楊春瀾， 孟祥武， 鄭 龍， 陳 娟， 羅 超

(湖北民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 湖北 恩施 445000)

腦血管疾病是一種具有極高發(fā)病率和死亡率的疾病。最常見的腦血管疾病類型是急性血管狹窄引起的腦血液缺乏，大多數(shù)患者具有神經(jīng)功能損傷，該疾病給社會(huì)和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)。目前使用的腦出血治療藥物包括溶栓劑和抗血小板藥物，但由于治療時(shí)間窗口和治療不良反應(yīng)的局限性導(dǎo)致這些藥物的使用極為有限，我們?nèi)栽趯ふ抑委熌X缺血的高效藥物[1-3]。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要免疫和炎癥細(xì)胞，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷敏感，在生理狀態(tài)下，它占腦細(xì)胞總數(shù)的10%。當(dāng)小膠質(zhì)細(xì)胞損害較重時(shí)，其被連續(xù)或過度活化，釋放出大量的氮氧化物和氧自由基等，這會(huì)增加神經(jīng)的損傷[4-5]。中藥大黃在中國(guó)具有上千年的應(yīng)用歷史，但是其在腦血管疾病中的作用機(jī)制研究尚未十分清楚。我們將建立缺糖/缺氧(hypoglycemia/hypoxia，HH)誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞損傷模型，觀察大黃素(emodin)對(duì)缺糖/缺氧損傷的小膠質(zhì)細(xì)胞存活率、凋亡率及Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)/核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信號(hào)通路的影響，揭示大黃減輕小膠質(zhì)細(xì)胞損傷的作用機(jī)制與TLR4/NF-κB信號(hào)通路的關(guān)系。

材 料 和 方 法

1 材料

小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV2購(gòu)自北京中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、MTT和胰蛋白酶均購(gòu)自Sellect；LipofectamineTM2000試劑盒購(gòu)自Invitrogen; BCA蛋白定量試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊公司；PVDF膜購(gòu)自Roche； SDS-PAGE 試劑盒、ECL發(fā)光液和RIPA蛋白裂解液均購(gòu)自TaKaRa；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)檢測(cè)試劑盒和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒均購(gòu)自碧云天；Annexin V- FITC / PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV2，放置在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

2.2缺糖/缺氧誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞損傷模型的建立及分組 按照張百芳等[6]方法，對(duì)BV2細(xì)胞進(jìn)行無(wú)糖培養(yǎng)加低氧(94% N2，5% CO2，1% O2)培養(yǎng)8 h，再更換為正常的培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，即為缺糖/缺氧誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞損傷模型，標(biāo)記為缺糖/缺氧(HH)組；常規(guī)培養(yǎng)的BV2細(xì)胞標(biāo)記為空白(blank)組；將大黃素(20、40、80 μmol/L)處理缺糖/缺氧組細(xì)胞48 h，分別標(biāo)記為缺糖/缺氧+大黃素20 μmol/L(HH+ emodin 20 μmol/L)組、缺糖/缺氧+大黃素40 μmol/L(HH+emodin 40 μmol/L)組和缺糖/缺氧+大黃素80 μmol/L(HH+ emodin 80 μmol/L)組；用DMSO處理缺糖/缺氧組細(xì)胞48 h標(biāo)記為缺糖/缺氧+DMSO(HH+DMSO)組；將pcDNA和pcDNA-TLR4用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染至BV2細(xì)胞后再依次進(jìn)行缺糖/缺氧和40 μmol/L大黃素處理，標(biāo)記為缺糖/缺氧+pcDNA +大黃素40 μmol/L(HH+pcDNA+emodin)組和缺糖/缺氧+pcDNA-TLR4+大黃素40 μmol/L(HH+pcDNA-TLR4+emodin)組。

2.3MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力 將細(xì)胞制成混懸液，調(diào)整密度至1×107/L，然后接種至96孔板，按2.2分組處理細(xì)胞后，每孔加MTT溶液(5 g/L)20 μL，孵育4 h，終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液上清，然后每孔加150 μL DMSO，振蕩使結(jié)晶充分溶解，在490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)細(xì)胞吸光度(A)值。細(xì)胞存活率(%)=A490待測(cè)樣品/A490對(duì)照×100%。

2.4ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞上清液中LDH和 TNF-α的含量 按照乳酸脫氫酶試劑盒和腫瘤壞死因子α檢測(cè)試劑盒的要求檢測(cè)細(xì)胞上清液中LDH和TNF-α的含量。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡 將細(xì)胞用 500 μL 的binding buffer懸浮細(xì)胞，分別加入5 μL的Annexin V/FITC避光反應(yīng)20 min后再加入5 μL的PI避光反應(yīng)20 min，用300目銅篩過濾，在1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。細(xì)胞的凋亡率(%)= 早期凋亡率+晚期凋亡率。

2.6Western blot檢測(cè)細(xì)胞中Bax、Bcl-2、TLR4、p-IκB和IκB的蛋白水平 RIPA裂解液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行冰上蛋白裂解30 min，提取總蛋白，用BCA試劑盒檢測(cè)樣品蛋白的濃度。按照4∶1的比例加入蛋白上樣緩沖液，沸水浴中變性5 min，離心取上清，取60 μg目的蛋白和Marker蛋白進(jìn)行SDS-PAGE。結(jié)束后，用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗滌，4 ℃條件下，將封閉后的PVDF膜放入已稀釋的 I 抗中孵育過夜，以封閉液洗膜3次，每次5 min，再在37 ℃下將PVDF膜轉(zhuǎn)入已稀釋的 II 抗中孵育2 h。在暗室內(nèi)用ECL試劑盒顯影曝光：滴加化學(xué)發(fā)光劑顯色、成像，Image J圖像分析軟件分析處理，以β-actin為內(nèi)參照。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大黃素對(duì)缺糖/缺氧誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞活力的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組相比，缺糖/缺氧組和缺糖/缺氧+DMSO組的BV2細(xì)胞的細(xì)胞活力顯著降低；與缺糖/缺氧+DMSO組相比，缺糖/缺氧+大黃素20 μmol/L組、缺糖/缺氧+大黃素40 μmol/L組和缺糖/缺氧+大黃素80 μmol/L組的細(xì)胞活力均顯著升高；與缺糖/缺氧+大黃素20 μmol/L組相比，缺糖/缺氧+大黃素40 μmol/L組的細(xì)胞活力顯著升高(P<0.05)，見表1。

2 大黃素對(duì)缺糖/缺氧誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞損傷的影響

與空白組相比，缺糖/缺氧組和缺糖/缺氧+DMSO組的BV2細(xì)胞中LDH和 TNF-α的含量均顯著升高；與缺糖/缺氧+DMSO組相比，缺糖/缺氧+大黃素20 μmol/L組、缺糖/缺氧+大黃素40 μmol/L組和缺糖/缺氧+大黃素80 μmol/L組的BV2細(xì)胞中LDH和 TNF-α的含量均顯著降低；與缺糖/缺氧+大黃素20 μmol/L組相比，缺糖/缺氧+大黃素40 μmol/L組的BV2細(xì)胞中LDH和 TNF-α的含量均顯著降低(P<0.05)，見表1。

3 大黃素對(duì)缺糖/缺氧誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響

與空白組相比，缺糖/缺氧組和缺糖/缺氧+DMSO組的BV2細(xì)胞凋亡率顯著升高；與缺糖/缺氧+DMSO組相比，缺糖/缺氧+大黃素20 μmol/L組、缺糖/缺氧+大黃素40 μmol/L組和缺糖/缺氧+大黃素80 μmol/L組的細(xì)胞凋亡率顯著降低；與缺糖/缺氧+大黃素20 μmol/L組相比，缺糖/缺氧+大黃素40 μmol/L組的細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，見表1。

4 大黃素對(duì)缺糖/缺氧誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白水平的影響

與空白組相比，缺糖/缺氧組和缺糖/缺氧+DMSO組的BV2細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低；與缺糖/缺氧+DMSO組相比，缺糖/缺氧+大黃素20 μmol/L組、缺糖/缺氧+大黃素40 μmol/L組和缺糖/缺氧+大黃素80 μmol/L組的BV2細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)顯著降低，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高；與缺糖/缺氧+大黃素20 μmol/L組相比，缺糖/缺氧+大黃素40 μmol/L組的BV2細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)顯著降低，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，見圖1A、表2。

Figure 1.Western blot analysis of BV2 cell apoptosis related-protein (A) and TLR4/NF-κB signaling pathway protein (B) levels.

5 大黃素對(duì)缺糖/缺氧誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響

與空白組相比，缺糖/缺氧組和缺糖/缺氧+DMSO組的BV2細(xì)胞中TLR4和p-IκB的蛋白水平顯著升高，IκB的蛋白水平變化的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；與缺糖/缺氧+DMSO組相比，缺糖/缺氧+大黃素20 μmol/L組、缺糖/缺氧+大黃素40 μmol/L組和缺糖/缺氧+大黃素80 μmol/L組的BV2細(xì)胞中TLR4和p-IκB的蛋白水平顯著降低，IκB的蛋白水平變化的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；與缺糖/缺氧+大黃素20 μmol/L組相比，缺糖/缺氧+大黃素40 μmol/L組的BV2細(xì)胞中TLR4和p-IκB的蛋白水平顯著降低(P<0.05)，IκB的蛋白水平變化的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性,見圖1B、表2。

表2 大黃素對(duì)缺糖/缺氧誘導(dǎo)BV2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白及TLR4/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

6 過表達(dá)TLR4削弱大黃素對(duì)缺糖/缺氧誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞的保護(hù)作用

與缺糖/缺氧+DMSO組相比，缺糖/缺氧+大黃素40 μmol/L組的BV2細(xì)胞中TLR4蛋白表達(dá)顯著降低，細(xì)胞活力顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低；與缺糖/缺氧+pcDNA +大黃素40 μmol/L組相比，缺糖/缺氧+pcDNA-TLR4+大黃素40 μmol/L組的BV2細(xì)胞中TLR4蛋白表達(dá)顯著升高，細(xì)胞活力顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，見圖2、表3。

Figure 2.Detection of the expression of TLR4 protein in microglia.

表3 過表達(dá)TLR4削弱大黃素對(duì)缺糖/缺氧誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用

討 論

大黃又稱西大黃，將軍等，其在中國(guó)有30多個(gè)品種，廣泛用于治療各種疾病。目前檢測(cè)到的大黃的有效的成分包括大黃多糖、大黃素、大黃粉和大黃素甲醚。中醫(yī)理論研究認(rèn)為，大黃味苦寒，主要作用于大腸、胃和心包等，效果是冷卻血液、止血、促進(jìn)血液循環(huán)和腹瀉，其不僅在常見疾病的治療中取得了良好的效果，在各種重癥疾病中也取得了良好的效果[7-9]。曾丹等[10]報(bào)道，臭牡丹大黃素可通過TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路在臭氧應(yīng)激小鼠中發(fā)揮抗炎作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)，大黃可明顯上調(diào)缺糖/缺氧誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞的存活率，深入研究發(fā)現(xiàn)，大黃可以明顯下調(diào)TLR4，進(jìn)而失活NF-κB信號(hào)通路，推測(cè)大黃是通過TLR4/NF-κB信號(hào)通路保護(hù)小膠質(zhì)細(xì)胞受損的。

TLR4作為“蛋白質(zhì)”啟動(dòng)機(jī)體的炎癥鏈反應(yīng)的門戶，是Toll樣受體家族的主要成員。據(jù)報(bào)道，TLR4在腦缺血再灌注中可激活NF-κB信號(hào)，引起大量的炎癥因子分泌，損傷腦組織[11-13]。孫鵬等[14]研究報(bào)道，缺氧復(fù)氧后的BV-2細(xì)胞中TLR4和NF-κB p65的含量顯著升高，并且細(xì)胞上清液中TNF-α的含量也明顯的升高，這說明TLR4參與調(diào)節(jié)缺氧復(fù)氧的BV-2細(xì)胞的炎癥因子分泌。我們的研究建立了缺糖/缺氧誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞損傷模型，通過實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，TLR4、p-IκB的蛋白表達(dá)都明顯升高，即TLR4在受損的BV-2細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并激活NF-κB通路，這與前人的研究結(jié)果相一致，再次驗(yàn)證TLR4/ NF-κB信號(hào)通路在缺糖/缺氧誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞損傷中的作用。深入研究我們發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)TLR4可削弱大黃素對(duì)缺糖/缺氧誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用，這說明了其機(jī)制可能與失活TLR4/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。