張志發(fā)， 龍 思， 吳婭琴， 王學(xué)仁

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院麻醉科， 湖北 武漢 430030)

惡性腫瘤術(shù)后轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是影響患者預(yù)后的主要因素之一。近年研究發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤術(shù)后發(fā)生局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移不僅與其自身的異質(zhì)性相關(guān)，也與圍術(shù)期麻醉藥物的使用有關(guān)。丙泊酚(propofol)是一種常用的靜脈麻醉藥，被廣泛應(yīng)用于各類(lèi)腫瘤手術(shù)的誘導(dǎo)、維持以及術(shù)后ICU的鎮(zhèn)靜，其對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響亦引起較多的關(guān)注。目前研究報(bào)道丙泊酚對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響具有雙向性，既具有抑制卵巢癌細(xì)胞侵襲能力的功能[1]，也具有促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的特性[2]，甚至于對(duì)同一組織類(lèi)型來(lái)源而分化程度不同的腫瘤細(xì)胞株的影響也不盡相同[3-4]。因此，丙泊酚對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及機(jī)制值得深入的研究。較多的臨床研究證實(shí)，富半胱氨酸血管生成誘導(dǎo)因子61(cysteine-rich angiogenic inducer 61,CYR61)、CD44v6[5]和基質(zhì)金屬蛋白酶7(matrix metalloprotei-nase-7,MMP-7)[6]3種分子與術(shù)后胃癌發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)，但丙泊酚是否影響上述3種蛋白的表達(dá)進(jìn)而改變胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的特性，目前尚不清楚。本研究以人胃癌細(xì)胞SGC-7901作為研究對(duì)象，探討臨床濃度的丙泊酚對(duì)其CYR61、CD44v6和 MMP-7的表達(dá)及體外侵襲和遷移能力的影響。

材 料 和 方 法

1 材料

人胃癌細(xì)胞株SGC-7901購(gòu)自中科院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，其中添加1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素。在37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代，選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。DMSO溶解丙泊酚至所需濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2 主要試劑

RPMI-1640和胎牛血清(HyClone);丙泊酚(Sigma);DMSO(Sigma);兔抗CYR61抗體(CST);鼠抗CD44v6抗體和兔抗MMP-7抗體(Abcam)。酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific)；Matrigel(BD)。

3 主要方法

3.1MTT法測(cè)定細(xì)胞活力 細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，以5×107/L細(xì)胞密度接種于96孔板，每孔100 μL，設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。加入不同濃度(1、3、5和7 mg/L)丙泊酚處理，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h，隨后每孔加入90 μL新鮮培養(yǎng)液和10 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸除培養(yǎng)液，加入DMSO溶液150 μL并振蕩反應(yīng)10 min，使結(jié)晶物充分溶解。用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm 處吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)活力。細(xì)胞相對(duì)活力(%)=(實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值)/(對(duì)照組A值-空白組A值)×100%。

3.2細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 將稀釋后的Matrigel(每孔30 μL)平鋪于Transwell板上室中，37 ℃靜置3 h，制成凝膠備用。Transwell板下室中每孔加入500 μL含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，上室中每孔加入300 μL含不同濃度丙泊酚的無(wú)血清細(xì)胞懸液(細(xì)胞密度為1×108/L)。在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，取出小室，吸除培養(yǎng)液，擦拭小室上層未侵襲的細(xì)胞，甲醇固定30 min，結(jié)晶紫染色5 min，將小室倒置，顯微鏡下觀察小室濾膜底下室附著的細(xì)胞，進(jìn)行觀察并拍照。每組隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)每一視野內(nèi)穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，每個(gè)實(shí)驗(yàn)5個(gè)復(fù)孔。

3.3劃痕愈合實(shí)驗(yàn) 以1×108/L的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%后，換無(wú)血清培養(yǎng)基同步化12 h。用1 mL槍頭在單層細(xì)胞上做線性劃痕，棄掉培養(yǎng)基，PBS洗3遍，每孔加入含不同濃度丙泊酚的完全培養(yǎng)基，在顯微鏡下觀察并拍照記錄劃痕寬度，記為0時(shí)劃痕寬度。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后在同一觀察點(diǎn)測(cè)量劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞劃痕愈合率。劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h 劃痕寬度×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每個(gè)實(shí)驗(yàn)5個(gè)復(fù)孔。

3.4Western blot實(shí)驗(yàn) 丙泊酚處理細(xì)胞24 h后，加入適量的RIPA全裂解液裂解，提取細(xì)胞總蛋白，利用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。在細(xì)胞總蛋白樣品中加入loading buffer，沸水使其充分變性。然后，用SDS-PAGE分離蛋白，經(jīng)蛋白轉(zhuǎn)膜、封閉、Ⅰ抗(CYR61抗體1∶1 000稀釋?zhuān)珻D44v6抗體1∶1 000稀釋?zhuān)琈MP-7抗體1∶600稀釋)及Ⅱ抗孵育雜交后進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。以β-actin 為內(nèi)參照，對(duì)條帶進(jìn)行灰度掃描，比較各蛋白的表達(dá)變化。

3.5細(xì)胞免疫組化 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后調(diào)整細(xì)胞密度至1×108/L。將無(wú)菌處理的蓋玻片均勻鋪于6孔板中，接種細(xì)胞懸液后培養(yǎng)24 h，吸除培養(yǎng)基，PBS洗3遍，加入丙泊酚處理上述細(xì)胞24 h后取出蓋玻片進(jìn)行免疫組化染色。PBS漂洗、4%多聚甲醛固定以及0.5% Triton X-100 37 ℃溫育后，3% H2O2作用15 min，滴加山羊血清工作液封閉，進(jìn)行Ⅰ抗孵育(CYR61抗體1∶100稀釋?zhuān)珻D44v6抗體1∶500稀釋?zhuān)琈MP-7抗體1∶100稀釋)，放入濕盒4 ℃過(guò)夜，PBS清洗3遍，滴加生物素化Ⅱ抗工作液室溫孵育30 min，PBS 洗3 遍，滴加二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色液，自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水封片，以出現(xiàn)棕黃色或棕色顆粒的細(xì)胞作為陽(yáng)性細(xì)胞。結(jié)果判斷根據(jù)細(xì)胞染色程度積分與其所占百分比積分的乘積進(jìn)行評(píng)分。染色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；在100倍鏡下任意選取10個(gè)視野，400倍鏡下在每一個(gè)視野中連續(xù)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，記錄其中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，取平均數(shù)后從0到4分評(píng)分。≤10%為0分；11%～30%為1分；31%～50%為2分；51%～70%為3分；≥70%為4分，兩者得分乘積0～3分判定為低表達(dá)，≥4分判定為高表達(dá)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組間用單因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 丙泊酚對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901活力的影響

各組細(xì)胞相對(duì)活力依次為：100%(對(duì)照組)、(95±8)%(DMSO組)、(87±6)%(1 mg/L組)、(90±7)%(3 mg/L組)、(87±9)%(5 mg/L組)和(66±11)%(7 mg/L組)；與對(duì)照組相比，7 mg/L丙泊酚抑制SGC-7901細(xì)胞活力(P<0.05)，見(jiàn)圖1。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采取5 mg/L的濃度作為實(shí)驗(yàn)濃度。

Figure 1.Effect of propofol on the viability of gastric cancer cell line SGC-7901. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group.

2 丙泊酚對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901侵襲能力的影響

各組穿透小室膜底細(xì)胞數(shù)依次為：25±4(對(duì)照組)、22±3(1 mg/L組)、21±6(3 mg/L組)和15±2(5 mg/L組)；與對(duì)照組相比，5 mg/L丙泊酚組穿透膜底的細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

Figure 2.Effect of propofol on the invasion ability of gastric cancer cell line SGC-7901 (×200). Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group.

3 丙泊酚對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901遷移能力的影響

SGC-7901細(xì)胞經(jīng)不同濃度丙泊酚處理24 h后，劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示各組細(xì)劃痕愈合率分別為：(37.4±5.6)%(對(duì)照組)、(33.7±1.7)%(1 mg/L組)、(31.3±2.4)% (3 mg/L組)、(20.4 ±1.0)% (5 mg/L組)；與對(duì)照組相比，5 mg/L丙泊酚組愈合率顯著下降(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

Figure 3.Effect of propofol on the migration ability of gastric cancer cell line SGC-7901 (×100). Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group.

4 丙泊酚對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901中CYR61、CD44v6和MMP-7表達(dá)的影響

SGC-7901細(xì)胞經(jīng)5 mg/L丙泊酚處理后，CYR61主要定位于細(xì)胞膜和近膜的胞質(zhì)，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組均呈低表達(dá)，極少數(shù)細(xì)胞呈散在棕黃色染色，兩組間未見(jiàn)明顯差異(P>0.05)；CD44v6主要表達(dá)于細(xì)胞膜，呈棕黃色散在分布，胞漿少量可見(jiàn)，對(duì)照組表達(dá)強(qiáng)度和比例高于實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)；MMP-7主要表達(dá)于細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，棕色顆粒彌漫分布，對(duì)照組表達(dá)高于實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)，見(jiàn)圖4A。Western blotting結(jié)果與上述結(jié)果一致，見(jiàn)圖4B。

Figure 4.5 mg/L propofol suppressed the protein expression of CD44v6 and MMP-7 in gastric cancer cell line SGC-7901. A: detection of CYR61, CD44v6 and MMP-7 expression was performed by immunocytochemistry (×400); B: detection of CYR61, CD44v6 and MMP-7 expression was performed by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group.

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚可下調(diào)胃癌細(xì)胞SGC-7901 CD44v6和MMP-7蛋白的表達(dá)，并抑制其侵襲和遷移能力，初步證實(shí)了丙泊酚對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901的抗腫瘤特性及相關(guān)分子機(jī)制。丙泊酚的血漿靶濃度約3～8 mg/L[7]，本研究以胃癌細(xì)胞SGC-7901為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)5 mg/L丙泊酚可在不影響細(xì)胞活力的基礎(chǔ)上抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，而7 mg/L丙泊酚則呈現(xiàn)抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901活力的特性，是否會(huì)影響細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力尚待證實(shí)。

腫瘤細(xì)胞侵襲能力的改變多與介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞或細(xì)胞-間質(zhì)之間相互作用的黏附分子以及分泌降解細(xì)胞外物理屏障酶的基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員有關(guān)，尤其是黏附分子CD44v6和MMP-7，其與胃癌的組織分型及侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。CD44v6為細(xì)胞黏附分子CD44 基因v區(qū)外顯子通過(guò)剪接后形成的拼接變異體，可改變腫瘤細(xì)胞表面黏附分子的結(jié)構(gòu)和功能，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[8]。CD44v6與胃癌浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移及病理分期的密切關(guān)系，更是其判斷胃癌侵襲轉(zhuǎn)移能力的重要指標(biāo)[9]。另外，CD44v6-HA交聯(lián)反應(yīng)也可募集MMPs等特定的細(xì)胞因子，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活和轉(zhuǎn)移[10]。MMP-7作為MMPs家族中重要的亞型，可通過(guò)酶解作用克服細(xì)胞外基質(zhì)和多種細(xì)胞因子構(gòu)成的物理化學(xué)屏障，降解ECM成分導(dǎo)致腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[11]。MMP-7作為MMPs家族中唯一在胃癌中存在差異表達(dá)的基因，表達(dá)越強(qiáng)，胃癌的惡性程度越高[12]。雖然一些研究報(bào)道了丙泊酚可通過(guò)調(diào)控MMPs家族某些亞型影響腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性，但目前尚未發(fā)現(xiàn)丙泊酚是否可直接調(diào)控MMP-7或通過(guò)MMP-7間接調(diào)控MMPs家族的其它亞型進(jìn)而影響胃癌細(xì)胞的侵襲能力。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)5 mg/L丙泊酚處理胃癌細(xì)胞SGC-7901后，CD44v6和MMP-7的表達(dá)被抑制，推測(cè)丙泊酚導(dǎo)致侵襲能力下調(diào)的分子機(jī)制可能與這2個(gè)因素有關(guān)，但CD44v6是否通過(guò)與HA交聯(lián)的方式調(diào)控MMP-7的表達(dá)需要進(jìn)一步的研究。

CYR61是一個(gè)由381個(gè)氨基酸組成的分泌蛋白，屬于CCN家族成員之一，在不同類(lèi)型腫瘤中存在差異表達(dá)的現(xiàn)象，揭示其既具有癌基因的作用也能發(fā)揮抑癌基因的功能[13-14]。在胃癌研究中發(fā)現(xiàn)其表達(dá)也存在不一致性，Wei等[15]發(fā)現(xiàn)在胃癌組織及細(xì)胞中高表達(dá)CYR61，整合素αvβ3/NF-κβ信號(hào)參與了其侵襲能力的調(diào)控[16]；而Maeta等[17]的研究則發(fā)現(xiàn)CYR61蛋白在共表達(dá)5-羥色胺、高侵襲性的胃癌細(xì)胞中低表達(dá)，且與MMP-7的表達(dá)存在負(fù)相關(guān)性，其機(jī)制可能與CYR61通過(guò)調(diào)控整合素αvβ1抑制FAK或E1AF的活化相關(guān)[18]。但在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)5 mg/L 丙泊酚處理胃癌細(xì)胞SGC-7901對(duì)其CYR61的表達(dá)并無(wú)影響，也未見(jiàn)CYR61與MMP-7表達(dá)的相關(guān)性，推測(cè)其可能與該基因下游靶基因整聯(lián)蛋白以及細(xì)胞系的差異有關(guān)。

綜上所述，臨床相關(guān)濃度的丙泊酚可抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901的侵襲和遷移能力，與抑制細(xì)胞活性無(wú)關(guān)，其機(jī)制可能與CD44v6/MMP-7等參與細(xì)胞黏附和基質(zhì)降解等過(guò)程的分子有關(guān)。