吳曉龍，謝艷，劉曉紅，寧桃麗，殷娜

河南省洛陽(yáng)正骨醫(yī)院(河南省骨科醫(yī)院)，河南 洛陽(yáng) 471002

當(dāng)今社會(huì)，兒童青少年生長(zhǎng)發(fā)育的一般規(guī)律及其影響因素已是生命科學(xué)領(lǐng)域不斷深化的傳統(tǒng)研究課題。在關(guān)于生長(zhǎng)發(fā)育的研究中，身高是重要的形態(tài)指標(biāo)之一。心理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)[1]，身高能夠影響個(gè)體自身的人格、行為以及心理健康等。生長(zhǎng)激素是促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)的決定性因素，而生長(zhǎng)激素的分泌主要在慢波睡眠期間[2]，有報(bào)道慢波睡眠的啟動(dòng)和延長(zhǎng)與5-HT有關(guān)[3]。筆者的前期實(shí)驗(yàn)顯示酸棗仁提取物可以促進(jìn)5-HT1AR的高表達(dá)，而柴胡提取物導(dǎo)致了5-HT分泌增多，兩種藥物均導(dǎo)致生長(zhǎng)激素分泌增多并最終導(dǎo)致小鼠身長(zhǎng)的增長(zhǎng)[4,5]。本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步對(duì)酸棗仁提取物配柴胡提取物組方促身體增長(zhǎng)的作用及機(jī)制進(jìn)行研究。

1 動(dòng)物、材料及儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠30只，SPF級(jí)，雌性，體重15～17g，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(豫)2015-0001 。SD大鼠30只，SPF級(jí)，雌性，體重120～150g，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(豫)2015-0001，來(lái)自同一時(shí)期每胎6只10胎的小鼠60只，體重26～28g，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(豫)2015-0001，均由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境溫度(20～24)℃，濕度50%～70%，12h明暗交替，光照7:00～19:00，噪音＜50dB。

1.2 藥物與試劑酸棗仁提取物，由陜西斯諾特生物技術(shù)有限公司提供(含皂甙3%～5%，市場(chǎng)名稱(chēng)為酸棗仁皂甙，實(shí)為提取物，天然酸棗仁中含皂甙0.1%～0.14%)，使用時(shí)小鼠按照0.32mg/g體重灌胃，大鼠按照0.22mg/g體重灌胃。柴胡提取物，由西安四季生物技術(shù)有限公司提供，其中柴胡皂甙含量為5%(市場(chǎng)稱(chēng)為柴胡皂甙，天然柴胡中柴胡皂甙含量為0.006‰～0.007‰)，使用時(shí)小鼠按照0.94mg/g體重灌胃，大鼠按照0.66 mg/g體重灌胃。酸棗仁皂甙A，(純度＞98%，購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)A0274)，小鼠按照0.013mg/g體重灌胃，大鼠按照0.009mg/g體重灌胃。5-H T1A受體選擇性抑制劑P-MPPF，購(gòu)于北京盛科博源生物科技有限公司；5-H T合成抑制劑LX1606，購(gòu)自Selleck(批號(hào)：s2173)。小鼠5-HT1AR ELISA試劑盒(上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)201510)；Tris Base(Amresco Lot:D0194)；TritonX-100(北京化學(xué)試劑公司，批號(hào)：050205)；3H-8-OH-DPAT0.25mci(放射性比活度135ci.mmol-1)(New England Nuclear公司)；2,5二苯基噁唑(PPO)(sigma公司，Lot:D4630)，1,4-雙(5-苯基-2-噁唑基)苯(POPOP)(sigma公司，Lot:P3754)；考馬斯亮藍(lán)G-250(Solarbio公司，Lot:0120310)。

1.3 儀器酶標(biāo)儀(Labsystems Multiskan MS，芬蘭，352型)；離心機(jī)(北京雷博爾離心機(jī)有限公司，LDZ5-2型)；RM-6000八導(dǎo)生理記錄儀(日本光電)；AB-621G生物電放大器(日本光電)；FZG-81直流前置放大器(上海嘉龍儀器廠)；腦立體定位儀(西北光學(xué)儀器廠)；FJ2107-P液體閃爍計(jì)數(shù)儀(西安262廠)。

2 方法

2.1 藥物對(duì)小鼠發(fā)育期體長(zhǎng)的影響來(lái)自于同一時(shí)期10胎的小鼠，每胎3只，隨機(jī)分在3組，分別為空白組、酸柴提取物及陽(yáng)性對(duì)照組，每組10只，3組小鼠原始體長(zhǎng)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差。酸柴提取物組灌胃酸棗仁加柴胡提取物混懸液，陽(yáng)性對(duì)照組灌胃酸棗仁皂甙A水溶液，空白對(duì)照組灌胃純凈水。各組于灌胃后第20天分別麻醉動(dòng)物，用直尺測(cè)定小鼠體長(zhǎng)，從頭部最頂端到小鼠臀尾交接處即為小鼠體長(zhǎng)，精確到1mm。

2.2 小鼠血中生長(zhǎng)激素的含量測(cè)定各組小鼠灌胃20d測(cè)定體長(zhǎng)后麻醉狀態(tài)下取血并處死，于室溫下待血液自然凝固20min，以離心半徑3000 r·min-1離心20min，收集上清液，采用ELISA試劑盒測(cè)定GH水平。

2.3 放射性配體受體結(jié)合法監(jiān)測(cè)5-HT1A受體配體的結(jié)合活性[6]同一時(shí)期出生的來(lái)自10胎的每胎6只小鼠，隨機(jī)分為6組，分別為空白對(duì)照組，藍(lán)墨水組，酸柴提取物組，陽(yáng)性對(duì)照組，5-HT抑制劑LX1606組和5-HT1AR抑制劑P-MPPF組，每組10只。酸柴提取物組灌胃酸柴提取物混懸液，陽(yáng)性對(duì)照組灌胃酸棗仁皂甙A水溶液，空白對(duì)照組和藍(lán)墨水組灌胃純凈水，5-HT抑制劑組除了灌胃酸柴提取物外，最后一次灌胃后，側(cè)腦室注射加了藍(lán)墨水的LX16063mg/kg體重，5-HT1AR抑制劑組除了灌胃酸柴提取物外，最后一次灌胃后側(cè)腦室注射加了藍(lán)墨水的P-MPPF8μg/只。除了空白組最后一次灌胃后側(cè)腦室注射生理鹽水，其余各組側(cè)腦室注射等量藍(lán)墨水。30分鐘后斷頭處死小鼠，迅速剝離腦組織，取藍(lán)墨水一側(cè)(各組藍(lán)墨水的加入是為了解剖后確定藥物是否注入腦室)，加入PBS緩沖液，在冰上勻漿。低溫12000r·min-1離心30min，棄上清，離心3次，沉淀加入3mL Tris-HCL緩沖液，混合后放于37℃水浴鍋中孵育10min后，4℃12000r·min-1離心30min，棄上清，將沉淀用1.8mL的Tris-HCL反應(yīng)液勻漿混勻后加樣。孵育30min，0℃冰冷的Tris檸檬酸緩沖液負(fù)壓抽濾，將濾膜置于閃爍杯中，加入甲苯-TritonX-100閃爍液5m L，放置過(guò)夜，于閃爍計(jì)數(shù)儀上測(cè)定發(fā)生性(cpm值)。采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定突觸膜中的蛋白的濃度，計(jì)算3H-Muscimol的結(jié)合量(以每毫克蛋白質(zhì)結(jié)合的3H-Muscimol的克分子數(shù)表示)。特異性結(jié)合量=[(樣品總結(jié)和-非特異性結(jié)合)。

2.4 藥物對(duì)大鼠慢波睡眠的影響由于小鼠體積太小，不方便在腦部安裝電極，所以用大鼠做此實(shí)驗(yàn)。30只大鼠隨機(jī)分為5組(空白對(duì)照組、酸柴提取物組、陽(yáng)性對(duì)照組、5-HT抑制劑組合、5-HT1AR抑制劑組)，每組6只，以3%戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔麻醉，剪去顱頂?shù)拿?，沿顱頂矢狀線切開(kāi)皮膚，分離皮下組織，暴露顱骨并打孔，分別在枕葉和顳葉放置電極記錄腦電圖(electroencephalogram,EEG)；分離頸部肌肉放置電極記錄肌電圖(electromyography,EMG)；打開(kāi)額竇，放置電極記錄眼電圖(electrooculogram,EOG)。將各電極導(dǎo)線和微型插座相連接，用自凝牙托水拌牙托粉固定在顱骨上。術(shù)后給青霉素肌注抗感染?；謴?fù)一周后，記錄大鼠的EEG、EMG和EOG，連續(xù)記錄6h(10:00—16:00)。分析時(shí)，以每15秒為一段，采用WXL睡眠自動(dòng)分析系統(tǒng)，根據(jù)它們的變化綜合判斷慢波睡眠時(shí)長(zhǎng)，慢波睡眠時(shí)期的特征為：腦電波頻率變慢，α波減少，“梭形”波消失，出現(xiàn)θ波，最后出現(xiàn)高振幅的δ波；肌張力降低，四肢無(wú)明顯運(yùn)動(dòng)或抽動(dòng)；呼吸循環(huán)和交感神經(jīng)的活動(dòng)水平降低，但仍穩(wěn)定，表現(xiàn)為瞳孔縮小、心率與呼吸頻率減慢、血壓降低、體溫下降等。計(jì)算6h內(nèi)覺(jué)醒期(W期)、慢波睡眠期(SWS期)和異相睡眠期(PS期)及總睡眠期(TS期)的時(shí)長(zhǎng)，連續(xù)記錄3d。每一動(dòng)物取均值。統(tǒng)計(jì)5組動(dòng)物慢波睡眠時(shí)長(zhǎng)無(wú)差異。然后開(kāi)始灌胃藥物，每日1次，于第3天最后一次灌胃后，5-HT抑制劑組側(cè)腦室注射LX1606，5-HT1AR抑制劑組側(cè)腦室注射P-MPPF。末次灌胃30min后，同樣記錄EEG、EMG和EOG，分析用藥后5組大鼠睡眠情況。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料以()表示，數(shù)據(jù)采取完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的方差分析，P＜0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 藥物對(duì)小鼠發(fā)育期體長(zhǎng)的影響統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，灌胃20d后酸柴提取物組動(dòng)物體長(zhǎng)均較空白組長(zhǎng)，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)結(jié)果見(jiàn)表1。

3.2 藥物對(duì)小鼠血清生長(zhǎng)激素含量的影響酸柴提取物可以促進(jìn)大鼠體內(nèi)GH的分泌，與空白組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，而與陽(yáng)性組作用相當(dāng)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見(jiàn)表2。

3.3 小鼠腦組織5-HT1A受體配體結(jié)合活性的影響酸柴提取物對(duì)小鼠腦組織5-HT1A受體配體結(jié)合活性與空白對(duì)照組比有顯著性差異(P＜0.01)，而與陽(yáng)性對(duì)照組作用相當(dāng)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，藍(lán)墨水組與空白組結(jié)果相當(dāng)，證明藍(lán)墨水對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)影響，結(jié)果見(jiàn)圖1，表3。

3.4 藥物對(duì)大鼠慢波睡眠的影響酸柴提取物可以促進(jìn)大鼠慢波睡眠延長(zhǎng)，與空白對(duì)照組比較P＜0.01，但并不引起異相睡眠的改變，藥物組與酸棗仁皂甙A作用相當(dāng)?？偹邥r(shí)長(zhǎng)方面酸柴提取物組和陽(yáng)性對(duì)照組均較空白組延長(zhǎng)，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見(jiàn)表4。

表1 酸柴提取物對(duì)小鼠體長(zhǎng)的影響(±s)

表1 酸柴提取物對(duì)小鼠體長(zhǎng)的影響(±s)

注：與空白對(duì)照組比較,1)P＜0.05；2)P＜0.01

表2 酸柴提取物對(duì)小鼠血清生長(zhǎng)激素含量的影響(±s)

表2 酸柴提取物對(duì)小鼠血清生長(zhǎng)激素含量的影響(±s)

注：與空白對(duì)照組比較,1) P＜0.05；2)P＜0.01

圖1 加有藍(lán)墨水的藥物側(cè)腦室注射效果對(duì)比

表3 酸柴提取物對(duì)小鼠腦組織5-HT1A受體配體結(jié)合活性的影響(±s)

表3 酸柴提取物對(duì)小鼠腦組織5-HT1A受體配體結(jié)合活性的影響(±s)

注：3)與酸柴組比較P＜0.01

表4 酸柴提取物對(duì)大鼠慢波睡眠的影響(±s)

表4 酸柴提取物對(duì)大鼠慢波睡眠的影響(±s)

注：3)與酸柴組比較P＜0.01

4 討論

目前批準(zhǔn)上市的藥物中沒(méi)有適應(yīng)證是具有促進(jìn)慢波睡眠的藥物，筆者前期實(shí)驗(yàn)與報(bào)道都提示酸棗仁皂甙A促進(jìn)慢波睡眠作用較好，所以本實(shí)驗(yàn)選用酸棗仁皂甙A為陽(yáng)性對(duì)照。

兒童生長(zhǎng)發(fā)育所必需的的生長(zhǎng)激素主要在睡眠狀態(tài)下才能高水平的分泌。尤其是慢波睡眠階段生長(zhǎng)激素的分泌量占每日生長(zhǎng)激素的大部分[7]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予動(dòng)物促進(jìn)慢波睡眠的藥物確實(shí)可以引起動(dòng)物體長(zhǎng)的增長(zhǎng)，且血中生長(zhǎng)激素的含量均有所提高。

5-HT是作用于睡眠-覺(jué)醒周期的重要單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)。Hoeller AA等[8]報(bào)導(dǎo)慢波睡眠的啟動(dòng)和5-羥色胺有關(guān)。姜巖巖等[9]發(fā)現(xiàn)，孤束核注射5-HT的大鼠覺(jué)醒期縮短，異相睡眠及慢波睡眠延長(zhǎng)，而且5-HT1A受體激動(dòng)劑可以增加SWS，所以提高腦內(nèi)5-HT或5-HT1A受體都可以促進(jìn)慢波睡眠的增多。我們前期的研究顯示，可以增加大鼠腦內(nèi)5-HT1A受體的表達(dá)，同時(shí)對(duì)慢波睡眠時(shí)長(zhǎng)有顯著延長(zhǎng)，柴胡提取物可以增加腦內(nèi)5-HT的含量，也可以增加小鼠慢波睡眠時(shí)長(zhǎng)和生長(zhǎng)激素的分泌，最終也導(dǎo)致小鼠身高的增高。本實(shí)驗(yàn)中我們?cè)趧?dòng)物最后一次灌胃后側(cè)腦室注射特異性5-HT抑制劑和5-HT1A受體抑制劑，發(fā)現(xiàn)給予抑制劑組的動(dòng)物5-HT1A結(jié)合活性降低且慢波睡眠時(shí)間縮短，因此推測(cè)酸棗仁柴胡提取物是通過(guò)調(diào)節(jié)動(dòng)物體內(nèi)5-HT1A受體與5-HT增多，從而使5-HT受體配體結(jié)合活性增強(qiáng)發(fā)揮作用，這可能也是兩種藥物配伍促進(jìn)生長(zhǎng)激素分泌增多及最終體長(zhǎng)增長(zhǎng)的原因所在。

目前，關(guān)于中藥促進(jìn)睡眠的作用及相關(guān)機(jī)制研究的文獻(xiàn)不少，而將藥物促進(jìn)睡眠與身高增高相結(jié)合的實(shí)驗(yàn)研究不多，我們的研究將會(huì)對(duì)人體增高的研究提供新的思路。酸棗仁為衛(wèi)生部首批公布的藥食同源類(lèi)品種，具有安全、有效，并有著悠久的應(yīng)用基礎(chǔ)經(jīng)驗(yàn)，其開(kāi)發(fā)利用價(jià)值前景極為廣闊。通過(guò)我們的研究將會(huì)為今后發(fā)現(xiàn)一些基本無(wú)毒副作用、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的促進(jìn)發(fā)育期青少年身高增高的新方法提供前期理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。