劉渝嬌，李耀輝，張冠英，范鵬飛，遲象陽，房婷，劉樹玲，陳旖，宋小紅，于長明

軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院生物工程研究所，北京100071

尼帕病毒（Nipah virus，NiV）屬于副黏病毒科 （Paramyxoviridae）亨尼帕病毒屬（Henipavirus），為單股負(fù)鏈RNA病毒，其自然宿主為果蝠，可感染豬、馬等哺乳動(dòng)物以及人類，能夠引起嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)性疾病和呼吸系統(tǒng)性疾病等[1]。尼帕病毒最早出現(xiàn)于1998 年9 月，該次疫情持續(xù)至1999 年4 月，最終造成馬來西亞霹靂州256 人感染，105人死亡，另有116 萬頭豬死亡，并蔓延至新加坡一屠宰場，造成11 名工人感染、1 人死亡[2-3]。1999年10 月，研究人員從一名患者腦脊髓液中分離出病毒[2]。不久之后，又從馬來西亞果蝠尿液中分離出尼帕病毒，確定了尼帕病毒的自然宿主[3]。隨后，在印度、柬埔寨、泰國等國家都曾報(bào)道過尼帕疫情，近年來，尼帕病毒感染疫情多次在孟加拉國和印度發(fā)生，已造成數(shù)百人死亡，死亡率為50%～100%[4]。

NiV 基因組共編碼6 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（N，P，M，F(xiàn)，G，L），有黏附蛋白（G）和融合蛋白（F）2 個(gè)包膜糖蛋白。其中G 蛋白是以四聚體形式存在的Ⅱ型跨膜蛋白，胞外域包括一個(gè)莖狀區(qū)以及含受體結(jié)合區(qū)域的頭部區(qū)；而F 蛋白為Ⅰ型跨膜蛋白，包含546 個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子質(zhì)量約67×103，包括2 段七肽重復(fù)序列（heptad repeat，HR）和疏水性融合多肽（fusion peptide，F(xiàn)p）[5]，其基因位于病毒基因組6370～8706 nt[6]。在F 蛋白合成過程中，首先合成為不具備活性的前體蛋白F0，F(xiàn)0運(yùn)輸至細(xì)胞膜表面后，通過內(nèi)吞作用回到細(xì)胞內(nèi)部[7-8]，然后在酸性核內(nèi)體中被組織蛋白酶L 或B 分解[9-10]，形成F1（C 端）和F2（N 端）2 個(gè)有活性的蛋白，F(xiàn)1和F2通過二硫鍵連接形成有融合功能的融合蛋白，最終在膜表面以三聚體形式存在[11]。尼帕病毒入侵宿主細(xì)胞時(shí)，通過G 蛋白識(shí)別并結(jié)合宿主細(xì)胞膜表面受體Ephrin B2 和Ephrin B3[12-13]，這一過程會(huì)激發(fā)F 蛋白發(fā)生顯著的構(gòu)象重排[14]，從一個(gè)亞穩(wěn)定狀態(tài)重新折疊成為較低的能量狀態(tài)，從而促進(jìn)Fp 暴露并插入宿主細(xì)胞膜[15]。因此，含有受體結(jié)合區(qū)的G 蛋白與含有融合肽的F 蛋白經(jīng)常被作為尼帕病毒結(jié)構(gòu)、入侵機(jī)制等研究的主要對(duì)象，以及疫苗研制和抗體篩選的重要靶標(biāo)。

鑒于F 蛋白在病毒入侵過程中扮演著極為重要的角色，表達(dá)純化獲得接近天然構(gòu)象及生物化學(xué)性質(zhì)的F 蛋白以及制備其特異性血清，對(duì)于尼帕病毒的疫苗研究、中和抗體的篩選及相關(guān)機(jī)制探討至關(guān)重要。因此，我們構(gòu)建了F 蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)獲得了可溶性F 蛋白（sF），并且驗(yàn)證了純化得到的蛋白以三聚體的形式存在，且能在體外被胰蛋白酶消化分解為F1和F2蛋白。以該蛋白免疫小鼠，獲得了針對(duì)尼帕病毒F 蛋白的特異性血清。本研究為后續(xù)開展尼帕病毒的蛋白結(jié)構(gòu)、入侵機(jī)制、疫苗及中和抗體等相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

4～6 周雌性BALB/c 小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；Expi293F 細(xì)胞、尼帕病毒G蛋白、抗埃博拉病毒GP 蛋白單克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室保存；限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、AgeⅠ，胰蛋白酶購自NEB 公司；去內(nèi)毒素大提試劑盒購自天根生化有限公司；Expi293 細(xì)胞培養(yǎng)基及轉(zhuǎn)染試劑購自ThermoFisher 公司；Strep Trap HP 預(yù)裝柱購自GE Healthcare 公司；Western 化學(xué)發(fā)光顯色液、30k 15 mL 超濾管購自Millipore 公司；蛋白酶抑制劑購自Promega 公司；山羊抗鼠IgG 二抗（HRP）購自Abcam 公司；抗Strep（HRP）抗體購自Merck Millipore 公司；TMB 單組分顯色液、ELISA 終止液購自索萊寶有限公司。

1.2 表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

尼帕病毒融合蛋白F 基因（GenBank：NC_002728.1）刪除跨膜區(qū)和細(xì)胞質(zhì)尾區(qū)，僅保留胞外域基因，C 端加上Strep 標(biāo)簽，序列設(shè)計(jì)完成后由金斯瑞有限公司進(jìn)行密碼子優(yōu)化并合成，酶切位點(diǎn)為XbaⅠ和AgeⅠ，連接至表達(dá)載體pcDNA3.4，得到表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-sF。將菌液送至生工生物工程有限公司測序，序列比對(duì)確認(rèn)無誤后，振蕩培養(yǎng)提質(zhì)粒pcDNA-sF，在37℃經(jīng)XbaⅠ/AgeⅠ雙酶切1 h 后核酸電泳鑒定。

1.3 融合蛋白F 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)

轉(zhuǎn)染前1 d，接種2×106細(xì)胞到30 mL Expi293 表達(dá)培養(yǎng)基中，在5% CO2、37℃、120 r/min條件下懸浮培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染當(dāng)天，檢測細(xì)胞密度達(dá)3×106/mL 時(shí)，取 80 μL ExpiFectamine293 轉(zhuǎn)染試劑加入1.5 mL MEM 培養(yǎng)基中，取30 μg 表達(dá)載體pcDNA-sF 加入1.5 mL MEM 培養(yǎng)基中，分別混勻，室溫孵育5 min 后將二者混合，室溫孵育25 min 后加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。轉(zhuǎn)染12 h 后，加入150 μL 轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑1 和1.5 mL 轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑2；繼續(xù)培養(yǎng)84 h，將細(xì)胞培養(yǎng)物800 r/min 離心15 min 后再以3000 r/min 離心15 min，收集上清。

1.4 Strep Trap 柱親和層析純化蛋白

用0.45 μm 濾膜過濾收集的細(xì)胞表達(dá)上清，Strep Trap 親和柱用0.5 mol/L NaOH 再生后，用平衡緩沖液（100 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA·2Na）平衡后上樣，上樣結(jié)束后再平衡，然后用洗脫液（1 L 平衡液，2.5 mmol/L 脫硫生物素）洗脫，收集洗脫峰。用30k 超濾管對(duì)洗脫峰進(jìn)行超濾濃縮，同時(shí)用PBS 溶液進(jìn)行換液。

1.5 Western 印跡檢測蛋白表達(dá)及血清特異性

取純化后的樣品，加入含DTT 的4×SDS 上樣緩沖液，煮沸10 min，電泳結(jié)束后用金斯瑞轉(zhuǎn)膜儀電轉(zhuǎn)移蛋白到PVDF 膜上；轉(zhuǎn)膜后用5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入抗Strep（HRP）抗體（1∶5000）或免疫小鼠血清（1∶2500）室溫孵育1 h；用TBST 洗膜后加入羊抗鼠IgG 二抗（HRP）室溫孵育1 h；洗膜后滴加化學(xué)發(fā)光試劑，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光。

1.6 F 蛋白的體外酶解實(shí)驗(yàn)

在反應(yīng)體系中加入1 μg 純化的sF 蛋白、100 ng 胰蛋白酶，用1×緩沖液補(bǔ)至總體積為10 μL，4℃孵育過夜；次日加入1 μL 10×蛋白酶抑制劑終止反應(yīng)，取10 μL 消化產(chǎn)物加入4×SDS 上樣緩沖液，煮沸10 min，通過Western 印跡分析消化產(chǎn)物成分，一抗為抗Strep（HRP）抗體（1∶5000稀釋）。

1.7 HPLC 分析條件

HPLC 分析儀為Waters 2695-2487，凝膠色譜柱為TSKgel G3000SWXL；標(biāo)準(zhǔn)液、樣品液上樣量均為30 μL，流速1 μL/min，上樣時(shí)間30 min，柱溫25℃，流動(dòng)相為PBS 緩沖液。

1.8 小鼠免疫

將純化得到的F 蛋白與弗氏佐劑均勻混合，在每只小鼠腹股溝皮下多點(diǎn)注射20 μg（共6只），在第0、14 和28 d 分別免疫，共免疫3 次；第42 d 時(shí)取小鼠尾靜脈血，常溫靜置4 h 后8000 r/min 離心10 min，收集上清。

1.9 ELISA 檢測抗血清的特異性結(jié)合活性

以1 μg/mL 的濃度包被純化的sF 蛋白，4℃孵育過夜；用PBST 洗板4 次后用ELISA 封閉液于37℃封閉1 h；再次洗板后首孔加入150 μL 稀釋比為1∶100 的小鼠血清，其余孔加入100 μL 稀釋液，1∶3 稀釋，37℃孵育1 h；洗滌后加入1∶10 000的山羊抗鼠IgG 二抗（HRP），37℃孵育1 h；洗滌后每孔加入100 μL TMB 單組分顯色液顯色6 min，每孔加入50 μL 終止液終止顯色，讀取D450nm/D630nm值。

2 結(jié)果

2.1 F 蛋白表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

pcDNA-sF 質(zhì)粒設(shè)計(jì)及鑒定結(jié)果見圖1。表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-sF 經(jīng)XbaⅠ/AgeⅠ雙酶切后得到約6000 bp 的pcDNA3.4 載體條帶和約1600 bp 的目的基因條帶，說明質(zhì)粒pcDNA-sF 表達(dá)質(zhì)粒含有目的基因?；驕y序結(jié)果與原序列一致，沒有堿基缺失與突變，表明得到了序列正確并成功克隆的表達(dá)質(zhì)粒。

圖1 重組質(zhì)粒pcDNA-sF 的質(zhì)粒圖譜（A）及酶切鑒定（B）

2.2 融合蛋白F 的表達(dá)、純化及鑒定

2.2.1 純化產(chǎn)物的SDS-PAGE 鑒定 將濃縮換液后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 和Western 印跡分析（圖2）。SDS-PAGE 結(jié)果顯示所純化蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為70×103，稍大于F 蛋白胞外區(qū)相對(duì)分子質(zhì)量的理論值61×103，推測是由于F 蛋白上含有5個(gè)N 糖基化位點(diǎn)（Asn64、Asn67、Asn99、Asn414、Asn464），使得蛋白質(zhì)遷移速率減慢；并且結(jié)果顯示所純化的蛋白純度在95%以上。用抗Strep 抗體進(jìn)行Western 印跡，結(jié)果與SDS-PAGE 結(jié)果一致，表明表達(dá)蛋白含有Strep 標(biāo)簽，說明純化的蛋白為本研究所設(shè)計(jì)的蛋白。

2.2.2 胰蛋白酶切鑒定 在sF 蛋白的體外酶解實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)胰蛋白酶消化后的sF 蛋白經(jīng)SDSPAGE 分析分離出2 條大小不一的條帶（圖3A），與文獻(xiàn)報(bào)道的F0蛋白經(jīng)胰蛋白酶消化形成F1和F2蛋白的理論相對(duì)分子質(zhì)量（分別為51×103和19×103）基本一致。進(jìn)一步用抗Strep 抗體進(jìn)行Western 印跡，在70×103、51×103左右有明顯條帶，應(yīng)為含有Strep 標(biāo)簽的F 蛋白和位于F 蛋白C 端的F1（圖3B）。

圖2 純化產(chǎn)物的SDS-PAGE 分析（A）與Western 印跡鑒定（B）

圖3 sF 蛋白酶解產(chǎn)物的SDS-PAGE（A）與Western 印跡（B）

2.2.3 HPLC 分析 以已知相對(duì)分子質(zhì)量的尼帕病毒G 蛋白（四聚體，約240×103）、抗埃博拉病毒GP 蛋白單克隆抗體（150×103）為對(duì)照，HPLC 分析結(jié)果顯示本實(shí)驗(yàn)表達(dá)純化的F 蛋白保留時(shí)間（9.722 min）在G 蛋白（8.610 min）和單克隆抗體（11.094 min）之間，說明重組表達(dá)的F 蛋白相對(duì)分子質(zhì)量介于150×103和240×103之間。而單體F蛋白胞外區(qū)的理論相對(duì)分子質(zhì)量約61×103，提示本實(shí)驗(yàn)表達(dá)純化的F 蛋白以三聚體（190×103）形式存在，其結(jié)合方式有待于進(jìn)一步研究。

2.3 融合蛋白F 的特異性血清驗(yàn)證及其結(jié)合活性檢測

取小鼠血清，通過Western 印跡驗(yàn)證血清對(duì)F蛋白的特異性識(shí)別能力（圖5A），對(duì)照抗原為尼帕病毒G 蛋白。結(jié)果顯示在F 蛋白泳道上有一條相對(duì)分子質(zhì)量約70×103的條帶，而對(duì)照抗原處沒有條帶，表明所制備的鼠抗血清能特異性識(shí)別尼帕病毒sF 蛋白。通過ELISA 測定小鼠血清中抗F 蛋白的抗體滴度（圖5B），結(jié)果顯示小鼠血清中抗F抗體的滴度在104以上，表明重組表達(dá)的sF 有效地激發(fā)了小鼠體液免疫反應(yīng)，制備的血清結(jié)合活性良好，可用于后續(xù)研究。

圖4 HPLC 分析sF 蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量

圖5 鼠抗F 蛋白特異血清與F 蛋白的特異性結(jié)合（A）及其抗體滴度檢測（B）

3 討論

NiV 是一種烈性病原體，對(duì)病原的操作必須在生物安全4 級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，目前尚無獲批的疫苗或抗體治療藥物[4]。F 蛋白在病毒入侵過程中至關(guān)重要，并且通過其構(gòu)象重排促進(jìn)病毒與宿主細(xì)胞的膜融合[11]，而在免疫系統(tǒng)中體液免疫所產(chǎn)生的主要中和性抗體也依賴于F 蛋白的構(gòu)象。有研究顯示，大多數(shù)人源呼吸道合胞病毒（RSV）中和抗體都識(shí)別融合前狀態(tài)也就是未發(fā)生構(gòu)象改變的F 蛋白[16]；Stewart-Jones 等的研究證明穩(wěn)定地處于融合前狀態(tài)的F 蛋白在小鼠和恒河猴體內(nèi)能更好地激發(fā)體液免疫反應(yīng)[17]。因此在關(guān)于F 蛋白的大多數(shù)研究中，都是以前體蛋白F0為主要研究對(duì)象，例如Chan 等制備了尼帕病毒可溶性的以三聚體形式存在的F0蛋白，并鑒定了其生物化學(xué)性質(zhì)、構(gòu)象及免疫原性都接近于天然F 蛋白[18]；Dang等則以F0為免疫原免疫小鼠后篩選得到具備廣譜中和活性的抗F 蛋白的單克隆抗體，該單抗通過抑制F 蛋白的構(gòu)象改變而發(fā)揮中和作用[4]。制備以三聚體形式存在的F 蛋白用于免疫動(dòng)物篩選尼帕病毒中和性單抗也是本研究的目的之一。

在蛋白表達(dá)系統(tǒng)中，對(duì)比原核表達(dá)系統(tǒng)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞能夠準(zhǔn)確地完成糖基化、磷酸化及蛋白水解等多種翻譯后加工功能，因而表達(dá)產(chǎn)物在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能等方面更接近天然蛋白[19]。而分泌表達(dá)相較于胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，經(jīng)歷了蛋白翻譯后加工的整個(gè)過程，具有簡化蛋白產(chǎn)物的檢測與純化、降低生物處理工藝的復(fù)雜性、提高蛋白產(chǎn)物的產(chǎn)量與質(zhì)量等優(yōu)勢[20]。

本研究在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中對(duì)NiV 融合蛋白F進(jìn)行了重組表達(dá)，獲得了可溶性F 蛋白。該蛋白在自然狀態(tài)下以三聚體形式存在，與天然狀態(tài)下F 蛋白的存在方式一致，且能在體外被胰蛋白酶消化分解為F1、F2蛋白，具有與天然F 蛋白相似的生物化學(xué)性質(zhì)；將sF 蛋白免疫小鼠后獲得了高效價(jià)的特異性血清。這些結(jié)果為NiV 入侵機(jī)制、疫苗設(shè)計(jì)、中和抗體篩選及作用機(jī)制等后續(xù)研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。