張笑菊，蔡逸安，李昕悅，吳棟磊，徐曉陽，朱迎春

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西太谷030801）

紫甘藍(lán)，又名紫卷心菜，屬十子花科（Cmciferae），原產(chǎn)歐洲地中海地區(qū)，現(xiàn)在我國(guó)大部分地區(qū)都有栽種，具有營(yíng)養(yǎng)豐富、易種、易采、產(chǎn)量大、生長(zhǎng)期短、適應(yīng)性強(qiáng)、價(jià)格低廉等特點(diǎn)[1]。

紫甘藍(lán)中含有大量天然色素，其中呈紫色的主要成分是花色苷，是由花青素在自然狀態(tài)下與各種糖及有機(jī)酸結(jié)合形成的糖苷，是良好的天然色素，除了做食品添加劑外，還有一定的藥用價(jià)值[2]。大量研究表明：花色苷具有很強(qiáng)的抗氧化作用[3]，可以清除體內(nèi)的自由基，降低氧化酶的活性，降低甘油酯水平[4]，降低低密度脂蛋白中膽固醇含量[5]，改善脂蛋白的分解代謝，抑制膽固醇吸收[6]，是治療糖尿病性視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）的有效分子，可以預(yù)防多種心血管疾病[7-8]。

有機(jī)溶劑萃取法被廣泛的應(yīng)用于色素的提取，根據(jù)相似相溶原理，提取極性分子花色苷通常使用的提取劑有甲醇、乙醇、丙酮、水等。為了防止提取過程中非?；幕ㄉ盏慕到?，常在提取溶液中加入一定量的鹽酸、磷酸等無機(jī)酸或酒石酸、檸檬酸等有機(jī)酸[9-10]。胡彥新采用單因素試驗(yàn)和三因素三水平的響應(yīng)面分析法優(yōu)化桑葚酒渣中花色苷的提取工藝為：加酶量0.2%、提取溫度64℃、提取時(shí)間145 min，在此試驗(yàn)條件下花色苷的提取率為4.68 mg/g[11]。孟憲軍用酸性乙醇作為提取劑，采用響應(yīng)面分析優(yōu)化法優(yōu)化藍(lán)莓花色苷提取工藝為：提取液乙醇體積分?jǐn)?shù)60.65%，料液比1∶20.65（g/mL），提取時(shí)間122.53 min，提取溫度 50℃[12]。

本試驗(yàn)以紫甘藍(lán)為原料，研究乙醇濃度、料液比、pH值、提取溫度和提取時(shí)間等因素對(duì)花色苷提取率的影響，利用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化紫甘藍(lán)花色苷的提取工藝，并對(duì)其抗氧化性進(jìn)行測(cè)定，以期為后期紫甘藍(lán)花色苷的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮紫甘藍(lán)：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)菜市場(chǎng)；95%乙醇、鹽酸、氯化鉀、三水合乙酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三氯化鐵、三氯乙酸、K3[Fe（CN）6]、DPPH、無水乙醇、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽[diammonium 2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate），ABTS]、過硫酸鉀（均為分析純）：天津市化學(xué)試劑一廠。

1.2 儀器與設(shè)備

7200型分光光度計(jì)：龍尼柯上海儀器有限公司；FA2004電子分析天平：上海華巖儀器設(shè)備有限公司；ST2100 pH計(jì)：奧豪斯儀器（常州）有限公司；LD5-2B低速離心機(jī)：北京雷勃爾醫(yī)療器械有限公司；HH恒溫水浴鍋：余姚市東方電工儀器廠；101-2電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海躍進(jìn)機(jī)械廠。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.3.1 原料處理

將新鮮紫甘藍(lán)洗凈晾干切碎，置于40℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干，研磨成粉，80目濾網(wǎng)過篩備用。

1.3.2 紫甘藍(lán)中花色苷的提取

取錐心瓶加入一定量的乙醇為提取溶劑，置于水浴鍋中預(yù)熱，用稀鹽酸預(yù)調(diào)pH值，稱取定量紫甘藍(lán)粉加入錐心瓶中，調(diào)節(jié)pH值，恒溫水浴浸提。將浸提液用100目尼龍布過濾，濾液4 000 r/min條件下離心10 min，取上清液為待檢樣品。

1.3.3 花色苷含量的測(cè)定[13-14]

花色苷含量的測(cè)定采用紫外pH示差法，即在不同pH值下，花色苷基團(tuán)發(fā)生變化，掃描紫外-可見光譜時(shí)，花色苷最大吸收峰發(fā)生相應(yīng)的改變。將待測(cè)樣品用pH 1.0 KCl溶液（0.025 mol/L）和pH 4.5乙酸鈉緩沖溶液（0.4 mol/L）稀釋到合適倍數(shù)，室溫下避光平衡110 min，以蒸餾水作空白，分別在518 nm和700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，根據(jù)公式（1）、（2）計(jì)算樣品中花色苷含量。45℃）對(duì)其提取率的影響，確定最佳溫度。

式中：Mw為花色苷的摩爾分子量，449.2 g/mol；DF為稀釋倍數(shù)；ε為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)，26 900 L/（mol·cm）；L為光程，0.5 cm；A518和A700分別為518 nm和700 nm處的吸光值。

1.3.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.4.1 乙醇濃度對(duì)提取率的影響

在固定料液比 1 ∶35（g/mL）、pH 2.0、提取溫度 40 ℃和提取時(shí)間3 h條件下，考察不同的乙醇濃度（30%、40%、50%、60%、70%）對(duì)花色苷提取率的影響，確定最佳乙醇濃度。

1.3.4.2 料液比對(duì)提取率的影響

在固定乙醇濃度40%、pH 2.0、提取溫度40℃和提取時(shí)間3 h條件下，考察不同的料液比[1∶25、1∶30、1 ∶35、1 ∶40、1 ∶45（g/mL）]對(duì)其提取率的影響，確定最佳料液比。

1.3.4.3 pH值對(duì)提取率的影響

在固定乙醇濃度40%、料液比1∶35（g/mL）、提取溫度40℃和提取時(shí)間3 h條件下，考察不同的pH值（1、2、3、4、5）對(duì)其提取率的影響，確定最佳 pH 值。

1.3.4.4 溫度對(duì)提取率的影響

在固定乙醇濃度40%、料液比1∶35（g/mL）、pH 2.0和提取時(shí)間3 h條件下，考察不同的溫度（30、35、40、

1.3.4.5 時(shí)間對(duì)提取率的影響

在固定乙醇濃度40%、料液比1∶35（g/mL）、pH 2.0和提取溫度40℃條件下，考察不同的提取時(shí)間（1、2、3、4、5 h）對(duì)其提取率的影響，確定最佳提取時(shí)間。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

固定提取時(shí)間3 h和pH 2.0條件下，選取乙醇濃度、料液比和提取溫度3個(gè)因素為自變量，以每克紫甘藍(lán)粉中提取的花色苷毫克數(shù)為指標(biāo)，進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)，試驗(yàn)因素及水平編碼見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 Factor level and coding of response surface methodology experiment

1.4 紫甘藍(lán)花色苷抗氧化活性的研究

1.4.1 總還原力的測(cè)定[15]

取0.5 mL待測(cè)溶液，0.6 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.6），1.5 mL 1.0%K3[Fe（CN）6]置于具塞試管中，迅速混勻，置于50℃水浴中反應(yīng)20 min，冰水冷卻，再加3 mL10%三氯乙酸，混勻后，取出3 mL上清液，加5 mL雙蒸水和0.2 mL 0.1%FeCl3，混勻測(cè)定各樣品在700 nm下的吸光度值A(chǔ)1，作為紫甘藍(lán)的空白對(duì)照；然后取 1.5 mL 蒸餾水代替 1.5 mL1.0%K3[Fe（CN）6]，測(cè)定其在700 nm下的吸光度值A(chǔ)2。紫甘藍(lán)花色苷溶液的總還原力為A0=A1-A2。

1.4.2 DPPH自由基清除率的測(cè)定[16]

取1×10-4mol/L DPPH溶液3 mL，加入2 mL復(fù)合果蔬汁，搖勻，室溫、避光保存下反應(yīng)20 min，以50%乙醇做空白對(duì)照，在517 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，得吸光度A1。另取3 mLDPPH溶液與2 mL的無水乙醇溶液混合，步驟同上，測(cè)得吸光度A2。用2 mL無水乙醇代替DPPH溶液，與3 mL復(fù)合果蔬汁混合，避光反應(yīng)20 min，517 nm下測(cè)得吸光度A3，然后按下式計(jì)算DPPH自由基清除率。

1.4.3 ABTS+自由基清除率的測(cè)定[17-18]

取 5 mL7 mmol/LABTS溶液與 88 μL140 mmol/L過硫酸鉀溶液混合，室溫、避光條件下靜置過夜，形成ABTS+儲(chǔ)備液。使用前，用水適當(dāng)稀釋成工作液，要求其在734 nm下的吸光度值為0.7±0.002。取2 mL花色苷樣品（用蒸餾水稀釋至一定濃度），加入8 mLABTS工作液，混合10 s，在30℃下靜置6 min，于734 nm下測(cè)定吸光度，得吸光度值A(chǔ)1；空白組用2 mL水代替樣品溶液，步驟同上測(cè)得吸光度值A(chǔ)2；對(duì)照組將2 mL花色苷樣品液加入到8 mL蒸餾水中，搖勻、靜置，734 nm下得到吸光度值A(chǔ)3。ABTS+自由基的清除率公式如下：

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用IBM SPSS Statistics 20.0和Statistix 8.1軟件包（St Paul，MN）進(jìn)行單因素方差分析、差異顯著性檢驗(yàn)，采用Design-Expert8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，采用SigmaPlot 10.0繪圖軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 乙醇濃度對(duì)提取率的影響

圖1為乙醇濃度對(duì)花色苷提取率的影響。

圖1 乙醇濃度對(duì)花色苷提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of anthocyanin

由圖1可知，當(dāng)乙醇濃度低于40%時(shí)，隨著乙醇濃度增加，花色苷提取率逐漸提高。乙醇濃度達(dá)到40%，花色苷提取率最高，為13.23 mg/g，當(dāng)繼續(xù)增大乙醇濃度時(shí)，花色苷的提取率下降，這是因?yàn)殡S著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大，提取劑極性變小，偏離了花色苷的極性，從而降低了花色苷的提取率。

2.1.2 料液比對(duì)提取率的影響

圖2為料液比對(duì)花色苷提取率的影響。

由圖2可知，料液比低于1∶35（g/mL）時(shí)，花色苷提取率隨著料液比的增加而增大。料液比為1∶35（g/mL）時(shí)，花色苷的提取率達(dá)到相對(duì)較大的數(shù)值14.40 mg/g，繼續(xù)增大料液比時(shí)，花色苷的提取率下降。當(dāng)料液比大于1∶40（g/mL）時(shí)，反應(yīng)體系較稀薄，既造成提取劑的浪費(fèi)，也降低了花色苷的提取率。

圖2 料液比對(duì)花色苷提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of anthocyanin

2.1.3 pH值對(duì)提取率的影響

圖3為pH值對(duì)花色苷提取率的影響。

圖3 pH值對(duì)花色苷提取率的影響Fig.3 Effect of pH value the extraction rate of anthocyanin

由圖3可知，pH值低于2時(shí)，隨著pH值的升高，花色苷提取率增加。當(dāng)pH值為2時(shí)，花色苷的提取率達(dá)到最高值3.85 mg/g，當(dāng)繼續(xù)增大pH值時(shí)，花色苷的提取率顯著下降，當(dāng)pH值達(dá)到5時(shí)，花色苷的提取率降低至12.31 mg/g。

2.1.4 溫度對(duì)提取率的影響

圖4為提取溫度對(duì)花色苷提取率的影響。

圖4 提取溫度對(duì)花色苷提取率的影響Fig.4 Effect of temperature on the extraction rate of anthocyanin

由圖4可知，在提取溫度低于40℃時(shí)，隨著提取溫度的升高，花色苷提取率逐漸增大并且在40℃時(shí)達(dá)到最高值13.26 mg/g，當(dāng)提取溫度高于40℃時(shí)，花色苷的提取率反而下降。每一種色素都對(duì)溫度具有一定的耐受性，溫度過高會(huì)破壞色素的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，所以40℃為較佳提取溫度。

2.1.5 時(shí)間對(duì)提取率的影響

圖5為提取時(shí)間對(duì)花色苷提取率的影響。

圖5 提取時(shí)間對(duì)花色苷提取率的影響Fig.5 Effect of time on the extraction rate of anthocyanin

由圖5可知，提取時(shí)間低于3 h時(shí)，花色苷提取率隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而升高。提取時(shí)間為3 h時(shí)，花色苷的提取率較高，達(dá)到11.25 mg/g。提取時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，花色苷提取率反而下降，這可能是因?yàn)闀r(shí)間的延長(zhǎng)導(dǎo)致更多的花色苷發(fā)生氧化而損失的緣故。

2.1.6 5個(gè)單因素試驗(yàn)的方差分析結(jié)果

表2為5個(gè)單因素試驗(yàn)的方差分析表。

通過 Student-Newman-Keuls（SNK）法計(jì)算可知，5個(gè)試驗(yàn)因素中的3個(gè)因素（溫度、料液比和乙醇濃度）對(duì)花色苷提取率影響顯著，是影響提取率的主要因素；而提取時(shí)間和pH值對(duì)花色苷提取率影響不顯著，是影響提取率的次要因素。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化紫甘藍(lán)花色苷提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面模型的建立及其方差分析

雖然影響紫甘藍(lán)中花色苷提取率的因素很多，但通過表2可知：溫度、料液比和乙醇濃度是影響提取率的主要因素，因此，建立以溫度、料液比和乙醇濃度為因素水平的響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)Ｐ汀２捎肂ox-Behnken試驗(yàn)結(jié)果見表3，利用Design Expert8.0.6進(jìn)行多元回歸擬合，得到花色苷提取率（Y）對(duì)自變量X1（溫度）、X2（料液比）、X3（乙醇濃度）的回歸方程為：

表3 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of the Box-Behnken response surface experiment

表4為回歸模型的方差分析。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

由表4可知，模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.823 4），回歸模型的決定系數(shù)為0.991 6，說明該模型能解釋99.16%的變化。該模型擬合度良好，試驗(yàn)誤差小，用該模型對(duì)紫甘藍(lán)花色苷提取工藝進(jìn)行優(yōu)化可以獲得良好的效果。模型一次項(xiàng)X1、X2、X3極顯著（P＜0.01），二次項(xiàng) X12、X22、X32極顯著（P＜0.01），交叉項(xiàng) X1X3、X2X3顯著（P＜0.05），X1X2不顯著。將二次回歸方程中的一次項(xiàng)F值作為各參數(shù)對(duì)花色苷提取率影響的比較依據(jù)，得出3因素對(duì)花色苷提取率影響的大小依次為：X2＞X3＞X1，即料液比＞乙醇濃度＞提取溫度。

2.2.2 交互效應(yīng)分析

因素的交互作用可以從響應(yīng)曲面坡度變化得到反映。響應(yīng)面的坡度，表明紫甘藍(lán)花色苷提取量在處理?xiàng)l件發(fā)生變化時(shí)其響應(yīng)的靈敏程度。如果響應(yīng)面坡度非常陡峭，表明當(dāng)處理?xiàng)l件發(fā)生變化時(shí)，響應(yīng)值非常敏感；反之，如果響應(yīng)面坡度非常平緩，說明提取指標(biāo)的變異對(duì)響應(yīng)值不敏感。

通過二次多項(xiàng)式回歸方程所得到的響應(yīng)面交互效應(yīng)如圖6所示。

圖6 交互效應(yīng)圖Fig.6 Interactive effect

由圖6可知X1X3、X2X3對(duì)紫甘藍(lán)花色苷提取率的影響極顯著（P＜0.01），X1X2對(duì)紫甘藍(lán)花色苷提取率的影響不顯著。

2.2.3 最佳工藝條件的確定與驗(yàn)證

將乙醇濃度、料液比、溫度的取值范圍分別設(shè)定為乙醇濃度為30%～50%，料液比為1∶30（g/mL）～1 ∶40（g/mL），溫度 30℃～50℃，并將目標(biāo)值設(shè)定為最大值，通過Design Expert 8.0.6軟件獲得最優(yōu)組合為乙醇濃度 41.17%、料液比 1∶35.77（g/mL）、溫度 41.13℃。在此最優(yōu)組合中，理論最佳紫甘藍(lán)花色苷的提取率為14.01%，根據(jù)實(shí)際條件的限制將最優(yōu)組合修正為：乙醇濃度 40%、料液比 1∶36（g/mL）、溫度 41.0℃，在此試驗(yàn)條件下的提取率為13.92 mg/g，與預(yù)測(cè)值接近。

2.3 紫甘藍(lán)花色苷抗氧化性的結(jié)果與分析

2.3.1 總還原力的測(cè)定

紫甘藍(lán)花色苷的總還原能力見圖7。

圖7 紫甘藍(lán)花色苷的總還原能力Fig.7 Total reduction ability of anthocyanins from red cabbage

由圖7可以看出，在試驗(yàn)所選濃度范圍內(nèi)（30 mg/L～180 mg/L），吸光值隨著紫甘藍(lán)花色苷濃度的增大而增大，這說明紫甘藍(lán)花色苷的總還原能力（即抗氧化能力）隨著濃度的增大而增大。

2.3.2 DPPH自由基清除率的測(cè)定

紫甘藍(lán)花色苷對(duì)DPPH自由基的清除率見圖8。

圖8 紫甘藍(lán)花色苷對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.8 Scavenging rates of red cabbage anthocyanin on DPPH free radicals

由圖8可以看出，在試驗(yàn)所選濃度范圍內(nèi)（30mg/L～180 mg/L），紫甘藍(lán)花色苷對(duì)DPPH自由基的清除率隨著紫甘藍(lán)花色苷濃度的升高，呈現(xiàn)折線上升的趨勢(shì)，當(dāng)溶液濃度為150 mg/L時(shí)，清除能力達(dá)到了84.50%，說明紫甘藍(lán)花色苷具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基的能力。

2.3.3 ABTS+自由基清除率的測(cè)定

紫甘藍(lán)花色苷對(duì)ABTS+自由基的清除率見圖9。

圖9 紫甘藍(lán)花色苷對(duì)ABTS+自由基的清除率Fig.9 Scavenging rates of red cabbage anthocyanin on ABTS+free radicals

由圖9可以看出，在試驗(yàn)所選濃度范圍內(nèi)（30mg/L～180 mg/L），紫甘藍(lán)花色苷對(duì)ABTS+自由基的清除率隨著紫甘藍(lán)花色苷濃度的升高而升高，當(dāng)溶液濃度為150 mg/L時(shí)，清除能力達(dá)到了97%，由此可以看出紫甘藍(lán)花色苷具有較強(qiáng)的清除ABTS+自由基的能力。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以花色苷提取率為考察目標(biāo)，利用響應(yīng)面分析法對(duì)紫甘藍(lán)花色苷的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，最終獲得花色苷提取最佳工藝條件為乙醇濃度為40%、料液比為1∶36（g/mL）、溫度41℃，在此試驗(yàn)條件下花色苷的提取率為13.92 mg/g。通過總還原力的測(cè)定、清除DPPH自由基和ABTS+自由基的體外抗氧化試驗(yàn)，證實(shí)紫甘藍(lán)花色苷具有較好的體外抗氧化能力。其抗氧化水平隨著濃度的增大而增加，尤其是對(duì)ABTS+自由基的清除能力較強(qiáng)，當(dāng)紫甘藍(lán)花色苷濃度為150 mg/L時(shí)，清除能力達(dá)到了97%。