張廣華， 鐵婷婷， 巨 虎， 許常林， 肖宗宇△， 苑 樂

(青海大學附屬醫(yī)院 1神經(jīng)外科， 2神經(jīng)內(nèi)科， 3教學管理部， 青海 西寧 810001)

缺血誘導的神經(jīng)損傷等是臨床上常見的引發(fā)神經(jīng)功能障礙的重要因素之一，其嚴重威脅著人類的生命健康[1]。缺血可以誘發(fā)神經(jīng)組織中細胞發(fā)生級聯(lián)反應，從而促進組織中的細胞凋亡，使得組織中的細胞之間信號傳遞受到阻礙，誘發(fā)患者殘疾或死亡[2]。研究顯示，氧化應激是引發(fā)神經(jīng)細胞損傷發(fā)生的重要原因，減輕神經(jīng)細胞氧化損傷是目前急需解決的問題[3]。微小RNA(microRNA， miRNA， miR)是近年來新發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA分子，可以通過與特定的mRNA分子相結(jié)合而調(diào)控基因的表達，在神經(jīng)生長、細胞凋亡和脂肪代謝等過程中發(fā)揮廣泛的生物學作用，是生物體發(fā)育及細胞分化過程中重要且功能廣泛的調(diào)控因子[4-6]。近年來miRNA在神經(jīng)損傷中的作用越來越受到廣泛關(guān)注，其可以通過調(diào)控下游靶基因的表達而發(fā)揮生物學作用[7]。miR-422a是一個在人體組織生理和病理過程中均有調(diào)控作用的miRNA分子，參與細胞生長和凋亡等過程，miR-422a在過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)刺激的神經(jīng)細胞中表達下降，并且其表達水平的高低與細胞凋亡程度呈負相關(guān)[8]。性別決定區(qū)Y框6(sex-determining region Y box 6， SOX6)在人體組織中廣泛表達，SOX6在缺氧誘導的神經(jīng)損傷中發(fā)揮促進作用[9]。我們前期的預實驗發(fā)現(xiàn)SOX6可能是miR-422a的靶基因，本次的實驗探討miR-422a在H2O2誘導的大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞株P(guān)C12(具有神經(jīng)細胞特性)損傷中的作用和機制，為明確氧化應激誘導的神經(jīng)細胞損傷機制提供參考。

材 料 和 方 法

1 材料

大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞株P(guān)C12購自ATCC。乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)含量測定試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司；cDNA合成試劑盒和real-time PCR試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；H2O2購自Sigma；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；mimics control和miR-422a mimics由上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司合成；陰性對照載體(pcDNA3.1)和SOX6過表達載體(pcDNA3.1-SOX6)由廣州輝駿生物科技有限公司構(gòu)建；螢光素酶報告基因載體由南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司構(gòu)建；Lipofectamine 2000和TRIzol試劑購自Invitrogen。

2 方法

2.1real-time PCR法測定H2O2處理后PC12細胞中miR-422a的表達 用含H2O2(濃度為0和300 μmol/L)的細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)PC12細胞，分別記為對照(control)組和H2O2組，細胞培養(yǎng)12 h以后，用real-time PCR法測定miR-422a表達水平。收集細胞，在細胞中添加TRIzol試劑，提取各組細胞中的總RNA，然后用紫外分光光度計檢測A260/A280的比值，提取的RNAA260/A280的比值在1.8～2.0之間，可用于后續(xù)實驗。使用cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄，然后以U6作為內(nèi)參照，進行PCR擴增，PCR條件為：95℃預變性2 min；92 ℃變性10 s、58 ℃退火30 s，共40個循環(huán)。U6的上游引物序列為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列為5’-AACGCTTCACGGAATTTGCGT-3’；miR-422a的上游引物序列為5’-GGGACTGGACTTAGGGTCA-3’， 下游引物序列為5’-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3’。

2.2細胞轉(zhuǎn)染和分組 PC12細胞分成4組，依次為control組、H2O2組、miR-NC+H2O2組和miR-422a+H2O2組。control組和H2O2組的處理方法同2.1。miR-NC+H2O2組和miR-422a+H2O2組分別為轉(zhuǎn)染mimics control和miR-422a mimics后的PC12細胞，用含有H2O2濃度為300 μmol/L的細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。細胞轉(zhuǎn)染用Lipofectamine 2000，轉(zhuǎn)染步驟同轉(zhuǎn)染試劑說明書。細胞培養(yǎng)12 h以后，用real-time PCR方法檢測H2O2、miR-NC+H2O2組和miR-422a+H2O2組的細胞中miR-422a的表達水平，評估轉(zhuǎn)染miR-422a mimics對H2O2刺激下PC12細胞中miR-422a水平的影響，步驟同2.1。

2.3MTT法測定細胞活力 按照control、H2O2、miR-NC+H2O2、miR-422a+H2O2分組將細胞種植到96孔板中，放置在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)12 h以后，將培養(yǎng)板取出，在每個孔中依次添加10 μL的MTT溶液(5 g/L)，放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h以后，取出培養(yǎng)板，將孔內(nèi)的的液體吸棄，加入150 μL的DMSO溶液，震蕩反應10 min，在酶標儀上檢測每個孔的A值，經(jīng)過空白孔調(diào)零以后，計算細胞存活率。

2.4LDH漏出率的檢測 將control、H2O2、miR-NC+H2O2和miR-422a+H2O2各組細胞培養(yǎng)12 h后，分別收集培養(yǎng)液上清和細胞，使用試劑盒檢測LDH含量，計算上清和細胞中總LDH含量，以上清中LDH含量與總LDH含量的百分比作為LDH漏出率。LDH檢測步驟同試劑盒說明。

2.5流式細胞術(shù)測定細胞凋亡 將control、H2O2、miR-NC+H2O2、miR-422a+H2O2各組細胞培養(yǎng)12 h后收集細胞，用結(jié)合緩沖液將細胞懸浮以后，添加10 μL的Annexin V-FITC染色液混合以后，再加入5 μL的PI染液，用流式細胞術(shù)測定細胞凋亡情況。

2.6miR-422a靶基因的預測及鑒定 使用靶基因預測軟件TargetScan預測miR-422a的靶基因，miR-422a與SOX6的3’UTR端有互補結(jié)合位點，將SOX6的互補結(jié)合位點突變，構(gòu)建突變型螢光素酶報告基因載體(MUT)，同時構(gòu)建野生型螢光素酶報告基因載體(WT)，將MUT和WT分別同mimics control和miR-422a mimics共轉(zhuǎn)染到PC12細胞中，培養(yǎng)48 h以后，檢測螢光素酶活性的變化。

2.7Western blot檢測SOX6蛋白的表達 將control、H2O2、miR-NC+H2O2和miR-422a+H2O2各組細胞培養(yǎng)12 h后，收集細胞，用蛋白裂解試劑分別提取總蛋白，收集的蛋白液同SDS-PAGE上樣緩沖液充分混合，置于100 ℃條件下煮沸5 min。蛋白電泳時，在每個上樣孔內(nèi)分別添加30 μg樣品，濃縮膠中80 V，分離膠中120 V，等到溴酚藍染料已經(jīng)進入到玻璃板的底部以后，停止電泳。設(shè)置300 mA電流轉(zhuǎn)膜，把濃縮膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到大小合適的NC膜上，轉(zhuǎn)膜共120 min。取出NC膜，然后放置在5%脫脂奶粉TBST封閉液內(nèi)，震蕩孵育1h。把NC膜置于含有 I 抗稀釋液中的抗體孵育袋中，放在4 ℃條件下過夜。然后取出NC膜，放在1∶4 000稀釋后的 II 抗稀釋液內(nèi)，在室溫條件下孵育2 h。使用ECL化學發(fā)光，軟件Quantity one分析條帶灰度值。GAPDH為內(nèi)參照。分析蛋白表達水平。

2.8SOX6過表達對細胞活力、凋亡和LDH漏出的影響 在PC12細胞中分別共轉(zhuǎn)染miR-422a mimics、SOX6過表達載體和miR-422a mimics對照載體，使用H2O2濃度為300 μmol/L的細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，記為miR-422a+H2O2+SOX6組和miR-422a+H2O2+vector組。細胞培養(yǎng)12 h以后，檢測細胞活力、LDH漏出率和細胞凋亡，步驟同上。

3 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 21.0分析，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，兩組數(shù)據(jù)間比較用t檢驗，多組差異比較用單因素方差，各組均數(shù)間的兩兩比較用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 H2O2誘導PC12細胞中miR-422a表達下調(diào)

PC12細胞經(jīng)過H2O2處理以后，與對照組相比，細胞中的miR-422a水平下降(P<0.01)，見圖1。

Figure 1.The expression of miR-422a in the PC12 cells before and after H2O2 treatment. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group.

2 miR-422a mimics提高H2O2刺激下PC12細胞中miR-422a的水平

在PC12細胞中轉(zhuǎn)染miR-422a mimics，經(jīng)過H2O2誘導處理以后，細胞中的miR-422a水平顯著上調(diào)(P<0.05)。miR-422a mimics提高H2O2刺激下PC12細胞中miR-422a水平，見圖2。

Figure 2.The expression of miR-422a in the PC12 treated with H2O2 and transfected with miR-422a mimics. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs miR-NC+H2O2 group.

3 miR-422a對H2O2刺激下PC12細胞凋亡、LDH漏出和細胞活力的影響

PC12細胞經(jīng)過H2O2誘導處理以后，細胞凋亡率升高，細胞LDH漏出率也升高，細胞活力下降。在PC12細胞中轉(zhuǎn)染miR-422a mimics，在同樣條件下經(jīng)過H2O2誘導處理以后，細胞凋亡率下降，LDH漏出率也下降，細胞活力升高(P<0.05)，見圖3。這說明miR-422a抑制H2O2誘導的PC12細胞凋亡和LDH漏出，提高細胞活力。

Figure 3.The effects of miR-422a on the apoptosis, LDH leakage and viability of PC12 cells treated with H2O2. A: the results of flow cytometry for analyzing the apoptotic rate of PC12 cells treated with H2O2; B: the cell LDH leakage rate; C: the cell viability was detected by MTT assay. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group; &P<0.05 vs miR-NC+H2O2 group.

4 miR-422a靶向調(diào)控SOX6

經(jīng)過靶基因在線預測軟件發(fā)現(xiàn)miR-422a與SOX6的3’UTR有互補結(jié)合位點，見圖4A；螢光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，WT和miR-422a mimics共轉(zhuǎn)染后細胞螢光素酶活性降低(P<0.05)，見圖4B。這說明miR-422a靶向調(diào)控SOX6。

Figure 4.miR-422a targeted and regulated SOX6. A: bioinformatics software predicted the complementary binding sites between miR-422a and SOX6 3’UTR; B: luci-ferase activity changes. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs miR-NC group.

5 miR-422a負調(diào)控SOX6蛋白表達

PC12細胞經(jīng)過H2O2誘導處理以后，細胞中SOX6蛋白水平升高。在PC12細胞中轉(zhuǎn)染miR-422a mimics，經(jīng)過H2O2誘導處理以后，細胞中SOX6蛋白水平降低(P<0.05)，提示miR-422a抑制H2O2誘導的PC12細胞中SOX6蛋白表達，見圖5。

Figure 5.miR-422a reduced SOX6 expression in the PC12 cells treated with H2O2. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group; &P<0.05 vs miR-NC+H2O2 group.

6 SOX6過表達載體逆轉(zhuǎn)過表達miR-422a對H2O2處理后PC12細胞凋亡、LDH漏出和細胞活力的影響

在PC12細胞中共轉(zhuǎn)染SOX6過表達載體和miR-422a mimics，細胞中的SOX6蛋白水平升高，細胞凋亡率升高，LDH漏出率也升高，細胞活力降低，與共轉(zhuǎn)染對照載體和miR-422a mimics的細胞比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖6和表1。

Figure 6.Reversal effect of SOX6 over-expression vector on inhibition of SOX6 protein expression and apoptosis by miR-422a overexpression in the PC12 cells treated with H2O2. A: the images of Western blot for determining the SOX6 protein level in the PC12 cells transfected with SOX6 over-expression vector; B: the images of flow cytometry for analyzing the apoptosis of the PC12 cells transfected with SOX6 over-expression vector.

表1 SOX6過表達逆轉(zhuǎn)過表達miR-422a對H2O2處理后PC12細胞凋亡、LDH漏出率和細胞活力的作用Table 1.The effects of SOX6 over-expression on apoptotic rate, LDH leakage and viability of PC12 cells under H2O2 exposure and transfected with miR-422a mimics (Mean±SD. n=3)

討 論

神經(jīng)細胞氧化損傷是引發(fā)神經(jīng)相關(guān)疾病發(fā)生的重要原因，神經(jīng)細胞受到氧化應激的刺激以后，細胞過度凋亡，導致原來完整的神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能受到破壞[10]。PC12細胞是一種形態(tài)、結(jié)構(gòu)等功能同神經(jīng)元極為相似的細胞株，被廣泛應用于神經(jīng)細胞功能的研究中[11]。H2O2是體內(nèi)氧化應激反應的產(chǎn)物，其極易擴散，參與細胞凋亡、增殖等多種生理及生化過程，H2O2被廣泛應用于研究氧化應激誘導的神經(jīng)損傷模型[12-13]。我們的實驗發(fā)現(xiàn)，用H2O2處理PC12細胞，其活力降低，細胞LDH漏出率升高，細胞凋亡增加，說明H2O2處理可以誘導PC12細胞損傷，構(gòu)建了氧化應激損傷模型。

miR-422a是目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的與細胞生物學作用有關(guān)的調(diào)節(jié)因子，在腫瘤中的研究較為廣泛，能夠通過影響腫瘤細胞的增殖、分化等調(diào)控腫瘤進展[14-16]。之前的研究報道顯示，miR-422a在神經(jīng)細胞氧化損傷模型中表達下降[8]。我們的實驗同樣發(fā)現(xiàn)H2O2處理后的PC12細胞中miR-422a表達水平降低，并且上調(diào)其表達后可以減少H2O2誘導的細胞損傷，這為研究miR-422a在神經(jīng)細胞損傷中的作用提供了參考。

很多研究報道顯示，miRNA分子調(diào)控機制與靶向影響下游蛋白的表達有關(guān)，并且這種調(diào)控作用大多數(shù)為負調(diào)控作用[17-19]。SOX6是一個具有廣泛作用的調(diào)控基因，在腫瘤、軟骨分化和缺氧誘導的神經(jīng)損傷等過程中均有重要功能[9, 20-21]。研究顯示，SOX6參與缺氧誘導的神經(jīng)細胞凋亡過程，在神經(jīng)損傷中可能發(fā)揮促進作用，下調(diào)SOX6發(fā)揮抗神經(jīng)細胞損傷作用[9]。我們的實驗發(fā)現(xiàn)，miR-422a靶向調(diào)控SOX6，并且過氧化氫處理后的神經(jīng)細胞中SOX6蛋白水平升高，而上調(diào)SOX6可以逆轉(zhuǎn)miR-422a對H2O2誘導的神經(jīng)細胞損傷的抑制作用，這說明miR-422a可靶向抑制SOX6表達以發(fā)揮保護H2O2神經(jīng)細胞損傷的作用，這與上述SOX6在神經(jīng)細胞損傷中的作用一致。

綜上所述，miR-422a參與H2O2誘導的神經(jīng)損傷過程，且可以作用于靶基因SOX6而發(fā)揮作用，這為研究miR-422a在神經(jīng)損傷中的作用和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了參考，為研究神經(jīng)損傷分子發(fā)生機制提供了參考依據(jù)。我們的實驗只在PC12細胞中進行了體外實驗，沒有在原代神經(jīng)細胞和體內(nèi)進行驗證，在后續(xù)實驗中會對上述部分進行探討，以期為闡明miR-422a分子調(diào)控機制提供參考資料。