王 垿,孫 昕*,李鵬飛,王佳樂,成智文

雙對(duì)柵藻FACHB-78甘油三酯積累的鹽脅迫條件優(yōu)化

王 垿1,孫 昕1*,李鵬飛1,王佳樂1,成智文2

(1.西安建筑科技大學(xué)陜西省環(huán)境工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西北水資源與環(huán)境生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 西安 710055；2.咸陽陶瓷研究設(shè)計(jì)院有限公司,陜西 咸陽 712000)

以雙對(duì)柵藻FACHB-78為研究對(duì)象,在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)0~45‰的條件下,研究了該藻生長形態(tài)、甘油三酯積累、光合活性等特性,確定了最優(yōu)的鹽脅迫條件.結(jié)果表明,隨著鹽度的增加,藻細(xì)胞密度逐漸下降,類胡蘿卜素/葉綠素的比值逐漸上升,甘油三酯的積累量呈現(xiàn)先上升、后下降的趨勢(shì).在鹽度為10‰的條件下,藻細(xì)胞密度比正常培養(yǎng)時(shí)降低了24.38%,甘油三酯濃度和含量均達(dá)到最大值,分別為250.88mg/L和33.41%,比正常培養(yǎng)時(shí)提高了97.05%和82.09%,且光合活性較高.對(duì)于生產(chǎn)生物柴油,在鹽度為10‰的脅迫條件下,雙對(duì)柵藻FACHB-78比在正常培養(yǎng)的藻細(xì)胞具有更大優(yōu)勢(shì).

雙對(duì)柵藻；鹽脅迫；甘油三酯；葉綠素?zé)晒?/p>

化石能源使用造成的環(huán)境污染、溫室效應(yīng)及土地塌陷等問題日趨嚴(yán)重,促使新能源的開發(fā)成為近年來研究的新焦點(diǎn).生物柴油因其可再生、無污染的特點(diǎn),被認(rèn)為是化石能源的可持續(xù)替代方案[1],而微藻生物質(zhì)被視為第三代生物柴油的原料[2].

微藻儲(chǔ)存脂質(zhì)的主要形式是甘油三酯[3],且甘油三酯可通過酯交換產(chǎn)生性能良好的生物柴油[4].因此,如何在不損失微藻生長速率的條件下大幅度提高藻細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量成為微藻生產(chǎn)生物柴油的熱點(diǎn)問題.研究表明,改變培養(yǎng)條件會(huì)使藻細(xì)胞生長受到脅迫,導(dǎo)致甘油三酯的合成途徑發(fā)生改變,從而對(duì)其油脂產(chǎn)量和含量有極大影響[5],其中鹽脅迫成為了更有利于誘導(dǎo)中性脂(甘油三酯)積累的重要手段[6].

土壤鹽分對(duì)各類植物的生長具有重要的影響.對(duì)于微藻,其生長特性和生理代謝機(jī)制也受鹽度的影響[7].鹽脅迫引起的滲透調(diào)節(jié)影響了藻類的生長,甚至改變了微藻的存活能力,也進(jìn)一步影響了藻細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的合成[8].當(dāng)藻細(xì)胞處于高鹽度水環(huán)境中,藻細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生不同的應(yīng)激反應(yīng),促使作為主要儲(chǔ)能物質(zhì)的甘油三酯含量增加.Venkata等[8]采用了生物量生長期(BGP)和鹽度誘導(dǎo)的脂質(zhì)誘導(dǎo)期(LIP)的雙模式培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)在對(duì)數(shù)生長后期30g/L NaCl條件下脅迫時(shí),最高脂質(zhì)含量為41.2％,脂質(zhì)產(chǎn)量為185.8mg/L;韓松芳等[9]通過對(duì)城市污水中斜生柵藻添加有效微生物菌群(EM菌)及陰離子洗滌劑降解菌(LAS 菌),發(fā)現(xiàn)其干重和油脂產(chǎn)量有顯著的促進(jìn)作用,其油脂產(chǎn)量分別提高了36.2%和21.5%.王長海等[10]發(fā)現(xiàn)紫球藻細(xì)胞的最適生長鹽度為20‰~30‰,且鹽度對(duì)其細(xì)胞內(nèi)葉綠素a、可溶性多糖、可溶性蛋白質(zhì)含量及氮的利用率有一定影響.

目前,對(duì)藻細(xì)胞進(jìn)行鹽脅迫以提高微藻油脂產(chǎn)量已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)之一,但關(guān)于微藻在鹽脅迫下甘油三酯的積累特性卻極少報(bào)道,此外,利用其光合性能輔助判斷藻細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的積累對(duì)于微藻生物能源利用具有深遠(yuǎn)意義.

本研究采用的雙對(duì)柵藻FACHB-78屬于綠藻門(Chlorophyta),是最有可能產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)油脂的藻種之一[11],其生長迅速,分布廣泛,可自養(yǎng)或外加碳源異養(yǎng)繁殖.已有研究表明,柵藻的最大耐鹽度通?？蛇_(dá)到20‰~35‰,且用于改變鹽度條件的NaCl較為廉價(jià),可有效控制脅迫生產(chǎn)甘油三酯的成本.本研究的重點(diǎn)正是探究鹽脅迫條件下藻細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的積累特性及甘油三酯生產(chǎn)的最佳鹽度條件.

1 材料與方法

1.1 藻種

實(shí)驗(yàn)采用國內(nèi)外均有廣泛分布的雙對(duì)柵藻(FACHB-78),藻種購于中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫.

1.2 微藻培養(yǎng)及NaCl脅迫處理

采用BG11培養(yǎng)基[12]將藻種進(jìn)行預(yù)培養(yǎng),將生長至對(duì)數(shù)期末期的藻液離心并洗滌(采用轉(zhuǎn)速8000r/min, 時(shí)長為10min),用少量無菌水懸浮.

通過對(duì)BG11培養(yǎng)基(碳源為Na2CO3)加入不同質(zhì)量NaCl的方式對(duì)微藻進(jìn)行鹽脅迫實(shí)驗(yàn),設(shè)置鹽度(NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù))梯度為0‰、5‰、10‰、15‰、25‰、35‰、45‰,實(shí)驗(yàn)在含有150mL培養(yǎng)基的500mL錐形瓶內(nèi)進(jìn)行,初始藻細(xì)胞接種濃度為106cells/mL,培養(yǎng)溫度為最適溫度(24±1)℃,光照強(qiáng)度為6000lx[13],光暗交替時(shí)間為L:D=12h:12h,培養(yǎng)過程中每日隨機(jī)調(diào)換培養(yǎng)瓶位置,并定時(shí)搖晃4次以使藻細(xì)胞快速、均勻生長.每個(gè)鹽度條件下設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn).

1.3 藻細(xì)胞密度及生物量測(cè)定

藻類生長過程中采用血球計(jì)數(shù)法[14]進(jìn)行藻細(xì)胞計(jì)數(shù),以計(jì)算藻細(xì)胞的濃度及比生長速率;在指數(shù)生長末期,采用激光粒度分布測(cè)定儀(LS230, Beckman Coulter, USA)測(cè)定各鹽度下藻細(xì)胞的直徑分布及平均直徑,采用轉(zhuǎn)速8000r/min, 離心10min后收獲藻細(xì)胞,并利用冷凍干燥法測(cè)定藻類最終生物量[15].

1.4 甘油三酯及總脂含量的測(cè)定

采用優(yōu)化的尼羅紅法[16]測(cè)定甘油三酯的濃度 (mg/L):取指數(shù)生長周期內(nèi)的藻液經(jīng)與二甲基亞砜混合改變細(xì)胞通透性后,加入尼羅紅進(jìn)行染色,避光反應(yīng)15min后采用F-7000熒光分光光度計(jì)測(cè)量其570nm處吸光值(570),采用標(biāo)準(zhǔn)加入法[17]制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,甘油三酯濃度如式(1)所示:

甘油三酯濃度= 0.7098×570+2.7427(2=0.9926) (1)

采用Bligh-Dyer法測(cè)定總脂含量[18].

1.5 可溶性蛋白質(zhì)濃度及含量的測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)法[19]測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)含量.

1.6 色素含量的測(cè)定

取5mL藻液真空抽濾至醋酸纖維濾膜(0.45 μm)上,將濾膜剪碎后裝入50mL離心管中,加入80%丙酮5mL后避光,震蕩并放入4 ℃冰箱,24h后取出,將提取液在8000r/min下離心15min,上清液在紫外分光光度計(jì)下測(cè)量750, 665, 652, 510, 480nm處的吸光度,葉綠素a含量如式(2)所示:

Chl a(mg/mL)=16.29×(665-750)-8.54(652-750)[20](2)

類胡蘿卜素含量如式(3)所示:

Carotenoids(mg/mL)=7.6×[(480-750)-1.49×

(510-750)][21](3)

1.7 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定

采用M系列調(diào)制葉綠熒光成像系統(tǒng) (IMAGING-PAM, WALZ, Germany) 測(cè)定葉綠素?zé)晒鈪?shù)[22].取1.5mL藻液暗適應(yīng)9min進(jìn)行預(yù)處理后放入x-y臺(tái)上,設(shè)定適合的測(cè)量光、光化光、飽和脈沖光后進(jìn)行測(cè)定,獲取實(shí)際光能轉(zhuǎn)化效率(Ⅱ)、非光化學(xué)淬滅系數(shù)(NPQ)的數(shù)值,分析后獲得不同鹽度脅迫對(duì)藻細(xì)胞光合作用的影響.

2 結(jié)果及討論

2.1 鹽脅迫對(duì)柵藻細(xì)胞生長及聚集狀態(tài)的影響

在鹽度分別為0、5‰、10‰、15‰、25‰、35‰、45‰的條件下,雙對(duì)柵藻FACHB-78的生長曲線如圖1所示.在實(shí)驗(yàn)鹽度條件下,鹽脅迫對(duì)藻類生長產(chǎn)生較為明顯的影響.盡管低鹽度對(duì)藻類生長的影響較小,但隨著鹽度的增加,鹽脅迫對(duì)柵藻細(xì)胞生長的抑制作用逐漸增強(qiáng),在鹽度達(dá)到45‰時(shí),藻細(xì)胞生長幾乎停滯.當(dāng)鹽度為5‰時(shí),藻細(xì)胞密度達(dá)到了鹽脅迫下的最大值,指數(shù)生長期末期的藻細(xì)胞密度為6.43′106cells/mL.當(dāng)鹽度為10‰時(shí),雖藻細(xì)胞的適應(yīng)期較鹽度為5‰時(shí)長,但后期藻細(xì)胞生長速度加快,藻細(xì)胞密度逐漸與鹽度為5‰時(shí)接近,達(dá)到了5.94′106cells/mL,比正常培養(yǎng)時(shí)減少了24.38%.

圖1 不同鹽度脅迫下柵藻細(xì)胞生長曲線

藻細(xì)胞密度是反應(yīng)微藻生長特性的一個(gè)重要指標(biāo)[23],生長抑制是NaCl在植物生長中產(chǎn)生毒性的重要標(biāo)志[5].Srivastava等[6]在鹽脅迫下培養(yǎng)小球藻(CG12),培養(yǎng)21d后發(fā)現(xiàn)微藻的生物量減少了25%;Pancha等[24]向培養(yǎng)基中添加NaCl顯著(<0.05)降低了微藻. CCNM 1077的生物質(zhì)含量.本研究顯示,柵藻雖對(duì)低鹽脅迫有一定的適應(yīng)能力,但藻細(xì)胞密度仍然較正常培養(yǎng)下有所下降.

為了進(jìn)一步表征鹽脅迫的影響,觀察了不同鹽度梯度下藻液顏色及聚集狀態(tài).如圖2 (a)所示,培養(yǎng)液中鹽分會(huì)對(duì)藻類生長產(chǎn)生較為明顯的影響,隨著鹽度的逐漸增加,藻液顏色逐漸由最初的嫩綠色過渡為最終的淺黃色.如圖2(b)所示,鹽脅迫對(duì)柵藻細(xì)胞的聚集狀態(tài)也有一定的影響.在鹽度為5‰、10‰、15‰、25‰時(shí),藻細(xì)胞明顯呈現(xiàn)聚集黏連狀態(tài),但在鹽度繼續(xù)升高時(shí),因藻細(xì)胞密度減小,藻細(xì)胞又恢復(fù)散開狀態(tài).在高鹽度(35‰、45‰)脅迫下,明顯可以看出部分藻細(xì)胞呈現(xiàn)梭形,且藻細(xì)胞顏色變淺.

此外,實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了在不同鹽度梯度下藻細(xì)胞內(nèi)類胡蘿卜素/葉綠素a的比值呈現(xiàn)規(guī)律性變化.如表1所示,隨著鹽度的增大,該比值有逐漸上升的趨勢(shì).由于葉綠素a的含量與藻細(xì)胞密度呈現(xiàn)正相關(guān)[25],故隨著鹽度的增加,葉綠素a與類胡蘿卜素的含量整體為下降趨勢(shì),這可能是導(dǎo)致圖2 (a) 所示藻液顏色變化的直接原因.在高鹽度下,隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長,二者含量也有一定程度的下降.類胡蘿卜素/葉綠素a反映了藻細(xì)胞的抗逆能力[26],其數(shù)值隨鹽度的升高而升高(表1),說明柵藻在鹽脅迫下進(jìn)行了一定的自身調(diào)節(jié)以適應(yīng)培養(yǎng)基鹽度的變化,甘油三酯含量的升高是其調(diào)節(jié)的結(jié)果之一.

表1 不同鹽度脅迫條件下類胡蘿卜素/葉綠素a的變化

根據(jù)圖3,指數(shù)生長期末期的藻細(xì)胞粒徑已隨著鹽度的改變發(fā)生了較大變化,隨著鹽度的增大,藻細(xì)胞平均粒徑先增大后減小,在鹽度為10‰時(shí)達(dá)到最大(13.34μm),比正常培養(yǎng)下的細(xì)胞粒徑(10.66μm)增大25.14%.在鹽脅迫環(huán)境下,藻細(xì)胞啟動(dòng)結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)與代謝調(diào)節(jié)機(jī)制以降低細(xì)胞損傷與死亡[27].細(xì)胞內(nèi)通過大量合成有機(jī)滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)(如甘油三酯等)維持細(xì)胞內(nèi)正常的生理功能[28],此時(shí)細(xì)胞內(nèi)滲透壓為達(dá)到與外界平衡的狀態(tài)而吸收水分,導(dǎo)致細(xì)胞直徑變大.

圖3 不同鹽度脅迫下柵藻細(xì)胞(指數(shù)生長期末期)平均粒徑

2.2 鹽脅迫對(duì)柵藻甘油三酯積累的影響

不同鹽度條件下柵藻細(xì)胞內(nèi)甘油三酯濃度變化曲線、指數(shù)生長末期產(chǎn)量及含量分別如圖4 (a)、(b)所示.根據(jù)圖4(a),甘油三酯的積累在第9d后產(chǎn)生明顯差異,鹽度為10‰時(shí)藻細(xì)胞內(nèi)甘油三酯積累水平的響應(yīng)雖慢于鹽度為5‰,但最終積累量逐漸上升,含量為33.41%,比正常培養(yǎng)的對(duì)應(yīng)值高82.09%.根據(jù)圖4 (b),不同鹽度下甘油三酯含量均占總油脂的80%左右,低鹽脅迫對(duì)柵藻細(xì)胞內(nèi)油脂及甘油三酯的積累有一定的促進(jìn)作用.當(dāng)鹽度為5‰、10‰、15‰時(shí),指數(shù)生長期末期的甘油三酯濃度均高于正常培養(yǎng)時(shí)的127.32mg/L,分別達(dá)到了218.53,250.88mg/L, 170.02mg/L,分別比正常培養(yǎng)時(shí)增加了71.64%、97.05%、33.54%,顯然在鹽度為10‰時(shí)達(dá)到最大值.

有研究表明,微藻通過改變自身細(xì)胞的生化組成以響應(yīng)鹽脅迫[29],維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡.在先前的研究中,認(rèn)為細(xì)胞對(duì)滲透壓的調(diào)節(jié)有兩種情況:一是允許鹽或溶質(zhì)流入細(xì)胞,二是細(xì)胞自身產(chǎn)生抵御鹽脅迫的有機(jī)滲透物,而藻細(xì)胞一般為后者[30].在鹽脅迫下,培養(yǎng)環(huán)境的滲透壓改變對(duì)細(xì)胞水勢(shì)產(chǎn)生了直接影響,藻細(xì)胞為了適應(yīng)鹽脅迫,將用于細(xì)胞分裂的部分能量用于有機(jī)滲透物的合成[8].在本研究中,鹽脅迫下藻細(xì)胞濃度與可溶性蛋白質(zhì)含量降低(圖5),而甘油三酯作為細(xì)胞抵御抗逆性的產(chǎn)物,其濃度在一定程度上有所上升,正是印證了這一觀點(diǎn).在較復(fù)雜的滲透壓適應(yīng)中,不僅細(xì)胞質(zhì)的組成發(fā)生了較大變化,胞外多糖的分泌也在一定程度上有所增加[31],使細(xì)胞更容易發(fā)生黏連聚集(圖2(b)),是另外一種細(xì)胞抵御外界環(huán)境變化的應(yīng)激反應(yīng)[32].

圖5 不同鹽度脅迫下柵藻細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)的濃度及含量

2.3 鹽脅迫對(duì)柵藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

微藻的光合活性是反映微藻生長特性的另一個(gè)重要指標(biāo)[23].在藻細(xì)胞的生長過程中,光合活性可通過葉綠素?zé)晒鈪?shù)表征[33].在不同鹽度條件下柵藻的光合性能參數(shù)如圖6所示.(Ⅱ)反映了光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)的實(shí)際光合效率.根據(jù)圖6 (a),隨著鹽度的增加,PSII的實(shí)際光合效率(Ⅱ)逐漸降低,但當(dāng)鹽度不高于15‰時(shí),(Ⅱ)下降較小,且仍有隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長而緩慢上升的趨勢(shì);當(dāng)鹽度高于25‰時(shí),光合效率下降幅度增大,最低至0.1左右.當(dāng)藻細(xì)胞經(jīng)過鹽脅迫后,PSⅡ反應(yīng)中心受損,與光系統(tǒng)Ⅰ(PSⅠ)之間電子傳遞受阻,導(dǎo)致數(shù)值降低,同時(shí)也是導(dǎo)致藻細(xì)胞密度隨鹽度升高而下降的原因之一(圖1).

NPQ的數(shù)值與卡爾文循環(huán)的進(jìn)行呈負(fù)相關(guān).如圖6 (b)所示,隨著鹽度的升高,NPQ的數(shù)值逐漸增大,說明藻細(xì)胞內(nèi)卡爾文循環(huán)受到抑制,出于對(duì)藻細(xì)胞的保護(hù)作用而增強(qiáng)了熱耗散;對(duì)于同一鹽度,隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長,NPQ的數(shù)值有逐漸下降的趨勢(shì),且鹽度越低響應(yīng)時(shí)間越短.當(dāng)鹽度較低時(shí),藻細(xì)胞分裂增殖速度較高鹽度條件仍處于較高水平,這可能與藻細(xì)胞易產(chǎn)生低鹽度脅迫適應(yīng)機(jī)制有關(guān),從而使光合性能得到一定程度的恢復(fù);而在高鹽度下,其下降原因可能為藻細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器嚴(yán)重受損而引起的熱耗散功能喪失[34].在鹽脅迫下,過量的Na+阻礙了類囊體膜上氣孔的開閉,導(dǎo)致藻細(xì)胞的光合性能下降,此時(shí)細(xì)胞內(nèi)過量的能量則轉(zhuǎn)移到還原性化合物(如中性脂)中[6],從而增強(qiáng)藻細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的合成.低鹽脅迫時(shí),藻細(xì)胞密度的下降程度不大,甘油三酯積累量的增加較為明顯;高鹽脅迫時(shí),由于藻細(xì)胞密度受NaCl影響較大,故甘油三酯的積累量仍然低于正常水平,這也進(jìn)一步印證了圖4的結(jié)果.

3 結(jié)論

3.1 在鹽度為5‰、10‰、15‰、25‰、35‰、45‰的條件下,雙對(duì)柵藻FACHB-78的生長受到抑制,藻細(xì)胞密度均低于正常培養(yǎng),且隨著鹽度的增大,抑制程度增加.

3.2 雙對(duì)柵藻FACHB-78的甘油三酯積累量在低鹽脅迫下有一定的增長,在鹽度為10‰時(shí)達(dá)到最大值.

3.3 雙對(duì)柵藻FACHB-78的(Ⅱ)值隨鹽度的增加而逐漸降低,NPQ隨著鹽度的增加而逐漸增加,但在低鹽脅迫時(shí)影響較小,且有隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長逐漸平穩(wěn)的趨勢(shì).

3.4 雙對(duì)柵藻FACHB-78在鹽度為10‰時(shí),藻細(xì)胞密度較高,藻細(xì)胞光合性能較高,藻細(xì)胞直徑較大且互相黏連,沉降性能較好,容易收集,甘油三酯濃度達(dá)到250.88mg/L,比正常培養(yǎng)增加97.05%.

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Optimization of salt stress condition for accumulation of triglycerides inFACHB-78.

WANG Xu1, SUN Xin1*, LI Peng-fei1, WANG Jia-le1, CHENG Zhi-wen2

(1.Key Laboratory of Northwest Water Resource, Environment and Ecology, Ministry of Education, Shaanxi Key Laboratory of Environmental Engineering, Xi’an University of Architecture and Technology, Xi’an 710055, China；2.Xianyang Research & Design Institute of, Ceramics, Xianyang 712000, China).2019,39(12)：5248~5253

The growth morphology, triglyceride accumulation, photosynthetic activity and other characteristics ofFACHB-78 were studied under the conditions of NaCl concentration ranging from 0 to 45‰, and the optimal salt stress condition was determined. The results showed that with the increase of salinity, the density of algae cells gradually decreased, the ratio of chlorophyll a content to carotenoid content gradually increased, but the accumulation of triglyceride increased first and decreased thereafter. When the salinity was 10‰, the density of algae cells was 26.30% lower than that in normal medium, and the level and content of triglyceride both achieved the maximum values of 250.88mg/L and 33.41%, respectively, which were 97.05% and 82.09% higher than those in normal medium. Additionally, the Photosynthesis was relatively active. For the production of biodiesel, under the stress of salinity of 10‰,FACHB-78 cells had greater advantages over algae cells cultured under normal medium.

；salt stress；triglyceride；chlorophyll fluorescence

X171

A

1000-6923(2019)12-5248-06

王 垿(1995-),女,山東泰安人,西南建筑科技大學(xué)碩士研究生,主要從事微藻生物質(zhì)能源研究.

2019-05-24

“十三五”國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2016YFC0701001-02);陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃項(xiàng)目 (2015KTCL-03-15)

* 責(zé)任作者, 教授, xinsunn@163.com