李衛(wèi)先,劉園園
(湖南中醫(yī)藥高等專科學(xué)校,湖南 株洲 412012)
“益氣化瘀補(bǔ)腎湯”來源于祖?zhèn)黩灧?,處方以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo),遵循中醫(yī)辨證論治的原則上組方而成,以益氣、活血化瘀、補(bǔ)肝腎的藥物黃芪、當(dāng)歸、海馬等為君藥,佐以三七、杜仲、牛膝、生地、丹參、紅花、續(xù)斷、威靈仙、甘草等補(bǔ)肝腎、利水、行氣活血止痛的藥物,經(jīng)多年臨床使用取得了非常滿意的療效。益氣化瘀補(bǔ)腎湯藥味較多,有效成分種類繁多,目前國內(nèi)對益氣化瘀補(bǔ)腎湯提取工藝尚無研究,檢測單個指標(biāo)的含量難以反映整體提取效果,本文以干浸膏得率和黃芪甲苷含量為考察指標(biāo),以提取次數(shù)、加水量、提取時間為考察因素[1-4],采用四因素三水平的正交設(shè)計優(yōu)化益氣化瘀補(bǔ)腎湯的提取工藝。
Agilent 1260 HPLC高效液相色譜儀;R-1001N旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);DHG-9140A恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海宏都電子科技有限公司);KQ-500DB數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀有限公司);S205DU電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司);HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司);98-02-B磁力攪拌電熱套(大連楓洲科技有限公司)。
黃芪甲苷對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號:110781-201717),益氣化瘀補(bǔ)腎湯組方藥材均由湖南中醫(yī)藥高等??茖W(xué)校附屬一醫(yī)院提供,經(jīng)湖南中醫(yī)藥高等??茖W(xué)校李飛艷副教授鑒定,本實驗所用藥材質(zhì)量均符合《中國藥典》(2015年版一部)項下相關(guān)規(guī)定,甲醇(色譜純),乙腈(色譜純),正丁醇(分析純),氨水(分析純),水為蒸餾水。
按處方比例,準(zhǔn)確稱取黃芪、三七、當(dāng)歸、杜仲、牛膝、生地、丹參、海馬、紅花、續(xù)斷、威靈仙、甘草等12味藥材,打粉過二號篩,混合均勻,精密稱定,按照正交設(shè)計表提取、過濾,置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中,在水浴上蒸干后,于105℃鼓風(fēng)干燥3 h,置干燥器中冷卻30 min,迅速精密稱定質(zhì)量[5-6],計算干浸膏得率,干浸膏得率=干浸膏質(zhì)量/原藥材質(zhì)量x100%。
2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗
以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑,以乙腈-水(32∶68)為流動相,蒸發(fā)光散射檢測器檢測。理論塔板數(shù)按黃芪甲苷峰計算應(yīng)不低于4000。
2.2.2 對照品溶液的配制[7]
參照《中國藥典》2015版一部方法,取黃芪甲苷對照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液,即得。
2.2.3 供試品溶液的制備[7~9]
精密稱取組方藥材粉末,按照正交設(shè)計表進(jìn)行提取,過濾,參照《中國藥典》2015版一部方法,用正丁醇振搖萃取4次,合并正丁醇提取液,用氨試液洗滌2次,棄去氨試液,正丁醇液減壓蒸干,殘渣加適量甲醇溶解,轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中,定容,搖勻,以0.45 μm微孔濾膜濾過,即得。
表1 正交設(shè)計試驗法因素水平表
選用提取次數(shù)(A)、加水量(B)和提取時間(C)為考察因素,每個因素取3個水平,以干浸膏得率和黃芪甲苷含量作為考察指標(biāo),設(shè)計L9(34)正交試驗。正交試驗因素水平見表1,正交試驗設(shè)計與結(jié)果見表2,方差分析見表3。
表2 正交設(shè)計試驗安排表及干浸膏得率
由表2、表3可知,因素B(加水量)和因素C(提取時間)影響比較顯著,且因素B>因素C,因素A(提取次數(shù))影響不顯著;通過極差大小分析,可以得出結(jié)論,影響提取效果的順序為因素B > 因素C > 因素A,即加水量 > 提取時間 > 提取次數(shù),且B3>B2>B1,C3>C2>C1,A1>A3>A2,因此最佳的提取工藝參數(shù)為A1B3C3,即提取一次,加12倍量蒸餾水,提取60 min。
表3 正交設(shè)計試驗結(jié)果因素間方差分析表
注:方差分析采用LSD法(即最小誤差法)。
按處方比例準(zhǔn)確稱取藥材100 g,按照正交試驗結(jié)果得出的最優(yōu)提取方式,將A1B3C3重復(fù)進(jìn)行3次驗證試驗,結(jié)果見表4,結(jié)果干浸膏得率平均值為24.5% (RSD = 1.49%,n= 3),黃芪甲苷含量為0.0460%(RSD = 1.81%,n= 3),表明該工藝條件穩(wěn)定、可行。
表4 正交設(shè)計驗證試驗結(jié)果
組方中大部分藥材有效成分均為水溶性成分,本試驗用蒸餾水為溶劑對益氣化瘀補(bǔ)腎湯進(jìn)行提取,以干浸膏得率為考察指標(biāo),該工藝及設(shè)備簡單,經(jīng)濟(jì)可行,為益氣化瘀補(bǔ)腎湯的進(jìn)一步研究和制劑開發(fā)研究提供依據(jù);組方中黃芪、當(dāng)歸、海馬等為君藥,后續(xù)的開發(fā)研究中,還應(yīng)檢測阿魏酸、綠原酸等多個有效成分的含量,以更好地控制制劑的藥效。