劉 韜， 石少波， 黃 燕， 楊安康， 梁 颯， 王 騰， 胡 丹

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院心內(nèi)科, 武漢大學(xué)心血管病研究所, 心血管病湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖北 武漢 430060)

惡性室性心律失常(ventricular arrhythmia，VA)是心肌梗死(myocardial infarction，MI)后常見并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者預(yù)后[1-2]。既往研究表明心室肌細(xì)胞Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)異常是MI后惡性VA發(fā)生的重要機(jī)制[3]。兒茶酚抑素(catestatin，CST)是嗜鉻粒蛋白A(chromogranin A,CHGA)經(jīng)蛋白水解酶分解而產(chǎn)生的一種新型內(nèi)源性多肽，因其具有舒張血管、抗心肌細(xì)胞凋亡、抗心肌缺血再灌注損傷和降低交感神經(jīng)活性等多種心血管保護(hù)作用，而日益受到關(guān)注[4-5]。近期的研究顯示CST具有改善心肌細(xì)胞Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)的作用[6]。本研究通過外源性CST干預(yù)MI大鼠，探討CST對(duì)MI后心室肌細(xì)胞Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)及惡性VA易感性的影響。

材 料 和 方 法

1 材料

II型膠原酶購(gòu)自Worthington；鈣熒光指示劑Fura-2 AM購(gòu)自Invitrogen；戊巴比妥鈉購(gòu)自武漢眾一生物；CST由武漢明月生物公司合成；普通臺(tái)式液配方(mmol/L)：NaCl 130、KCl 5.4、CaCl21.8、MgCl21、Na2HPO40.3、HEPES 10和 glucose 10,NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4；無Ca2+臺(tái)式液配方(mmol/L)：NaCl 130、KCl 5.4、MgCl21、Na2HPO40.3、HEPES 10和 glucose 10,NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4；抗鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶II(calcium/calmodulin-dependent protein kinase II, CaMKII)抗體、抗磷酸化CaMKII(p-CaMKII)抗體、抗ryanodine 受體2(ryanodine receptor 2,RyR2)抗體及抗第2 814位絲氨酸磷酸化RyR2[p-RyR2(Ser2814)]抗體購(gòu)自Sigma。Langendorff 離體心臟灌流系統(tǒng)(AD)；電生理信號(hào)分析Chart 8.0軟件(艾德公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1動(dòng)物分組及模型制備 實(shí)驗(yàn)用雄性SD大鼠85只，體質(zhì)量 200～300 g，由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證編號(hào)為S0271803153A)。隨機(jī)分為假手術(shù)(sham)組(n=20)和手術(shù)組(n=65)。手術(shù)組動(dòng)物麻醉后開胸，剪開心包暴露心臟，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支制備大鼠MI模型。術(shù)中持續(xù)心電監(jiān)護(hù)，以II導(dǎo)聯(lián)心電圖ST段抬高及結(jié)扎區(qū)域心肌顏色改變作為評(píng)價(jià)造模成功的標(biāo)志。假手術(shù)組只剪開心包并不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈。將術(shù)后存活1周的大鼠隨機(jī)分為梗死對(duì)照組(MI組)和CST干預(yù)組(CST組)。CST組給予CST(30 mg·kg-1·d-1)腹腔注射連續(xù)4周，MI組和假手術(shù)組則給予等量生理鹽水連續(xù)腹腔注射4周。

2.2急性分離心室肌細(xì)胞 參照我們既往研究的方法[7]急性分離大鼠心室肌細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉和肝素鈉(400 U)抗凝10 min后開胸，迅速剪下心臟，行主動(dòng)脈逆行插管Langendorff灌流；給予普通臺(tái)式液灌流10 min，隨后改為無Ca2臺(tái)式液灌流10 min；給予含II型膠原酶(300 mg/L)的低Ca2+(30 μmol/L)臺(tái)式液消化10 min；心臟消化完成后，剪下左心室組織置于含1 g/L小牛血清的無Ca2+臺(tái)式液中，用眼科剪將心臟組織剪碎，吸管輕輕吹打；使用孔徑為200 mm的尼龍網(wǎng)過濾，去除消化未完全的心肌組織和脂肪組織；將分離下來的心室肌細(xì)胞逐步復(fù)鈣至終濃度(1 mmol/L Ca2+)，室溫保存用于后續(xù)鈣成像實(shí)驗(yàn)。

2.3心室肌細(xì)胞鈣成像實(shí)驗(yàn) 參照我們既往的研究方法[7]，將分離的心室細(xì)胞與鈣熒光指示劑Fura-2 AM(5 μmol/L)室溫共孵育10 min，隨后給予普通臺(tái)式液(37 ℃，1.8 mmol/L Ca2+)灌流20 min。將紫外光通過孔徑為340 nm和380 nm的濾光片進(jìn)而產(chǎn)生波長(zhǎng)為340 nm和380 nm的激發(fā)光。激發(fā)光照射心肌細(xì)胞，激活細(xì)胞內(nèi)與游離Ca2+結(jié)合的Fura-2。Fura-2激活后產(chǎn)生的熒光信號(hào)在510 nm處被光電倍增器收集，采用熒光強(qiáng)度比值(F340/F380)反映細(xì)胞內(nèi)Ca2+離子濃度。隨后進(jìn)行鈣成像實(shí)驗(yàn)，具體如下：(1)記錄心室肌細(xì)胞鈣瞬變(calcium transient，CaT)：通過灌注槽底部的一對(duì)鉑金刺激電極發(fā)放頻率為2 Hz的電場(chǎng)刺激(2倍起搏閾值，波寬2 ms)，連續(xù)記錄10個(gè)CaT。選取穩(wěn)定的5個(gè)CaT計(jì)算平均值，測(cè)量心肌細(xì)胞舒張期Ca2+濃度([Ca2+]i)及CaT幅度用以評(píng)價(jià)CaT。(2)心室肌細(xì)胞CaT交替閾值的測(cè)定：刺激電極發(fā)放增頻刺激，刺激頻率由2 Hz開始每次增加1 Hz直至出現(xiàn)CaT交替。CaT交替定義為連續(xù)4個(gè)及以上的CaT 出現(xiàn)超過5%的幅度高低變化。將誘發(fā)出CaT交替的最小頻率定義為CaT交替誘發(fā)閾值。(3)記錄心室細(xì)胞自發(fā)性Ca2+事件(spontaneous calcium event，SCaE): 刺激電極釋放Burst刺激(10 Hz，4 s)，記錄停止刺激后20 s內(nèi)的SCaE，計(jì)算每個(gè)細(xì)胞SCaE個(gè)數(shù)以及發(fā)生SCaE的細(xì)胞百分比。

2.4心臟離體電生理研究 各組動(dòng)物麻醉后開胸，剪取心臟，迅速連接于Langendorff離體心臟灌流系統(tǒng)，行主動(dòng)脈逆行灌流。灌流液為37.0±0.5 ℃的普通臺(tái)式液(配方同前，95% O2持續(xù)通氧，灌流速度8～10 mL/min)。在進(jìn)行離體電生理實(shí)驗(yàn)前，先給予20 min正常灌注讓離體心臟達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。將一對(duì)鉑金刺激電極置于右室基底部，發(fā)放電刺激(刺激強(qiáng)度為2倍舒張期起搏閾值，脈寬2 ms)，使用自制非極化Ag-AgCl記錄電極記錄左室前壁中部的單相動(dòng)作電位(monophasic action potential，MAP)。使用PowerLab系統(tǒng)和Chart 8.0軟件進(jìn)行采集和分析電生理信號(hào)，放大器信號(hào)記錄帶寬為0.3 到 1 kHz:(1)動(dòng)作電位時(shí)程(action potential duration，APD)電交替的誘發(fā)：發(fā)放S1S1增頻刺激，起始起搏周長(zhǎng)(pacing cycle length,PCL)為300 ms，隨后每次減少20 ms直至PCL減為160 ms，隨后每次減少10 ms直至誘發(fā)出APD電交替或2∶1傳導(dǎo)。每串S1S1刺激持續(xù)10 s，每2次S1S1刺激間休息20 s以消除心臟記憶效應(yīng)。APD電交替定義為連續(xù)4個(gè)以上的MAP出現(xiàn)APD的長(zhǎng)短交替，相鄰2個(gè)MAP的APD90相差5 ms以上[7]。APD電交替誘發(fā)閾值定義為誘發(fā)出APD電交替的最長(zhǎng)PCL。如果當(dāng)PCL減少至50 ms，APD電交替仍未被誘發(fā)，則將APD電交替誘發(fā)閾值定義為40 ms。(2)VA的誘發(fā)：刺激電極發(fā)放Burst刺激(50 Hz)，每次刺激持續(xù)2 s，如未誘發(fā)出VA則間隔2 s再次發(fā)放，一共發(fā)放5次，如誘發(fā)出持續(xù)時(shí)間超過2 s的不規(guī)則電活動(dòng)，則記為VA可誘發(fā)[8]，計(jì)算每組動(dòng)物VA誘發(fā)率。

2.5Western blot檢測(cè)鈣轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白的水平 大鼠麻醉后開胸迅速取下心臟，剪取梗死邊緣區(qū)心室組織放置于-80 ℃冰箱保存以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。使用RIPA裂解緩沖液提取心肌標(biāo)本總蛋白，隨后進(jìn)行蛋白濃度的測(cè)定。各樣品取50 μg蛋白上樣電泳，根據(jù)蛋白分子量配制相應(yīng)使用的PAGE膠電泳。使用Western blot檢測(cè)各組動(dòng)物心肌組織CaMKII、p-CaMKII、RyR2及p-RyR2 (Ser2814)的蛋白水平。選用GAPDH作為內(nèi)參照蛋白。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及作圖。連續(xù)變量采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey’s post hoc檢驗(yàn)；心肌細(xì)胞CaT交替及離體心室APD電交替誘發(fā)閾值采用中位數(shù)(median)表示，多組間比較采用非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用Dunn′s post hoc檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組動(dòng)物的存活情況

Sham組20只大鼠，其中1只在飼養(yǎng)過程中死亡，存活率95%(19/20)。65只手術(shù)大鼠中有13只在手術(shù)后7天內(nèi)死亡，剩下的52只隨機(jī)給予CST(CST組)或生理鹽水(MI組)腹腔注射，每組26只。到藥物干預(yù)結(jié)束時(shí)，CST組有2只大鼠死亡，存活率91.67%(24/26)，MI組有8只死亡，存活率69.23%(18/26)。CST組大鼠存活率高于MI組(P<0.05)。

2 心室細(xì)胞鈣成像的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

MI導(dǎo)致大鼠心室細(xì)胞發(fā)生鈣重構(gòu)，具體表現(xiàn)為與sham組相比，MI組大鼠心室細(xì)胞舒張期的[Ca2+]i顯著增加，而收縮期CaT幅度卻顯著降低(P<0.01)。然而，給予CST干預(yù)后，CST組的心室細(xì)胞舒張期[Ca2+]i較MI組顯著降低，而收縮期CaT幅度卻較MI組顯著升高(P<0.05)，見圖1。這些結(jié)果提示CST干預(yù)修復(fù)了MI大鼠心室細(xì)胞CaT特性。

Figure 1.The diastolic calcium level and calcium transient (CaT) amplitude of the cardiomyocytes isolated from the rats with different treatments. Mean±SD. n=18. **P<0.01 vs sham group; ##P<0.01 vs MI group.

與sham組相比，MI組大鼠心室細(xì)胞誘發(fā)CaT交替的刺激頻率顯著減小(P<0.01)。經(jīng)CST干預(yù)后，CST組大鼠心室細(xì)胞誘發(fā)CaT交替的刺激頻率較MI組顯著增加(P<0.01)，見圖2。這些結(jié)果提示MI導(dǎo)致大鼠心室細(xì)胞CaT交替易感性顯著增加，而CST干預(yù)則降低了MI大鼠心室細(xì)胞CaT交替易感性。

Figure 2.The threshold of CaT alternans in the cardiomyocytes isolated from the rats with different treatments.PF: pacing frequency. Horizontal lines indicate the median. n=12. **P<0.01 vs sham group; ##P<0.01 vs MI group.

Sham組只有25%(3/12)的心室細(xì)胞記錄到了SCaE，而在93.33%(11/12)的MI組心室細(xì)胞中均記錄到了SCaE，較sham組顯著升高(P<0.01)。此外，在20 s的記錄時(shí)間內(nèi)，MI組心室細(xì)胞平均發(fā)生了(9.7±3.3)個(gè)SCaE，而sham組只發(fā)生了(0.5±0.9)個(gè)SCaE，MI組的SCaE數(shù)量顯著高于sham組(P<0.01)；經(jīng)CST干預(yù)后，CST組心室細(xì)胞的SCaE發(fā)生率與MI組比較雖然改變不明顯(P>0.05)，但SCaE數(shù)量卻較MI組顯著減少(P<0.01)，見圖3。

3 離體心室APD電交替及VA誘發(fā)結(jié)果

在離體電生理研究中我們觀察到，MI組心室誘發(fā)APD電交替的PCL較sham組明顯延長(zhǎng)，而CST組心室誘發(fā)APD電交替的PCL卻較MI顯著縮短(P<0.01)，即MI組心室APD電交替誘發(fā)閾值較sham組顯著減小，而CST組心室APD電交替誘發(fā)閾值卻較MI組顯著增加，見圖4。此外，sham組只有1個(gè)離體心臟誘發(fā)出了VA，誘發(fā)率為11.11%(1/9);MI組VA誘發(fā)率為87.50%(7/8),與sham組相比差異顯著(P<0.01);經(jīng)CST治療后，CST組大鼠離體心室VA誘發(fā)率為42.86%(6/14)，較MI組顯著降低(P<0.05)，見圖5。

4 CaMKII及RyR2蛋白水平的變化

Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了CaMKII、p-CaMKII、RyR2及p-RyR2蛋白在3組動(dòng)物間的水平，結(jié)果顯示與sham組相比，MI組梗死周邊區(qū)心肌p-CaMKII及p-RyR2 (Ser2814)的水平顯著上調(diào)(P<0.01)；給予CST治療后，梗死周邊區(qū)心肌p-CaMKII及p-RyR2 (Ser2814)的蛋白水平均較MI組明顯降低(P<0.01)。此外，心室RyR2及CaMKII的蛋白水平在在3組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)，見圖6。

討 論

本研究結(jié)果顯示,心肌梗死后5周大鼠心室細(xì)胞即出現(xiàn)了鈣運(yùn)轉(zhuǎn)異常，具體表現(xiàn)為收縮期CaT幅度顯著減少，而舒張期細(xì)胞內(nèi)鈣水平顯著增高(即細(xì)胞內(nèi)鈣超載)，上述改變與既往他人報(bào)道相一致[9-10]。RyR2是心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面調(diào)控收縮期Ca2+釋放的關(guān)鍵通道，其功能的完整性對(duì)維持心肌細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。在本研究中，我們觀察到MI大鼠心室肌p2814-RyR2的蛋白水平較sham組顯著增加。RyR2磷酸化水平上調(diào)可導(dǎo)致RyR2活性增強(qiáng)，既往大量研究顯示RyR2活性持續(xù)增強(qiáng)可顯著增加心肌細(xì)胞舒張期Ca2+泄漏[11-12]。大量的舒張期Ca2+泄漏一方面導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載[13]，另一方面還可降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣容量從而引起收縮期Ca2+釋放減少[14]。因此，我們認(rèn)為心肌梗死導(dǎo)致的p2814-RyR2表達(dá)上調(diào)與心肌梗死大鼠心室細(xì)胞鈣重構(gòu)有關(guān)。

Figure 3.The incidence of spontaneous calcium events (SCaE) and the number of SCaE in the cardiomyocytes isolated from the rats with different treatments. Mean±SD. n=12. **P<0.01 vs sham group; ##P<0.01 vs MI group.

Figure 4.The threshold of APD alternans in the rats with different treatments. PCL: pacing cycle length. Horizontal lines indicate the median. *P<0.05 vs sham group; #P<0.05 vs MI group.

CaMKII是一種在心臟組織廣泛分布的多功能蛋白激酶，其活性受細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的調(diào)控。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鈣超載時(shí)，CaMKII 可通過自動(dòng)磷酸化而激活。激活后的CaMKII可對(duì)RyR2進(jìn)行磷酸化修飾，從而調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞Ca2+運(yùn)轉(zhuǎn)[15]。RyR2的第2 814位絲氨酸是CaMKII磷酸化修飾的作用部位。在本研究中，MI組大鼠心室肌p-CaMKII及p-RyR2 (Ser 2814)的蛋白水平均顯著增加。由此我們認(rèn)為CaMKII相關(guān)信號(hào)通路參與了心肌梗死大鼠RyR2磷酸化修飾，進(jìn)而促進(jìn)心肌梗死后心室鈣重構(gòu)的形成。

Figure 5.The incidence of ventricular arrhythmia (VA) in the rats with different treatments. Mean±SD. *P<0.05 vs sham group; #P<0.05 vs MI group.

Figure 6.The protein levels of p-RyR2, RyR2, p-CaMKII and CaMKII in the cardiac tissues of the rats with different treatments. Mean±SD. n=5. *P<0.05 vs sham group; #P<0.05 vs MI group.

CST是一種內(nèi)源性多肽，其前體為CHGA。CHGA首先在腎上腺嗜鉻細(xì)胞及交感神經(jīng)元中被發(fā)現(xiàn)與兒茶酚胺共同儲(chǔ)存與釋放，被釋放到胞外CHGA經(jīng)蛋白水解酶作用產(chǎn)生CST。有研究顯示心肌細(xì)胞也能合成和分泌CST[16]。在本研究中，我們觀察到外源性CST干預(yù)一方面抑制了心肌梗死引起的大鼠心室肌p-CaMKII及p-RyR2 (Ser2814)的蛋白水平上調(diào)，另一方面還修復(fù)了心肌梗死大鼠心室細(xì)胞鈣轉(zhuǎn)運(yùn)。Ottesen等[6]發(fā)現(xiàn)外源性CST可通過與CaMKII活性調(diào)節(jié)區(qū)域相結(jié)合直接抑制CaMKII自動(dòng)磷酸化激活，減少CaMKII相關(guān)的RyR2磷酸化修飾，減少心肌細(xì)胞舒張期Ca2+泄露及增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣容量，從而有利于心肌細(xì)胞鈣轉(zhuǎn)運(yùn)。因此，我們認(rèn)為CST抑制CaMKII-RyR2相關(guān)信號(hào)通路是其修復(fù)心肌梗死大鼠心室細(xì)胞鈣運(yùn)作的重要機(jī)制。

此外，本研究結(jié)果還顯示外源性CST干預(yù)不僅抑制心肌梗死大鼠心室細(xì)胞自發(fā)性鈣活動(dòng)及Ca2+交替的發(fā)生，還降低了心肌梗死大鼠離體心臟APD電交替及VA易感性。大量研究顯示心肌細(xì)胞Ca2+穩(wěn)態(tài)異常不僅可引起自發(fā)性Ca2+活動(dòng)[17]，還與心肌細(xì)胞CaT交替的發(fā)生有關(guān)[18]。自發(fā)性Ca2+活動(dòng)是心肌細(xì)胞觸發(fā)活動(dòng)發(fā)生的重要機(jī)制，而CaT交替又與折返相關(guān)復(fù)極電交替的產(chǎn)生有關(guān)，兩者共同作用最終可增加惡性VA易感性。因此，CST降低MI大鼠VA易感性，其機(jī)制至少與CST干預(yù)修復(fù)心室細(xì)胞Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。