尹健彬，皮 娜，文 怡，劉 嬋，李佳鑫，成夢群，白子娟，張 旋

0 引 言

肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是由多種原因引起的慢性間質(zhì)性肺疾病，雖然近些年對PF的認(rèn)識已經(jīng)有了實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展，其與個體基因和環(huán)境共同作用下的病理學(xué)機(jī)制和分子機(jī)制的了解也在不斷的加深［1-2］，但其致病機(jī)制目前尚還不完全清楚，所以存在治療困難，患者預(yù)后差等特點(diǎn)，5年的生存率僅為20%［3］，PF的特征是隨著時間的延長患者肺功能逐漸降低［4］，直至死亡；它是特發(fā)性間質(zhì)性肺炎中最常見的一種，是目前嚴(yán)重危害人類健康的一類慢性進(jìn)展性致死性疾?。?］。

肺纖維化小鼠模型是抗肺纖維化活性物質(zhì)篩選的經(jīng)典動物模型，肺組織結(jié)構(gòu)改變和惡化的傳統(tǒng)評價指標(biāo)主要是病理學(xué)檢查和一些定量生化標(biāo)志物，近些年隨著呼吸藥理及呼吸生理學(xué)的不斷發(fā)展，肺功能相關(guān)參數(shù)已成為呼吸系統(tǒng)疾病判定和治療效果評價的主要指標(biāo)［6］。全身體積描記（whole body plethysmography，WBP）是一種對清醒小動物進(jìn)行肺功能檢測的方法，其最大優(yōu)點(diǎn)在于檢測過程動物是處在清醒無束縛的狀態(tài)，無需麻醉和手術(shù)，這樣可以避免由于麻醉藥物和外界因素而影響檢測結(jié)果，而且操作簡單結(jié)果可靠，同一只動物可以重復(fù)測量，適用于重復(fù)檢測和長期追蹤性的研究［7］。本研究運(yùn)用清醒、無束縛狀態(tài)下的全身體積描記肺功能檢測系統(tǒng)，對實(shí)驗(yàn)動物的呼吸指標(biāo)在一段時間內(nèi)進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測，描述肺纖維化小鼠肺功能的動態(tài)變化過程，以期為呼吸系統(tǒng)疾病的藥物研究和臨床前試驗(yàn)提供科學(xué)、有效的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時建立正常小鼠肺功能各參數(shù)的參考值范圍。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物昆明小鼠，SPF級，雄性，7周齡，體重18～22 g，由昆明醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)許可證：SCSK（滇K2015-002）。分籠飼養(yǎng)在昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)室（7只/籠），飼養(yǎng)環(huán)境無特殊病原，溫度為（25±2）℃，相對濕度為70%，自由進(jìn)食進(jìn)水。

1.1.2儀器無束縛全身體積描記系統(tǒng)（Non-invasive whole body plethysmography system，WBPs），法國EMKA科技公司，系統(tǒng)包括：IOX2信息采集處理軟件、描記箱（4個）、壓力差傳感器、信號放大器、通風(fēng)泵（可連4個描記箱）；50 μL微量進(jìn)樣器，由上海安亭微量進(jìn)樣器廠生產(chǎn)。

1.1.3試劑注射用博來霉素（BLM），批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20055883，批號：16033811，規(guī)格：1.5萬BLM單位，由海正輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)；注射用等滲鹽水，批號：C170515J，由浙江國鏡藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；水合氯醛，批號：HG 3-1004-76，由天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所提供；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛，由昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院綜合實(shí)驗(yàn)室提供；Masson三色染色試劑盒由福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供。

1.2方法

1.2.1動物分組將小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組和模型組，每組14只。模型組參照經(jīng)典造模方法，小鼠行腹腔注射水合氯醛（250 mg/kg體重），大約50 μL將其麻醉，待1 min左右將麻醉小鼠固定于操作板上，用鑷子拉出小鼠舌頭以免窒息死亡［8］；用75%乙醇消毒，于小鼠頸部正中切約1 cm小口，鈍性分離組織并充分暴露氣管，用50 μL微量進(jìn)樣器穿刺氣管并緩慢注入BLM（5 mg/kg），正常對照組只行氣管穿刺不注入液體；拔出針管并立即直立小鼠并旋轉(zhuǎn)抖動2 min左右使BLM在肺組織中分散均勻，然后縫合傷口，進(jìn)行后續(xù)觀察實(shí)驗(yàn)。

1.2.2無創(chuàng)肺功能檢測連接好WBP設(shè)備裝置，運(yùn)行信息采集軟件IOX2并創(chuàng)建一個新的實(shí)驗(yàn)配置文件，設(shè)定用于小鼠WBP檢測的數(shù)據(jù)參數(shù)，運(yùn)行該文件并向描記箱中快速注入1 mL的氣體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)通道的信號校正，若數(shù)據(jù)未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)則需要檢查裝置連接是否正常以及密封性。待所有通道校正通過后，將4只清醒的小鼠放入描記箱中，讓其適應(yīng)20 min左右；在此期間，按照小鼠編號對相應(yīng)的通道進(jìn)行命名并創(chuàng)建分組文件夾。待小鼠趨于穩(wěn)定且呼吸波平穩(wěn)時（應(yīng)避免小鼠睡著）開始記錄數(shù)據(jù)5 min，IOX2每隔10 s自動記錄1次小鼠呼吸波數(shù)值，測得的11個基礎(chǔ)數(shù)據(jù)包括吸氣時間（Ti）、呼氣時間（Te）、最大吸氣量（PIF）、最大呼氣量（PEF）、潮氣量（TV）、呼氣量（EV）、松弛時間（RT）、每分鐘呼氣量（MV）、呼吸頻率（f）、被迫呼吸間隙（Penh）、50%呼氣流速（EF50）；實(shí)驗(yàn)持續(xù)4周，并將2組小鼠分別在造模后的第7、14、21、28天進(jìn)行肺功能檢測，每次都從上午9：00開始并且按相同的檢測順序進(jìn)行。

1.2.3肺組織病理學(xué)檢查分別于14 d和28 d末將2組小鼠各脫頸處死7只，取出肺組織并置于10%中性甲醛固定24 h，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，并用HE染色和Masson三色染色試劑盒染色，在顯微鏡下觀察肺組織病理變化。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，參數(shù)比較采用重復(fù)測量資料的方差分析（ANOVA），兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)；雄性小鼠肺功能各指標(biāo)參考值范圍依據(jù)“醫(yī)學(xué)參考值范圍的制定”方法計算，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1肺組織病理學(xué)檢查肺組織HE染色可見，對照組小鼠肺組織肺泡間隔正常，肺泡壁未增寬、無炎性細(xì)胞浸潤；模型組可見肺泡間隔斷裂、肺泡大量融合、部分可見塌陷，肺泡壁增厚、大量炎性細(xì)胞浸潤，而且病變隨時間的推移而加重。見圖1。Masson染色顯示，對照組肺組織無明顯的膠原沉積，模型組在支氣管周圍及肺泡間隔可見大量的膠原沉積，并且在14 d時可見已經(jīng)初步形成纖維化，但其在28 d時更明顯。見圖2。

2.2肺纖維化小鼠肺功能的動態(tài)變化小鼠氣管內(nèi)注射BLM后，模型組小鼠出現(xiàn)毛發(fā)柔順度降低、掉毛，第2周以后活動程度下降等現(xiàn)象。與對照組相比，模型組Ti、Te和RT值在第4周時明顯升高（P＜0.05）；而第4周PEF、MV、f和EF50值明顯下降（P＜0.05）。與模型組第 1周相比，組內(nèi)Ti、Te、RT、f值在第2、3、4周時的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而MV和EF50值在第3、4周時的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），PIF值則僅在第4周時存在差異（P＜0.01）。如圖3。

圖1 肺纖維化小鼠病理學(xué)檢查（×100）Figure1 Pathological examination of pulmonary fibrosis in mice（×100）

圖2 鏡下觀察肺纖維化小鼠肺組織（Masson染色×100）Figure 2 Masson staining of lung tissue in mice with pulmonary fibrosis（Masson ×100）

2.3支氣管收縮程度與同期對照組Penh比較，模型組在第2、3、4周時均升高（P＜0.01）；與模型組第1周相比，模型組Penh值僅在第3、4周均升高（P＜0.05）。見表1。

圖3 肺纖維化小鼠各項(xiàng)肺功能指標(biāo)的動態(tài)變化Figure 3 Dynamic changes of various lung function indexes in mice with pulmonary fibrosis

表1 各組小鼠Penh的變化比較（）Table 1 Changes in mouse Penh（xˉ± s）

表1 各組小鼠Penh的變化比較（）Table 1 Changes in mouse Penh（xˉ± s）

與對照組相比，*P＜0.01；與模型組第1周相比，#P＜0.05、##P＜0.01

被迫呼吸間隙組別n第1周0.652±0.199 0.719±0.169第4周0.712±0.189 1.053±0.236*##第3周0.662±0.164 0.936±0.188*#第2周0.553±0.189 0.820±0.205*對照組模型組14 14

2.4建立正常雄性昆明小鼠肺功能參數(shù)參考值范圍通過4周的肺功能檢測，獲得各項(xiàng)肺功能參數(shù)指標(biāo)，經(jīng)統(tǒng)計分析得到正常生理無創(chuàng)無束縛狀態(tài)下雄性昆明小鼠各項(xiàng)肺功能參數(shù)值參考范圍，其中主要指標(biāo)Penh值的正常值范圍為0.27～0.88；然而考慮到小鼠沒有自主盡力呼氣的意識，由此獲得的PEF參考值范圍3.28～7.00也僅能作為一個參照，不建議單獨(dú)用于評價肺功能。見表2。

表2 正常雄性昆明小鼠肺功能參數(shù)值參考范圍Table 2 Reference range of lung function parameters in normal male mice

3 討 論

在PF疾病發(fā)病機(jī)制研究和抗PF藥物篩選中，實(shí)驗(yàn)性PF動物模型具有重要的作用，經(jīng)氣管內(nèi)注射BLM誘導(dǎo)形成PF模型是目前國際上通用的經(jīng)典造模方法［9-11］。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為BLM引起PF是由于嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)以及多種細(xì)胞因子的釋放，導(dǎo)致肺組織內(nèi)膠原異常沉積、纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化和異常增生、組織異常修復(fù)等［12］。由于BLM誘導(dǎo)的PF模型存在隨時間變化性和部分可逆性，并存在炎癥反應(yīng)和纖維化兩個階段［8，13］，而所有潛在的抗 PF的化合物都應(yīng)在纖維化階段進(jìn)行評估，對于評價目標(biāo)化合物對PF進(jìn)程的影響，肺功能將是一項(xiàng)比較直觀的指標(biāo)；同時，由于抽樣誤差的存在，所有實(shí)驗(yàn)指標(biāo)應(yīng)盡可能在同一批實(shí)驗(yàn)動物中獲得；因此，相對于有創(chuàng)肺功能無創(chuàng)且沒有其他藥物干擾的肺功能檢測將顯得尤為重要。WBPs是在小鼠無創(chuàng)且清醒狀態(tài)下進(jìn)行的，所以可以避免麻醉藥物對肺功能參數(shù)的影響，而且檢測過的小鼠可以重復(fù)使用，很適用于跟蹤性的研究［14］。

Penh是指示氣道阻力的指標(biāo)，表征支氣管的收縮程度；有研究顯示，用乙酰甲膽堿刺激導(dǎo)致小鼠高氣道反應(yīng)時會引起Penh值的增加，且隨乙酰甲膽堿的濃度而改變［15-16］。值得注意的是，雖然Penh被認(rèn)為可能與氣道阻力密切相關(guān)，但有觀點(diǎn)認(rèn)為在使用非侵入性方法檢測時不易選用Penh值作為長時間測量的理想指標(biāo)，原因在于Penh值容易受環(huán)境溫度和濕度的影響［17］；另外，在重復(fù)測量實(shí)驗(yàn)中Penh值還會受到時間的影響［17］，但這種影響可能也是由于不同時間點(diǎn)重復(fù)測量時環(huán)境的變化引起的。即使這樣，Penh值在獨(dú)立測量及在其他肺功能指標(biāo)的參與下，還是被廣泛應(yīng)用于氣道阻力的評價。

本研究以BLM誘導(dǎo)的PF模型為基礎(chǔ)，分別對對照組和造模后的模型組小鼠在1～4周內(nèi)進(jìn)行無束縛狀態(tài)下的肺功能檢測，由病理學(xué)檢查可見造模是成功的，而且隨時間的推移肺組織纖維化逐漸加重；在獲得的參數(shù)指標(biāo)中Ti、Te（從吸氣呼氣開始到吸氣末下一個吸氣開始的時間）隨著時間的延長呈上升的趨勢，特別是Te（呼氣時間），這可能與文獻(xiàn)報道的IPF患者肺部的一氧化碳擴(kuò)散能力降低（DLco）有關(guān)［18］，說明肺的氣體交換功能降低；這種現(xiàn)象在第2周開始逐漸顯現(xiàn)出來，這與組織病理學(xué)表現(xiàn)一致，即在第2周肺組織開始出現(xiàn)肺泡壁增厚、肺泡間隔增寬，在支氣管周圍出現(xiàn)膠原沉積等，這也與文獻(xiàn)報道一致［6］。PIF和PEF是指征一個呼吸過程中最大流量的指標(biāo)，在4周內(nèi)可觀察到兩個指標(biāo)隨時間出現(xiàn)波動，但僅有模型組的PIF在第4周時與對照組存在差異，而PEF卻沒有差異，這可能的解釋是由于小鼠沒有自主盡力呼氣（深呼氣）的意識，導(dǎo)致肺部有部分氣體的滯留，致使測量結(jié)果不準(zhǔn)確。研究顯示模型組TV和EV值相較于對照組是明顯偏低的，但模型組僅在第2周時與第1周存在差異，此后沒有體現(xiàn)出差異；正如Milton等［6］所述，BLM處理的小鼠由于肺部形態(tài)學(xué)的改變，可用于氣體交換的組織面積減少，使得纖維化后肺組織氣體交換受阻并引起呼吸頻率f減少，這可能是有力的解釋；相較之下在1 min內(nèi)的累積呼氣量MV值模型組始終是低于對照組的并且持續(xù)降低，這也證明了前面的推測。

然而，可以看到Penh從第2周開始出現(xiàn)明顯的上升趨勢，而且隨時間的推移其在不斷增大，故增加的氣道阻力在PF過程中可能是呼吸困難的原因之一，這同先前的研究報道是一致的［4，19］；也反映出Penh作為小動物整個肺功能總體篩選的有效指標(biāo)是可靠的。同時，代表呼氣流速的EF50相較于對照組卻出現(xiàn)了下降，這與Penh的結(jié)論一致。另外，與對照組相比松弛時間RT顯示增加，這可能跟BLM處理的小鼠肺組織順應(yīng)性降低和彈力回縮增加有關(guān)［20-21］。有研究報道稱，性別是決定PF風(fēng)險和預(yù)后的重要因素，而性激素是性別特異性生理學(xué)的重要調(diào)節(jié)因子，這在其他肺病中也有體現(xiàn)［12-13］；王愛欣等［22］的研究證實(shí)雌激素對百草枯誘導(dǎo)的PF有保護(hù)作用，當(dāng)前國內(nèi)外常用的PF小鼠模型絕大多數(shù)也是在雄性中進(jìn)行；基于以上，本研究在重復(fù)測量的正常小鼠肺功能中，經(jīng)統(tǒng)計分析建立了一組正常雄性昆明小鼠肺功能參數(shù)值的參考范圍，以期為以后呼吸系統(tǒng)疾病小鼠的判定以及潛在化合物篩選研究提供一定的依據(jù)。

綜上所述，經(jīng)氣管內(nèi)滴注BLM誘導(dǎo)的小鼠PF模型肺功能在1～4周內(nèi)持續(xù)降低，肺纖維化程度在逐漸加重，而正常昆明小鼠的肺功能各參數(shù)值波動較??；由四周內(nèi)的各指標(biāo)趨勢圖可見，造模后的小鼠肺功能在第2周以后就開始逐漸下降，到第4周時還呈現(xiàn)下降趨勢且差異最顯著，故預(yù)計肺纖維化從第2周就開始逐漸形成，所以在造模后第2～4周內(nèi)可以進(jìn)行抗肺纖維化合物的研究。