郝勐，張勝男，李建民，夏咸柱

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所比較醫(yī)學(xué)中心，北京100021；2.軍事醫(yī)學(xué)研究院生物工程研究所，北京100071；3.東北林業(yè)大學(xué)野生動物與自然保護地學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040；4.軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所，吉林長春130000

裂谷熱（Rift Valley fever，RVF）是由一種蚊媒病毒引起的急性人獸共患病，20 世紀(jì)初主要流行于肯尼亞境內(nèi)的東非大裂谷區(qū)域，因此該病毒得名為裂谷熱病毒（Rift Valley fever virus，RVFV）[1]。RVFV 可以導(dǎo)致牛、羊和駱駝等動物的母畜流產(chǎn)，流產(chǎn)率可高達100%，并對幼畜具有較高的致死率。同時，RVFV 可以導(dǎo)致人類發(fā)熱、肌肉疼痛，嚴(yán)重可至神經(jīng)紊亂、視力減弱、出血熱，甚至死亡[2]。裂谷熱病毒屬于布尼亞病毒科白蛉熱病毒屬，是單股負(fù)鏈分節(jié)段的RNA病毒，其基因組由L、M 和S 片段構(gòu)成，其中，L 片段編碼病毒復(fù)制所需的RNA 依賴的RNA 聚合酶（RdRp），M片段編碼病毒的糖蛋白Gn、Gc 和非結(jié)構(gòu)蛋白NSm，S 片段以雙義的形式編碼病毒的核蛋白N和非結(jié)構(gòu)蛋白NSs。Gn 和Gc 蛋白主要介導(dǎo)病毒的吸附、入侵和膜融合過程，因此，這2 個蛋白成為設(shè)計RVFV 疫苗和中和抗體的主要靶標(biāo)。

自裂谷熱病毒被分離后，裂谷熱疫情不斷發(fā)生[3]。1950～1998 年，裂谷熱疫情主要發(fā)生于非洲地區(qū)，南非、肯尼亞、埃及以及東非一些國家均暴發(fā)過多次較大規(guī)模的人感染裂谷熱病毒的疫情，并且造成了數(shù)百人的死亡[4-8]。2000 年，有研究者首次報道了發(fā)生在非洲大陸以外的裂谷熱疫情，該疫情發(fā)生于沙特阿拉伯，在6 個月的時間內(nèi)有總計880 例實驗室確診患者，其中123 名患者死亡[9]。在此期間也門也發(fā)生裂谷熱疫情，1328 名感染患者中有166 人死亡。研究表明，引起阿拉伯半島疫情的裂谷熱病毒毒株與導(dǎo)致1997～1998年東非疫情的毒株是一致的[10]。距今較近的疫情發(fā)生于2008 年的蘇丹，總計747 感染患者中有230 人死亡。2016 年，在尼日爾和東非發(fā)生了小規(guī)模疫情，導(dǎo)致數(shù)人死亡[11]。同年，我國也發(fā)現(xiàn)首例輸入性裂谷熱病例[12]。上述研究表明，裂谷熱病毒有跨區(qū)域傳播的趨勢。然而，目前暫無商品化的疫苗或抗體用于預(yù)防或治療RVFV 的感染。

在本研究中，我們利用懸浮型293 細(xì)胞表達了RVFV 截短型Gc 蛋白（691～1119 aa），并對該蛋白進行了純化及免疫反應(yīng)性鑒定，為后續(xù)RVFV亞單位疫苗的研發(fā)和中和抗體篩選提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

Expi293F 細(xì)胞、真核表達載體pCAGGs、抗Gc蛋白兔多抗、Gc 蛋白單克隆抗體B6 以及馬爾堡病毒GP 蛋白單克隆抗體1A8 均由本研究室保存；大腸桿菌Top10 感受態(tài)細(xì)胞、去內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、NotⅠ和NEBuilder 同源重組酶購自NEB 公司；膠回收試劑盒購自O(shè)mega 公司；Expi293F 細(xì)胞培養(yǎng)基及轉(zhuǎn)染試劑購自Thermo Fisher 公司；StrepTrap 預(yù)裝柱購自GE 公司；TMB單組分顯色液和終止液購自索萊寶公司；山羊抗兔二抗（HRP）、山羊抗人二抗（HRP）購自Abcam公司；Western 印跡顯色液購自Millipore 公司；RVFV M 片段的開放讀框基因（pUC57-MORF）由生工生物工程（上海）公司優(yōu)化并合成。

1.2 真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建

利用重疊延伸PCR 將有助于目的蛋白分泌表達的tPA 信號肽和純化標(biāo)簽StrepⅡ-tag 克隆至截短Gc 蛋白基因的5′端和3′端。具體流程如下：以pUC57-MORF 為模板，利用上游引物OpGc2-F和下游引物GC-C-Strep2R 進行PCR 擴增，將tPA信號肽和StrepⅡ-tag 的部分序列克隆至截短Gc基因的5′端和3′端，并進行膠回收；然后，以上述所得片段（opGc2-c）為模板，利用上游引物tPA-F和下游引物Strep1R 進行PCR 擴增，將tPA 信號肽和StrepⅡ-tag 的剩余部分序列克隆至截短Gc 基因的5′端和3′端，以獲得含有完整的tPA 信號肽序列和StrepⅡ-tag 序列的截短Gc 基因（opGcc1），進行膠回收，用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ/NotⅠ對真核表達載體pCAGGs 進行雙酶切，并進行膠回收；最后，通過同源重組酶將所得目的基因和表達載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10 感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌落送生工生物工程（上海）公司測序，將測序正確的單克隆菌落進行去內(nèi)毒素大提，獲得質(zhì)粒pCA-Gcopt-c 以備后續(xù)轉(zhuǎn)染使用。所用引物及序列見表1。

1.3 RVFV 截短型Gc 蛋白在Expi293F 懸浮型細(xì)胞中的表達

轉(zhuǎn)染前，將3×106Expi293F 細(xì)胞接種于30mL Expi293F 表達培養(yǎng)基中，于5% CO2、37℃、120 r/min 條件下持續(xù)培養(yǎng)數(shù)小時，當(dāng)細(xì)胞密度達3.5×106/mL 時，將80 μL ExpiFectamine293 轉(zhuǎn)染試劑加入1.5 mL 培養(yǎng)基中混勻，室溫孵育5 min。將30 μg pCA-opGc-c 加入1.5 mL 培養(yǎng)基中混勻，然后將孵育好的轉(zhuǎn)染試劑與培養(yǎng)基的混合物加入質(zhì)粒與培養(yǎng)基的混合物中輕輕混勻，室溫孵育25 min，最后緩慢加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)16 h 后，在上述細(xì)胞培養(yǎng)瓶中分別加入150 μL轉(zhuǎn)染增強劑1 和1.5 mL 轉(zhuǎn)染增強劑2，培養(yǎng)數(shù)小時后取細(xì)胞上清進行截短Gc 表達量的鑒定。

表1 引物及序列

1.4 RVFV 截短型Gc 蛋白表達量的鑒定

取上述添加轉(zhuǎn)染增強劑后培養(yǎng)84 h 的細(xì)胞培養(yǎng)液50 μL，4℃、12 000 r/min 離心5 min，用含有還原劑的蛋白上樣緩沖液制樣并電泳；電泳結(jié)束后，用濕轉(zhuǎn)方法將蛋白轉(zhuǎn)移到經(jīng)甲醇激活的PVDF 膜上；轉(zhuǎn)膜后，用5%脫脂乳對PVDF 膜室溫?fù)u床封閉1 h，分別用抗Gc 兔多抗（1∶5000）和StrepⅡ-tag（HRP）抗體（1∶30 000）與封閉后的PVDF 室溫孵育1.5 h；用PBST 清洗PVDF 膜3 次，每次10 min；以1∶10 000 的比例加入羊抗兔二抗（HRP）室溫孵育1 h；用PBST 清洗PVDF 膜3 次，每次10 min；利用Western 印跡顯色液進行顯色。

1.5 RVFV 截短型Gc 蛋白在Expi293F 細(xì)胞中不同時間點表達量的鑒定

在完成轉(zhuǎn)染并添加轉(zhuǎn)染增強劑后，每隔12 h收取細(xì)胞培養(yǎng)基100 μL，直至收到第96 h，每次收取培養(yǎng)基后，立即測定Expi293F 細(xì)胞的活率，然后4℃、12 000 r/min 離心5 min，取上清制備樣品進行Western 印跡，方法同1.4。

1.6 RVFV 截短型Gc 蛋白的純化

收取細(xì)胞上清，用0.22 μm 濾膜過濾。上樣前，先用平衡緩沖液（100 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，pH8）對StrepTtrap親和柱進行平衡，平衡5 個柱體積后上樣，同時收取柱后。上樣結(jié)束后繼續(xù)平衡5 個柱體積。平衡結(jié)束后，用洗脫緩沖液（100 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA, 2.5 mmol/L脫硫生物素，pH8）進行洗脫，收集洗脫峰。最后，對收集的目的蛋白進行SDS-PAGE 和Western 印跡鑒定。

1.7 BCA 法測定蛋白濃度

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量，將A 液和B 液按50∶1 的比例充分混勻配制成適量的BCA 工作液。取標(biāo)準(zhǔn)品和待測蛋白樣品，按10 μL/孔加入96 孔板中，每個樣品各做一個復(fù)孔，各孔加入200 μL BCA 工作液，避光，37℃孵育30 min。最后用酶標(biāo)儀測定D570nm值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蛋白濃度。

1.8 ELISA 檢測RVFV 截短型Gc 蛋白的免疫反應(yīng)性

取純化的截短型Gc 蛋白包被酶聯(lián)板（2 μg/mL，100 μL/孔），4℃過夜，PBST 洗滌3 次后，用2% BSA 于37℃封閉1 h；洗滌3 次后加入初始濃度為10 μg/mL 的B6 和1A8，以1∶3 的比例梯度稀釋，37℃孵育1 h；洗滌3 次后加入HRP 標(biāo)記的羊抗人二抗，37℃孵育1 h；洗滌3 次后加入100 μL TMB 單組分顯色液，室溫顯色5 min，再加入50 μL 終止液，最后用酶標(biāo)儀讀取D450nm-D630nm值。

2 結(jié)果

2.1 RVFV 截短型Gc 蛋白真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建

重疊延伸PCR 中第1 次擴增的DNA 片段Op-Gc2-c 為1323 bp，第2 次PCR 擴增所得DNA 片段OpGc1-c 為1590 bp，核酸電泳結(jié)果顯示條帶大小均與預(yù)期相符（圖1）。利用同源重組將目的片段克隆至真核表達載體pCAGGs 后，挑取單克隆菌落測序，測序結(jié)果顯示目的片段與預(yù)期完全一致，沒有任何突變和缺失，將構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pCA-Gcopt-c。

2.2 RVFV 截短型Gc 蛋白真核表達量的鑒定

將測序正確的真核表達質(zhì)粒pCA-Gcopt-c 轉(zhuǎn)染Expi293F 細(xì)胞，84 h 后收取細(xì)胞上清，利用Western 印跡鑒定截短型Gc 蛋白的表達量，結(jié)果如圖2?？笹c 蛋白的兔多抗和針對StrepⅡ-tag 的抗體都可以特異地檢測到Expi293F 細(xì)胞上清中的截短型Gc 蛋白，且蛋白大小與預(yù)期結(jié)果相符。同時，抗Gc 蛋白的兔多抗和針對StrepⅡ-tag 的抗體可以同時與一個相對分子質(zhì)量約為23×103的蛋白結(jié)合，我們推測該蛋白為Gc 蛋白斷裂所致。

2.3 RVFV 截短型Gc 蛋白在Expi293F 細(xì)胞中不同時間點表達量的鑒定

上述結(jié)果顯示，RVFV 截短型Gc 蛋白在Expi293F 細(xì)胞中有較高的表達量。但是為了能夠進一步提高截短型Gc 蛋白的表達量，我們對轉(zhuǎn)染后不同時間點的Expi293F 細(xì)胞表達截短型Gc 蛋白的量進行了Western 印跡鑒定，同時測定了不同時間點Expi293F 懸浮細(xì)胞的活率，以確定最晚收取細(xì)胞上清的時間，結(jié)果如圖3。截短型Gc 蛋白的表達量在轉(zhuǎn)染后96 h 最高，此時Expi293F 細(xì)胞的活率降到了41%（圖4），已不適于繼續(xù)培養(yǎng)。因此，我們確定轉(zhuǎn)染后96 h 為收取細(xì)胞上清的最佳時間。

圖1 重疊延伸PCR擴增RVFV截短型Gc片段

圖2 Western印跡鑒定RVFV截短型Gc蛋白

圖3 截短型Gc蛋白在Expi293F細(xì)胞中不同時間點的表達量

2.4 RVFV 截短型Gc 蛋白的純化及鑒定

在確定最佳細(xì)胞上清收獲時間后，我們利用StrepTrap 親和柱對收獲后的細(xì)胞上清進行了純化，同時在純化過程中收取了目的蛋白的洗脫峰、柱前和柱后，進行SDS-PAGE 分析，結(jié)果如圖5，在收取的洗脫峰中獲得了純度較好的截短型Gc 蛋白。用BCA 方法測定的純化后的Gc 蛋白濃度為0.7 mg/mL。最后，利用抗Gc 蛋白的兔多抗和針對Strep 標(biāo)簽的抗體對洗脫峰中的蛋白進行了Western 印跡鑒定，結(jié)果如圖6，抗Gc 蛋白的兔多抗和針對Strep 標(biāo)簽的抗體不僅可以與純化后的截短型Gc 蛋白特異性結(jié)合，還可以與一個大小約為23×103的蛋白結(jié)合，與圖2 結(jié)果一致。

2.5 ELISA 檢測RVFV 截短型Gc 蛋白的免疫反應(yīng)性

在得到比較純的截短型Gc 蛋白后，我們通過ELISA 實驗，利用Gc 蛋白的單克隆抗體B6 對截短型Gc 蛋白的免疫反應(yīng)性進行了初步檢測，結(jié)果如圖7。單克隆抗體B6 與截短型Gc 蛋白具有良好的結(jié)合活性，而馬爾堡病毒GP 蛋白的單克隆抗體1A8 對照與截短型Gc 蛋白沒有結(jié)合活性，說明我們通過真核表達并純化所得的截短型Gc 蛋白具有較好的免疫反應(yīng)性。

圖4 轉(zhuǎn)染后96 h內(nèi)Expi293F細(xì)胞活率的變化情況

圖5 純化后的截短型Gc蛋白的SDS-PAGE分析

3 討論

裂谷熱病毒是一種蚊媒且人獸共患的烈性病原，同時也是一種潛在的生物戰(zhàn)劑。目前國際上尚無獲批的疫苗或藥物來預(yù)防和治療裂谷熱病毒的感染。隨著全球化程度的日益加深，裂谷熱病毒跨區(qū)域傳播的趨勢愈發(fā)明顯，2018 年世界衛(wèi)生組織公布的當(dāng)前最需要關(guān)注的十大病原，裂谷熱病毒仍位列其中[13]。裂谷熱病毒的預(yù)防和治療引起了越來越多的研究者的關(guān)注。裂谷熱病毒的Gn 和Gc 蛋白在病毒入侵過程中起重要作用，因而是裂谷熱病毒疫苗和中和抗體研發(fā)的主要靶點，獲得純化的Gn 和Gc 蛋白具有重要的生物學(xué)意義。

圖6 純化后的截短型Gc蛋白的Western印跡

圖7 ELISA檢測截短型Gc蛋白的免疫反應(yīng)性

目前，裂谷熱病毒Gc 蛋白多為原核表達。在原核表達過程中，大腸桿菌并不能夠?qū)c 蛋白進行糖基化。相較于原核表達系統(tǒng)，真核表達系統(tǒng)更能模擬病毒在感染人或動物后，Gc 蛋白在真核細(xì)胞中翻譯、折疊及成熟的過程，使之更貼近天然構(gòu)象。研究表明，裂谷熱病毒的Gc 蛋白存在數(shù)個位點的糖基化修飾，而這些糖基化修飾對Gc 蛋白的構(gòu)象維持具有重要作用[14-15]。

在本研究中，我們利用Expi293F 懸浮細(xì)胞表達裂谷熱病毒截短型Gc 蛋白，并純化得到純度較高的Gc 蛋白。我們發(fā)現(xiàn)Gc 蛋白容易發(fā)生斷裂，但導(dǎo)致該現(xiàn)象的具體因素以及該蛋白具體斷裂位點尚未見相關(guān)報道，仍須進一步研究。通過SDS-PAGE 可以看出斷裂所致蛋白較少，應(yīng)不影響對截短型Gc 蛋白的后續(xù)研究與應(yīng)用。最后，我們也對純化后蛋白的免疫反應(yīng)性進行了初步檢測，結(jié)果顯示該蛋白的免疫反應(yīng)性較好，可用于后續(xù)疫苗抗原開發(fā)和中和單抗的篩選。