孫曉宇，薄明井，楊亞欣，張惟材，葛欣，熊向華

1.河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定071000；

2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院生物工程研究所，北京100071

甲基營養(yǎng)菌（Methylotrophs）是一類能利用甲醇作為惟一碳源和能源生長的革蘭陰性細(xì)菌。本實驗室前期通過對甲基營養(yǎng)菌MP688 多輪誘變篩選獲得吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ）高產(chǎn)菌株J1-1，其甲醇代謝由周質(zhì)定位的甲醇脫氫酶（methanol dehydrogenase，MDH）負(fù)責(zé)，氧化生成的產(chǎn)物甲醛進入胞質(zhì)經(jīng)H4MPT、RuMP和FaDH-FDH 等途徑進一步代謝，為菌體生長及PQQ 的合成提供構(gòu)造元件和能量，也產(chǎn)生部分副產(chǎn)物，影響PQQ 產(chǎn)量[1]。前期研究發(fā)現(xiàn)，J1-1 的甲醇脫氫酶活性與PQQ 產(chǎn)量呈負(fù)相關(guān)，因而推測通過改造MDH 天然啟動子（P0771），下調(diào)MDH 轉(zhuǎn)錄水平從而降低MDH 活性，有望提高PQQ 產(chǎn)量[2-3]。本研究我們通過P0771定點突變獲得了7 個突變啟動子，利用lacZ作為報告基因檢測突變啟動子對其轉(zhuǎn)錄水平的影響，篩選出2 個lacZ 酶活水平較天然啟動子下降的突變啟動子P0771-1、P0771-5 并導(dǎo)入J1-1 替換天然P0771啟動子，得到的2 株突變菌株在增菌培養(yǎng)基中MDH 活性下降，PQQ 合成水平高于J1-1，且在生長穩(wěn)定期（96 h）PQQ 合成水平較起始菌株J1-1 分別提高約9.76%和11.6%。

1 材料與方法

1.1 材料

甲基營養(yǎng)菌J1-1、質(zhì)粒pCM66-lacZ、自殺質(zhì)粒pGX 由本實驗室保存；大腸桿菌DH5α、λ-pir感受態(tài)購自上海唯地生物技術(shù)有限公司；快速質(zhì)粒小提試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；限制性內(nèi)切酶、瓊脂糖凝膠DNA 回收純化試劑盒購自Thermo 公司；DNA marker、2×Basic Assemble Mix 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Mut ExpressⅡFast Mutagenesis Kit V2 試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；PCR 引物（表1）合成及DNA 測序由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成。

增菌培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 0.2 g/L，KH2PO41.4 g/L，（NH4）2SO43.0 g/L，Na2HPO43.0 g/L，CaCl230.0 mg/L，MnCl2·4H2O 5.0 mg/L，ZnSO4·7H2O 5.0 mg/L，CuSO4·5H2O 0.5 mg/L，檸檬酸鐵30.0 mg/L。115℃滅菌30 min，使用時添加甲醇至10 mL/L。

1.2 分子生物學(xué)操作

突變啟動子質(zhì)粒構(gòu)建根據(jù)Mut Express Ⅱ Fast Mutagenesis Kit V2 試劑盒說明書指導(dǎo)完成。

表1 PCR 引物及序列

1.3 檢測突變體的β半乳糖苷酶活性[4]

將突變菌株按1%的接種量接種于5 mL 增菌液體培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)2～3 d 至對數(shù)生長期（菌液D600nm為1.0），收取4 mL 菌液，12 000 r/min 離心10 min，棄上清；菌體重懸于500 μL TE 緩沖液（pH7.0），冰水浴超聲2 min（超聲3 s，間歇3 s）破碎菌體，4℃、12 000 r/min 離心10 min；取超聲上清100 μL 于EP 管中，加入0.5 mL Z 緩沖液（60 mmol/L Na2HPO4，40 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L KCl，1 mmol/L MgSO4，50 mmol/L β巰基乙醇，pH7.0），30℃溫育10 min；加入150 μL ONPG，30℃溫育25 min，加入0.5 mL 1 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)；測定反應(yīng)液D420nm和D550nm值，按下式計算D600nm值酶單位：

式中，T為反應(yīng)時間（min），V為所用細(xì)胞破碎液體積（mL）。

1.4 甲醇脫氫酶酶活測定[5]

1.4.1 粗酶液的制備 將突變菌株按1%的接種量接種至100 mL 增菌液體培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)，12 000 r/min 離心10 min 收集菌體，重懸于1 mL 100 mmol/L Tris-HCl（pH9.0）緩沖液中，冰水浴超聲2 min（超聲3 s，間歇3 s），4℃、12 000 r/min 離心10 min，上清液用于酶活性檢測。

1.4.2 DCIP 法檢測MDH 活性 1 mL 反應(yīng)液包含100 mmol/L Tris-HCl（pH9.0）、15 mmol/L NH4Cl、10 mmol/L 甲醇、50 μmol/L DCIP、100 μL 粗酶液，最后加入0.33 mmol/L PMS 啟動反應(yīng)。根據(jù)反應(yīng)液退色（綠色→黃色）時間可以快速判別樣品中酶的活性，按下式計算MDH 的活性。1 個活性單位（U）定義為每分鐘還原1 μmol DCIP 所需酶量，在D600nm處DCIP 的摩爾吸光系數(shù)ε 為1.9×104L/（mol·cm）。

式中，N為稀釋率，V總為酶活測定反應(yīng)體系的總體積（mL），ΔD600nm為T時間內(nèi)反應(yīng)液D600nm的增加值，V酶為反應(yīng)添加酶液的體積（mL），T為反應(yīng)時間（min），L為比色皿直徑（cm）。

1.5 菌株生長及PQQ 合成水平鑒定

將待測菌接種于含有100 mL 培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，30℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)，每12 h檢測一次菌密度和PQQ 產(chǎn)量[6]，每組設(shè)3 個平行。

2 結(jié)果

2.1 P0771突變啟動子構(gòu)建

MP688 全基因組（CP002258）注釋結(jié)果顯示反向mpq_0770基因（編碼TruB）和正向mpq_0771基因（編碼MDH α亞基）的編碼區(qū)間隔251 bp（圖1），這一段序列我們確定為mpq_0771基因的啟動子（P0771），用P0771-XbaⅠ-F 和P0771-BamHⅠ-R 引物對擴增P0771啟動子，構(gòu)建pCM66-P0771-lacZ質(zhì)粒。前期研究及文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)果提示啟動子5′端為其調(diào)控元件，因而選擇啟動子5′端25 bp 序列以每5個堿基為一組進行突變（A 與G 互換，T 與C 互換），依次命名為突變啟動子P0771-1 至P0771-5。另將預(yù)測的P0771啟動子-35 區(qū)第3 個堿基G 替換成A（P0771-6），第4 個堿基T 替換成A（P0771-7）[7-9]。設(shè)計P0771啟動子突變引物，利用定點突變試劑盒對pCM66-P0771-lacZ質(zhì)粒進行定點突變，經(jīng)測序驗證最終獲得7 個P0771啟動子突變質(zhì)粒（圖2）。

2.2 P0771突變啟動子轉(zhuǎn)錄水平測定

將pCM66-P0771-lacZ質(zhì)粒及7 個啟動子突變質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)至J1-1，通過β半乳糖苷酶活測定來分析突變啟動子活性。結(jié)果如圖3 所示，不同的突變位點對P0771啟動子活性均有一定的影響，其中P0771-1、P0771-5 突變啟動子的活性較天然啟動子下降，通過SPSS 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果顯示差異具有顯著性（P＜0.05，P＜0.01）。

2.3 P0771啟動子重組質(zhì)粒的構(gòu)建

構(gòu)建含慶大霉素（Gm）篩選抗性和P0771啟動子基因的自殺質(zhì)粒，利用同源重組替換染色體上的P0771啟動子，獲得重組菌株。mpq_0770基因和mpq_0771基因間隔區(qū)長251 bp，且轉(zhuǎn)錄方向相反，經(jīng)啟動子軟件（SoftBerry）分析發(fā)現(xiàn)，正向的P0771啟動子和反向的P0770啟動子相互重疊（圖4）。為防止P0771啟動子突變對mpq_0770基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生影響，設(shè)計將P0770啟動子通過Gm基因和P0771啟動子分隔，并將Gm基因作為篩選標(biāo)記，選取P0770啟動子上游1500 bp 作為Up 同源臂，P0771啟動子下游1500 bp 作為Down 同源臂，如圖5 所示。依此構(gòu)建自殺型pGX-Up-P0770-Gm-P0771-Down 重組質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)至J1-1，利用同源重組置換天然啟動子，得到重組菌株，測序證明基因已成功替換（測序結(jié)果略），考察生長及PQQ 產(chǎn)量與起始菌株J1-1 無顯著差異（圖6、7），說明P0770-Gm-P0771雙啟動子的置換對菌株生長及PQQ 合成沒有影響，為后續(xù)P0771突變啟動子的替換奠定了基礎(chǔ)。

圖1 P0771啟動子

圖2 P0771突變啟動子測序鑒定

2.4 P0771啟動子突變菌株的MDH 活性、菌體生長及PQQ 合成水平鑒定

將自殺型pGX-Up-P0770-Gm-P0771-Down 重組質(zhì)粒中的P0771啟動子與突變啟動子P0771-1 和P0771-5 替換后電轉(zhuǎn)至J1-1，利用同源重組法進行基因替換，分別獲得P0771-1/J1-1 和P0771-5/J1-1 突變菌株。在增菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)，穩(wěn)定期（96 h）2 株突變菌株的MDH 活性均明顯低于起始菌株J1-1（圖8），提示P0771突變啟動子通過下調(diào)mpq_0771基因轉(zhuǎn)錄降低了MDH 活性。如圖9 所示，24 h 時2 株突變菌株生長速率均顯著高于起始菌株J1-1，到穩(wěn)定期后三者菌密度無顯著差異。在生長過程中2 株突變菌株的PQQ 合成水平均高于起始菌株J1-1，到96 h 時突變菌株P(guān)0771-1/J1-1 和P0771-5/J1-1 的PQQ 產(chǎn)量分別為29.36、29.85 mg/mL，與起始菌株J1-1（26.75 mg/mL）相比，分別提高9.76%、11.6%（圖10）。

圖3 啟動子突變株的β半乳糖苷酶活性

圖4 P0770和P0771啟動子預(yù)測

圖6 重組菌株在增菌培養(yǎng)基中的生長曲線

圖7 重組菌株在增菌培養(yǎng)基中的PQQ 合成水平

3 討論

圖8 突變菌株的MDH 活性（增菌培養(yǎng)基，96 h）

圖9 突變菌株在增菌培養(yǎng)基中的生長曲線

圖10 突變菌株在增菌培養(yǎng)基中的PQQ 合成水平

迄今發(fā)現(xiàn)，在自然界能夠合成PQQ 的生物只有某些革蘭陰性細(xì)菌，而甲基營養(yǎng)菌是PQQ 合成水平最高的菌屬[10-13]。甲基營養(yǎng)菌J1-1 是本研究團隊從土壤中分離得到的PQQ 高產(chǎn)菌。甲醇初級氧化生成甲醛作為甲醇代謝途徑的第一步，在甲基營養(yǎng)菌J1-1 的分解代謝中至關(guān)重要，也是甲醇代謝調(diào)控的重要靶點[14-15]。本實驗室前期將J1-1 染色體上的MDH 基因mpq_0771敲除，發(fā)現(xiàn)敲除菌在甲醇為碳源的培養(yǎng)基中不能生長。前期研究同時還發(fā)現(xiàn)J1-1 中MDH 活性與PQQ 合成水平呈負(fù)相關(guān)，因而進一步推測通過降低MDH 啟動子轉(zhuǎn)錄活性，可以提高PQQ 的產(chǎn)量。本研究中我們通過對P0771啟動子的突變、篩選、鑒定，最終獲得2 株較天然啟動子轉(zhuǎn)錄水平下降的啟動子突變菌株P(guān)0771-1/J1-1 和P0771-5/J1-1；與J1-1 相比，突變菌株在增菌培養(yǎng)基中MDH 活性均顯著低于起始菌株J1-1，且在生長穩(wěn)定期（96 h）PQQ 合成水平分別提高了約9.76%、11.6%，證明通過降低MDH 基因的轉(zhuǎn)錄水平可以有效提高J1-1 的PQQ產(chǎn)量。