劉艷賓 楊樹涵 陳紅偉 邢永生

新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院心血管內(nèi)科

冠心?。╟oronary heart disease，CHD）基本病理特征以冠狀動脈形成粥樣硬化性斑塊為主，當(dāng)動脈內(nèi)不穩(wěn)定的斑塊發(fā)生破裂后會誘發(fā)急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI），AMI 發(fā)病兇險且是心內(nèi)科常見的急危重癥之一［1］。微小RNAs（microRNAs，miRNAs）為長度18～22 nt 的非編碼RNA，在靶基因轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯的過程中發(fā)揮顯著作用［2］。報道［3-4］顯示，miRNAs 在CHD 基本病理特征如動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的發(fā)生、發(fā)展中扮演了重要角色，miRNA-34a、miRNA-34b和miRNA-34c 共同構(gòu)成miRNA-34 家族，其中miRNA-34a 在心臟組織中呈現(xiàn)高表達(dá)［5］。研究［6］發(fā)現(xiàn)，miRNA-34a 在含有粥樣硬化樣斑塊的動脈中表達(dá)顯著升高，且miRNA-34a 可作為心源性死亡和心力衰竭的一項預(yù)測指標(biāo)［7］，但目前國內(nèi)關(guān)于CHD 患者血清miRNA-34a 相對表達(dá)水平研究較少，且與CHD 患者臨床特征的相關(guān)性尚不明確，因此，本研究通過RT-PCR 法探討CHD 患者血清miRNA-34a 的相對表達(dá)量并探討其臨床意義，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧性收集2016年1月1日至2019年1月1日于我院心內(nèi)科住院且診斷明確的195例CHD 患者血清及其臨床資料，其中穩(wěn)定型心絞痛（stable angina pectoris，SAP）組87例、急性冠脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）組108例。CHD 患者排除標(biāo)準(zhǔn)為具有心肌疾病病史、心臟瓣膜病史、先天性心臟病、合并嚴(yán)重肝腎功能不全、風(fēng)濕免疫性疾病及惡性腫瘤等。CHD 患者組男94例，女101例，平均（68.63 ± 9.25）歲；另選取我院性別及年齡相匹配且經(jīng)過冠脈造影排除冠脈病變的60例正常體檢者作為對照組，男33例，女27例，平均（64.28 ± 7.55）歲。上述研究對象均知情同意且簽署知情同意協(xié)議書，本研究經(jīng)過我院倫理委員會批準(zhǔn)（倫理號：20151143）。

1.2 研究方法

1.2.1 血清標(biāo)本收集清晨空腹抽取所有研究對象外周靜脈血3 mL 于試管中，靜置20 min 后于轉(zhuǎn)速為8 000 r/min 的4 ℃離心機(jī)中離心10 min，為去除殘余細(xì)胞成分，取上層血清轉(zhuǎn)移至另一試管中，再次于轉(zhuǎn)速為13 000 r/min 的4 ℃離心機(jī)中離心10 min，最后取500 μL 血清轉(zhuǎn)移至無RNA 酶的EP管中分裝，放入-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 總RNA 提取及濃度測定取出樣本后快速置于37 ℃水浴鍋中解凍，每管加入700 μL Trizol 后震蕩并靜置3 min，再加入0.2 mL 氯仿震蕩并靜置3 min，離心后取上層水相于新的無RNA 酶的EP 管中，再次加入等體積異丙醇混合靜置并離心除去上清液，使用1 mL 75%DEPC 酒精洗滌沉淀并室溫干燥，最后加入25 μL DEPC 處理的ddH2O水溶解RNA?？俁NA 濃度采用紫外分光光度計測定其吸光度（A260/A280），當(dāng)A260/A280值為1.8～2.2后繼續(xù)下一步實驗。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量-PCR按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（miScript II RT 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，德國QIAGEN 公司），反應(yīng)體系為：miScriptHispct（5x）4 μL，miScriptNucleics（10x）2 μL，miScript Reverse Transcriptase 2 μL，RNA 模板12 μL。逆轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃60 min，95 ℃10 min。最后加入80 μL ddH2O 水稀釋。按照試劑盒進(jìn)行qPCR 反應(yīng)（miScript SYBR Green 試 劑 盒，德 國QIAGEN 公司），反應(yīng)體系10 μL：預(yù)加熱95 ℃30 min，變性94 ℃15 s，退火55 ℃30 s，延伸70 ℃30 s，共40 個循環(huán)。Ct 值為反應(yīng)孔的熒光信號達(dá)到設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù)。采用U6 作為內(nèi)參，血清中miRNA-34a 的相對表達(dá)量為2-△Ct=CtmiRNA-34a-CtU6。

1.3 基本資料的收集和血清學(xué)指標(biāo)的檢測研究對象的基本資料如性別、年齡、吸煙飲酒史、高血壓及糖尿病病史、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）等均從住院病歷中獲得；血清學(xué)指標(biāo)如血脂、總膽紅素、血糖、血尿酸、超敏C 反應(yīng)蛋白等數(shù)值均為次日清晨空腹抽取外周靜脈血于我院化驗科檢測所得。

1.4 冠狀動脈血管病變程度評定所有研究對象均采用Gensini 積分系統(tǒng)評估冠脈病變情況［8］，冠脈按照冠脈狹窄程度≤25%、26%～50%、51%～75%、76%～90%、91%～99%和100%依次得1、2、4、8、16 分和32 分；節(jié)段積分為該節(jié)段冠脈得分乘以相應(yīng)系數(shù)，具體為左主干得分× 5、左前降支近段得分×2.5、中段得分×1.5、遠(yuǎn)段得分×1、第一對角支得分× 1、第二對角支得分× 0.5、左回旋支近段得分× 2.5、遠(yuǎn)段和后降支均得分× 1、后側(cè)支得分× 0.5、右冠近、中、遠(yuǎn)段和后降支均得分×1，最終Gensini 積分為各分支積分之和。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 17.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗，不符合正態(tài)分布則以中位數(shù)和四分位數(shù)表示，兩樣本比較采用Mann-Whitney 檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗；多組間比較采用方差分析；相關(guān)性分析和多因素分析分別采用Spearman 相關(guān)檢驗和Logistic 回歸分析，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對照組、SAP 組和ACS 組3 組研究對象一般臨床資料的比較3 組研究對象在LDL-c、超敏C反應(yīng)蛋白、吸煙史和Gensini 積分上存在顯著差異，其余指標(biāo)未見明顯差異。見表1。

2.2 對照組、SAP 組和ACS 組3 組研究對象血清miRNA-34a 的相對表達(dá)量的比較ACS 組、SAP組和對照組血清miRNA-34a 相對表達(dá)量中位數(shù)及四分位數(shù)分別為0.79（0.65，0.91），0.46（0.42，0.53）和0.25（0.18，0.41），3 組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=23.641，P＜0.05），其中ACS 組血清miRNA-34a 相對表達(dá)量顯著高于SAP 組及對照組，SAP 組血清miRNA-34a 相對表達(dá)量顯著高于對照組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（統(tǒng)計量分別為6.120，8.768和5.449，均P＜0.05）。見圖1。

表1 3 組研究對象一般臨床資料的比較Tab.1 Comparison of clinical data among three groups ±s，M（P25，P75）

表1 3 組研究對象一般臨床資料的比較Tab.1 Comparison of clinical data among three groups ±s，M（P25，P75）

注：TG，甘油三酯；TC，血清總膽固醇；HDL-c，高密度脂蛋白膽固醇；LDL-c，低密度脂蛋白膽固醇

項目男性［例（%）］平均年齡（周歲）BMI（kg/m2）TG（mmol/L）TC（mmol/L）HDL-c（mmol/L）LDL-c（mmol/L）總膽紅素（μmol/L）脂蛋白（mg/L）空腹血糖（mmol/L）血尿酸（μmol/L）超敏C 反應(yīng)蛋白（mg/L）高血壓［例（%）］糖尿病［例（%）］吸煙史［例（%）］飲酒史［例（%）］Gensini 積分對照組（n=60）33（55.00）64.28±7.55 26.34±1.47 1.06（0.74，1.6）4.12±0.23 1.12±0.18 1.54±0.42 9.36（6.58，16.47）256.36±36.57 5.31±1.12 326.47±45.44 3.45±1.32 18（30.00）23（38.33）31（51.67）25（41.67）3.12±1.47 SAP 組（n=87）46（52.87）67.46±8.46 25.42±3.46 1.13（0.82，1.53）3.58±0.64 1.04±0.16 3.54±1.13 10.24（8.79，16.37）275.46±40.12 5.46±1.74 300.28±34.57 5.28±2.34 32（36.78）28（32.18）63（72.41）42（48.28）20.16±6.43 ACS 組（n=108）48（44.44）69.46±8.32 25.79±2.53 0.91（0.71，1.44）4.94±0.28 1.35±0.24 3.87±0.29 8.69（6.01，15.22）239.18±40.27 5.92±1.45 330.36±54.21 10.52±1.46 46（42.59）43（39.81）82（75.93）61（56.48）45.36±12.34 P 值＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＜0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＜0.05＞0.05＞0.05＜0.05＞0.05＜0.05

2.3 195例CHD 患者血清miRNA-34a 相對表達(dá)量與冠脈病變嚴(yán)重程度的相關(guān)性將195例CHD患者按照冠脈病變支數(shù)分為1支病變組（n=73）、2支病變組（n=72）和3 支病變組（n=50），3 組患者血清miRNA-34a 相對表達(dá)量分別為0.82（0.53，0.74）、0.61（0.49，0.55）和0.40（0.34，0.49），3組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=18.531，P＜0.05）。195例CHD 患者Gensini 積分平均為（36.45±1 0.43），相關(guān)性分析結(jié)果顯示，血清miRNA-34a相對表達(dá)量與Gensini積分呈顯著正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r=0.756，P＜0.001。

2.4 多因素Logistic 回歸分析將發(fā)生冠心病為因變量，以表1 中所有指標(biāo)（除Gensini 積分之外）和血清中miRNA-34a 為自變量進(jìn)行Logistic 回歸分析，分析結(jié)果顯示LDL-c（OR=3.236）和miRNA-34a（OR=4.129）是發(fā)生冠心病的獨立危險因素；將所有研究對象血清miRNA-34a 相對表達(dá)量為因變量，表1 中所有指標(biāo)（除Gensini 積分之外）為自變量進(jìn)行Logistic 回歸分析，分析結(jié)果顯示LDL-c（OR=5.341）是CHD 患者血清miRNA-34a 相對表達(dá)量的獨立危險因素。見表2、3。

表2 冠心病危險因素的Logistic 回歸分析Tab.2 Risk factors of coronary heart disease by Logistic regression analysis

表3 冠心病患者血清miRNA-34a 相對表達(dá)量的危險因素的Logistic 回歸分析Tab.3 Risk factors for the relative expression of serum microRNA-34a in patients with coronary heart disease by Logistic regression analysis

圖1 對照組、SAP 組和ACS 組3 組研究對象血清miRNA-34a 的相對表達(dá)量Fig.1 Expression of serum microRNA34a levels in control group，SAP group and ACS group

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，CHD 患者血清miRNA-34a 相對表達(dá)量顯著升高，且miRNA-34a 與CHD 患者冠脈病變嚴(yán)重程度具有顯著正相關(guān)性，這進(jìn)一步證實miRNA-34a 可能參與了CHD 的發(fā)病機(jī)制。ACS 患者相對于SAP 患者短期及長期預(yù)后均較差，我們亞組分析結(jié)果顯示，ACS 組miRNA-34a 的相對表達(dá)量顯著高于SAP 組，故而miRNA-34a 在一定程度上可能與CHD 患者臨床轉(zhuǎn)歸顯著相關(guān)。FUKUI 等［9］比較382例ACS 和851例SAP 患者臨床資料后發(fā)現(xiàn)，ACS 組患者手術(shù)死亡率和低輸出量綜合征發(fā)生風(fēng)險均顯著高于SAP 組患者（2.6%vs.0.1%；3.1%vs. 1.2%，均P＜0.05）；LV 等［7］發(fā)現(xiàn)，相對于無左室重構(gòu)組患者而言，miRNA-34a 在左室重構(gòu)組患者表達(dá)水平顯著升高，且miRNA-34a 水平的升高是死亡及心力衰竭的危險因素（OR=4.18）。另一方面，筆者通過Logistic 回歸分析發(fā)現(xiàn)，miRNA-34a 和LDL-c 均是發(fā)生CHD 的危險因素，且LDL-c 是miRNA-34a 水平升高的一項獨立影響因素，既往研究均已證實，LDL-c 可通過多種途徑參與了CHD 的發(fā)病機(jī)制，本研究認(rèn)為LDL-c 可能是通過促進(jìn)miRNA-34a 的過度表達(dá)而參與了CHD 的發(fā)病，但是具體機(jī)制尚待進(jìn)一步進(jìn)行研究。

冠狀A(yù)S 是CHD 發(fā)病的重要病理生理基礎(chǔ)，而血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）是參與AS 發(fā)生發(fā)展的重要組成細(xì)胞［10］。多項研究［11-13］發(fā)現(xiàn)miRNA-34a 可通過多種機(jī)制作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞和VSMC 而參與AS的發(fā)生、發(fā)展。血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生老化及凋亡是導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙及AS 形成的關(guān)鍵性環(huán)節(jié)，動物實驗［11］發(fā)現(xiàn)，相對于正常小鼠而言，AS 模型小鼠大動脈中miRNA-34a 表達(dá)水平顯著升高，且當(dāng)小鼠給予抗miRNA-34a 處理后，血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡比例顯著下降，同時發(fā)現(xiàn)與凋亡相關(guān)蛋白如Bax、Caspase-3 及9 均顯著下調(diào)，而抗凋亡相關(guān)蛋白如Bcl-2 表達(dá)卻顯著升高；MiRNA-34a 高表達(dá)后可抑制沉默信息調(diào)節(jié)因子2 相關(guān)酶1（Silent information regulator factor 2-related enzyme 1，SIRT 1），誘導(dǎo)促炎因子如血管細(xì)胞粘附分子1 及IL-6 等生成，從而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，同時SIRT 1 還具有防止內(nèi)皮細(xì)胞老化及凋亡等功能［12］。VSMC 的增殖在AS 斑塊形成早期及血管損傷時較為顯著，VSMC除了具有穩(wěn)定纖維帽作用外，VSMC 的遷移也認(rèn)為在AS 的形成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［13-14］。血管內(nèi)皮干細(xì)胞可分化為VSMC，而miRNA-34a 通過SIRT1誘導(dǎo)干細(xì)胞向VSMC 分化，導(dǎo)致VSMC 在血管內(nèi)膜大量積聚，最終促進(jìn)了血管內(nèi)As 斑塊形成及管腔狹窄［15］。血管鈣化是心血管疾病患者死亡風(fēng)險增加的主要因素之一，而血管鈣化的本質(zhì)是骨化型VSMC 細(xì)胞過多，BADI 等［16］對比miRNA-34a+/+和miRNA-34a-/-小鼠后發(fā)現(xiàn)，miRNA-34a+/+小鼠動脈中膜的鈣沉積及血管鈣化標(biāo)志物Runx2 和Sox9 表達(dá)均顯著升高，miRNA-34a 能夠通過下調(diào)SIRT1 從而引起VSMC 老化，誘導(dǎo)VSMC 分化型向骨化型轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致動脈壁鈣化。

綜上所述，本研究新穎之處在于首次證實CHD 患者血清中miRNA-34a 表達(dá)水平顯著上調(diào)，可作為反映CHD 冠脈病變嚴(yán)重程度的一個血清學(xué)指標(biāo)，且與CHD 發(fā)病具有一定聯(lián)系，這也為miRNA-34a 將來是否可以作為CHD 治療的一個作用靶點提供思路。但本研究的局限性在于未探討miRNA-34a 促進(jìn)CHD 患者AS 發(fā)生發(fā)展中的具體作用機(jī)制，同時CHD 患者血清中miRNA-34a 的表達(dá)量上調(diào)仍需要大量樣本量進(jìn)一步證實，此外，CHD 患者冠狀動脈斑塊中miRNA-34a 的表達(dá)水平仍需要進(jìn)一步探討；在未來，仍需要大樣本量的隊列研究來證實miRNA-34a 高表達(dá)是否增加CHD 患者AS 的發(fā)生風(fēng)險。