16株江蘇分離株有15株位于3C.2a分支上，1株位于3C.2a1分支（與引起暴發(fā)流行的A/HongKong/2293/2017在同一分支），總體與全國2017年流行趨勢一致。HA進化樹中16株江蘇分離株可以進一步分為4個小的進化分支，各進化分支的毒株數(shù)量分別為：1.1（n=13）、1.2（n=1）、1.3（n=1）和2.1（n=1）。NA進化樹中，16株江蘇分離株進一步分為4個分支，各分支的毒株分布為：1.1（n=12）、1.2（n=2）、1.3（n=1）和2.1（n=1）。16株病毒5個基因型（A、B、C、D和F），其中基因型A（n=11）是優(yōu)勢流行基因型。見表1。

2.2分子特征分析2017年H3N2流行的3C.2a1分支中，HA蛋白的（N171K、I406V和G484E）突變是該分支標志突變。16株分離株中13株病毒N171K、I406V和G484E關(guān)鍵位點未發(fā)生變化，見表2。另外3株毒株關(guān)鍵位點發(fā)生變異，有1株毒株發(fā)生該標志性氨基酸變異，1株毒株發(fā)生（N121K、T135K）的免疫相關(guān)突變。

表1 2017年江蘇省16株分離株HA和NA基因型分組列表Table 1 Gene constellation of influenza H3N2 viruses from Jiangsu province

表2 2017年江蘇H3N2流感病毒分離株與疫苗推薦株及香港流行株抗原變異位點及關(guān)鍵位點的比較Table 2 Antigentic variants and other amino acid sites of influenza H3N2 viruses from Jiangsu province

與2017-2018年度疫苗株推薦株A/HongKong/4801/2014相比，16株分離株抗原位點突變發(fā)生不同程度的改變，其中位點突變包括：A138S 1株，R142K 2株，R142K、R261Q 9株，R142KS144R、R261Q 1株，R142K、S144K、R261Q 1株 。

2.3耐藥性分析對16株病毒的NA片段的分析未發(fā)現(xiàn)NA耐藥位點。NA抑制試驗結(jié)果表明，病毒IC50值＜10倍NAI敏感株IC50值，表明病毒對所檢測的NA藥物敏感?；蛐秃捅硇头治霰砻鳎?6株H3N2亞型流感毒株對抗流感藥物奧司他韋及扎那米韋均敏感，均發(fā)現(xiàn)與M2基因耐藥有關(guān)的A30T、S31N分子位點的改變。見表3。

表3 2017年江蘇H3N2流感病毒分離株耐藥檢測結(jié)果Table 3 Drug resistance test results of influenza H3N2 viruses from Jiangsu province

3 討 論

2016-2018年中國流感監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，江蘇省甲型流感病毒（H1N1pdm09和H3N2）與乙型流感病毒（Victoria系和Yamagata系）同時在人群中流行。江蘇省每年流感流行病高峰除了冬春季高峰，夏季也會出現(xiàn)發(fā)病高峰。病原學監(jiān)測結(jié)果來看。本研究選取江蘇省2017年跨越夏季流行高峰的16株H3N2流行株，開展分子流行病學研究。

點突變引起的抗原漂移是H3N2流感病毒的一種重要進化方式，也是病毒逃避人群免疫壓力主要策略。一般認為，具在血凝素HA蛋白抗原位點上至少有4個以上氨基酸發(fā)生替換，且需要分布在2-3個抗原決定簇，就可能導致病毒發(fā)生抗原漂移［4-5］。本研究中，與疫苗株相比，16株病毒中有11株在2個抗原決定簇上發(fā)生氨基酸變異，其中又有2株發(fā)生3個氨基酸點突變，應繼續(xù)加強對HA基因抗原位點變異的監(jiān)測。

2017年香港由于H3N2流感爆發(fā)，導致300余人死亡。研究發(fā)現(xiàn)，此次H3N2流行病毒（以A/HongKong/2293/2017為代表）的HA蛋白發(fā)生N121K、N171K位點的突變，提示這2個位點的突變可能與H3N2流感的暴發(fā)和致病性有關(guān)［6］。本研究中，有2株病毒（A/JSQinHuai/1681/2017和 A/JSSuCheng/1513/2017）分別發(fā)生N121K、N171K的突變與香港毒株（A/HongKong/2293/2017）一致，但其他14株沒有發(fā)生相關(guān)突變。這些突變可能是H3N2毒株為了逃避疫苗誘導的抗體反應，逃避宿主的免疫與清除而發(fā)生的突變，16/17流感年度韓國也同樣發(fā)現(xiàn)相同位點的突變導致流感樣病例的明顯上升［7］。其中A/JSSuCheng/1513/2017分離株在進化樹上與17年香港流行株（A/HongKong/2293/2017）和16年歐洲流行株（A/Norway/3806/2016）進化距離最近，有多個相同的突變位點。對比可以看出A/JSSuCheng/1513/2017分離株與在HA進化上同屬1.3組，都具有N171K、I406V和G484E標志性突變，屬于3C.2a1分支［8］，而A/JSQinHuai/1681/2017在進化樹上與上一年度流感毒株較為接近。但是其跟A/HongKong/2293/2017一樣具有N121K突變。提示我省H3N2流感毒株從16/17流感年度開始就已經(jīng)有該位點的突變，該突變由3C.2a1分支上發(fā)現(xiàn)［7］提示出現(xiàn)抗原漂移現(xiàn)象。而2個位點突變的同時出現(xiàn)可能會導致流感毒株對免疫應答的逃避能力增強導致流行高峰，引起死亡病例增加，應加強防控。根據(jù)文獻報道世界范圍內(nèi)位于3C.2a1分支上發(fā)生N171K突變的H3N2流感病毒很大一部分攜帶N121K和T135K突變［9-10］，但是這兩個突變沒有明顯改變病毒的抗原性［11］，T135K突變對抗體中和率略有影響［12］，所以對病毒特性的潛在影響需要進一步研究。結(jié)果顯示香港流行株2017年已經(jīng)傳入江蘇，雖然沒有形成優(yōu)勢流行，仍需加強監(jiān)測。近年來研究發(fā)現(xiàn)，基因重配也是H3N2病毒快速進化的重要方式，對病毒的抗原性、致病性和傳播力都有重要影響。本研究中HA和NA基因進化分析表明，2017年江蘇H3N2亞型流行株HA和NA基因表現(xiàn)出異質(zhì)性特點，16株病毒有5株病毒的HA和NA基因發(fā)生基因重配現(xiàn)象。增加了江蘇H3N2流感病毒的多樣性，這些重配病毒的生物學特性尚需進一步研究。應繼續(xù)加強對HA基因抗原位點變異的監(jiān)測。

近年來人感染禽流感頻繁發(fā)生，不斷出現(xiàn)重癥和死亡病例，更突顯臨床上抗流感藥物的重要性。流感病毒也不斷的發(fā)生著耐藥性的突變。目前絕大多數(shù)甲型流感病毒已對磺胺類藥物產(chǎn)生耐藥性［13］，江蘇分離株均發(fā)現(xiàn)A30T、S31N分子位點的改變，提示對磺胺類藥物耐藥［14］。研究表明，N2亞型NA蛋白一些氨基酸位點的突變（E119V、Q136K、D151V/D、I222V、R224K 、E276D、R292K 、N294S、R371K）會導致病毒對神經(jīng)氨酸酶抑制劑產(chǎn)生抗性［15］。本研究中未發(fā)現(xiàn)分離株存在上述位點改變。雖然目前監(jiān)測發(fā)現(xiàn)H3N2流感病毒對該藥物仍然敏感，我們?nèi)匀粦摷訌姳O(jiān)測和其他類型抗流感藥物的研發(fā)工作。流感疫苗和神經(jīng)氨酸酶抑制劑類藥物目前仍然是預防H3N2流感病毒的重要措施。隨著H3N2流感病毒變異持續(xù)發(fā)生，我們應該密切監(jiān)測病毒遺傳進化和耐藥基因的變化情況，以此為核心和切入點從而能夠有效地防控H3N2流感病毒的暴發(fā)流行，為疫情防控提供科學依據(jù)［16-17］。