趙俊英

(隴東學院 化學化工學院，甘肅 慶陽 745000)

目前磷作為食品中的一種常量元素，主要以核蛋白、磷蛋白、磷酯等有機態(tài)存在[1]。磷對生命體有著不可低估的作用，因此準確測定蔬菜中磷的含量和存在形式顯得尤為重要。常見的測定磷含量的方法有鉬藍比色法[2]、釩鉬黃比色法[3]、氣相色譜法[4]、原子吸收光譜法[5]、生化分析儀法[6]等測定樣品中磷的含量。與鉬藍比色法相比，釩鉬黃比色法適用范圍較廣，但精密度差；氣相色譜法主要用于有機磷農(nóng)藥殘留的檢測。相比而言，大多數(shù)方法需要進行繁瑣的樣品前處理，耗時間，且儀器價格昂貴，需專業(yè)人員維護，成本過高，不適用于普通的實驗測定。而鉬藍分光光度法可以彌補上述方法的缺點，是一種成本低、快速、簡單、可用于簡單實驗的分析方法。

實驗室一般采用微波消解[7]、濕法消解[8]和干法消解[9]進行樣品前處理，微波消解需要的實驗設備較昂貴，而干法消解耗時較長，用量大且易損失；濕法消解用量少、操作簡便，在短時間內(nèi)就能消解完全，因此本文選擇濕法消解進行樣品前處理，使有機磷轉化為磷酸鹽形式。然后在酸性條件下，使之與鉬酸銨反應生成磷鉬酸銨，被還原劑還原成亮藍色的配合物-鉬藍的原理，測定其吸光度，進而測定試樣中磷的含量。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

721型分光光度計(上海第三分析儀器廠)、菠菜(市售)、鉬酸銨(AR)、對苯二酚(AR)、亞硫酸鈉(AR)、磷酸二氫鉀(AR)、濃硫酸、濃硝酸、30%H2O2。

1.2 樣品處理及試劑配制

準確稱取1 g的菠菜樣品于150 mL錐形瓶中，分別加入5 mL的濃硝酸和濃硫酸，加熱至冒煙，然后待冷卻后加入5 mL 30%H2O2，繼續(xù)緩慢加熱，重復以上的步驟直至瓶內(nèi)不再冒煙，溶液呈無色透明或淡黃色，冷卻后加入5 mL的硝酸(1∶1)溶液，加熱使酸徹底分解，用蒸餾水稀釋至50 mL的容量瓶中待測，用同樣的方法制備空白溶液。

磷標準儲備溶液：精確稱取在105℃下干燥后的磷酸二氫鉀0.4394 g用水溶解并稀釋至100 mL，此溶液每毫升含磷1000 μg。

磷標準使用溶液：用移液管準確移取10.00 mL磷標準儲備溶液至100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻，此溶液磷的濃度是100.0 μg·mL-1；再用移液管準確移取100.0 μg·mL-1磷標準溶液10.00 mL至100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度混勻，此溶液磷的濃度為10.00 μg·mL-1，相當于0.01 mg·mL-1[10]。

2 結果與討論

2.1 波長的確定

準確吸取磷標準使用液0.00、1.00 mL分別置于25 mL的比色管中。依次加入2.00 mL的鉬酸銨(50 g·L-1)，搖勻，靜置幾秒后，分別加入1.00 mL亞硫酸鈉(20 g·L-1)和1.00 mL的對苯二酚(5 g·L-1)，加水至刻度搖勻，從波長630 nm處開始，隔10 nm測一次數(shù)據(jù)，見表1。以波長為橫坐標，吸光度為縱橫坐標作圖，見圖1。

表1 不同波長下的吸光度

圖1 波長與吸光度的關系

由圖1可知，隨著波長增加，吸光度逐漸增加，在波長700 nm處吸光度最大，因此本文確定測定波長為700 nm。

2.2 顯色溫度和顯色時間的確定

當室溫低于15℃時，由于試樣中總磷含量濃度較低，分子間稀疏，低溫時分子運動緩慢，有效碰撞的概率低，使得顯色時間較長[10]，因此本實驗采取在20～30℃的水浴中加熱進行，達到縮短顯色時間的目的。取磷標準使用液0.00、1.00 mL在水浴中分別靜置10、15、20、25、30、35 min后測定吸光度，數(shù)據(jù)見表2，根據(jù)表2數(shù)據(jù)以顯色時間對吸光度作圖，見圖2。之后在相同溫度下，縮小時間的測定范圍，分別靜置20、22、24、26、28、30、32 min后測定，數(shù)據(jù)見表3，據(jù)表3數(shù)據(jù)以顯色時間對吸光度作圖，見圖3。

表2 顯色時間對吸光度的影響

表3 顯色時間對吸光度的影響

圖2 顯色時間和吸光度的關系

圖3 顯色時間和吸光度的關系

由圖2和圖3可知，隨顯色時間的增加，吸光度逐漸增加，在24 min時吸光度最大，因此本文選擇在水浴中靜置24 min之后測定吸光度。

2.3 還原劑用量的確定

取十只25 mL比色管，用移液管移取磷標準液1.00 mL，加入2.00 mL鉬酸銨，靜置幾秒后，分別加入還原劑0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40、1.60、1.80、2.00 mL，然后加水至刻度充分搖勻，靜置24 min后以不加還原劑的空白溶液做參比，測定數(shù)據(jù)見表4，根據(jù)表4數(shù)據(jù)以還原劑對吸光度作圖，見圖4。由圖4可知，隨著還原劑用量的增加，吸光度逐漸增大，之后逐漸減小，在1.80 mL時吸光度最好，故本文選用1.80 mL還原劑進行測定，在實驗過程中還原劑必須現(xiàn)配現(xiàn)用，避免配置時間過長而引起還原失效和溶液渾濁。

表4 還原劑用量對吸光度的影響

圖4 還原劑用量與吸光度的關

2.4 顯色劑用量的確定

取六只25 mL比色管，用移液管移取磷標準溶液1.00 mL，分別加入鉬酸銨1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL，搖勻，靜置幾秒后，分別加入1.80 mL亞硫酸鈉和1.80 mL對苯二酚，搖勻，加水至刻度，靜置24 min后，空白液參比調零，在波長700 nm處測定吸光度，數(shù)據(jù)見表5，據(jù)表5數(shù)據(jù)以鉬酸銨為橫坐標，吸光度為縱坐標作圖，見圖5。

表5 顯色劑用量對吸光度的影響

圖5 顯色劑用量與吸光度的關系

由圖5可知，當顯色劑用量為1.50 mL時，吸光度最大，顯色劑加入過多或過少都會使吸光度降低，因此本文確定顯色劑用量為1.50 mL。

2.5 磷標準曲線的繪制

準確移取磷標準使用液0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL，分別置于25 mL的比色管中，依次加入1.5 mL的鉬酸銨，搖勻，靜置幾秒后，分別加入1.8 mL亞硫酸鈉和1.8 mL對苯二酚搖勻，加水至刻度，靜置24 min后，空白液參比調零，在波長700 nm處測定吸光度，數(shù)據(jù)見表6，以磷標準使用液的體積為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制磷標準曲線，見圖6。其線性回歸方程為：y=0.0506x-0.0069，R2=0.9989，線性關系良好。

表6 體積與吸光度的關系

圖6 磷標準曲

2.6 樣品的測定

準確移取試樣測試液2.00 mL及同量的空白溶液分別置于25 mL比色管中，依次加入1.50 mL鉬酸銨搖勻，靜置幾秒，加入1.80 mL亞硫酸鈉、1.80 mL對苯二酚加水至刻度搖勻，水浴靜置24 min，后，在700 nm波長處測定樣品的吸光度并計算磷含量。測定時應注意盡量按濃度從低到高的順序測定，減少因磷鉬藍在比色皿上的吸附而產(chǎn)生的誤差。數(shù)據(jù)見表7。

表7 試樣中磷含量

測定結果表明，菠菜中磷的平均含量為597.325 mg·kg-1。本實驗進一步證實了分光光度法是測定蔬菜中磷等微量元素的有效方法，同時該方法可作為蔬菜質量檢驗的參考方法。

2.7 加標回收率

在樣品中分別添加不同含量的磷標準液，按本實驗方法法每組平行測定3次，數(shù)據(jù)見表8，通過計算可知，回收率在98%～100%之間，說明方法準可靠。

表8 回收率實驗結果(n=3)

3 結語

本文采用鉬藍分光光度法，通過對波長、顯色時間、顯色劑和還原劑等條件的優(yōu)化，在波長700 nm處加入鉬酸銨1.50 mL、還原劑1.80 mL測定了菠菜中磷的含量，結果顯示菠菜中磷的平均含量為597.325 mg·kg-1。該方法具有操作簡單、試劑用量少、消解速度快、靈敏度高、選擇性好、儀器設備簡單等優(yōu)點，是一般實驗室測定微量元素的一種行之有效的方法。該方法對進一步研究蔬菜食用價值有一定的參考價值，為磷含量的測定提供了一定的理論依據(jù)。