白江江, 宗新玲, 高維東, 曹光材, 霍愛鑫

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院, 1. 肛腸外科; 2. 免疫風(fēng)濕科, 陜西 延安, 716000)

中國胃癌每年新發(fā)病例約占世界年發(fā)病例數(shù)的40.00%, 胃癌發(fā)病率和死亡率逐年上升，約60.00%的胃癌患者首次就診時(shí)已處于進(jìn)展期[1-2], 而傳統(tǒng)的化療藥物對(duì)進(jìn)展期胃癌的治療效果仍不理想。近年來，針對(duì)關(guān)鍵分子的靶向治療逐漸應(yīng)用于進(jìn)展期胃癌的治療[3-4], 但原發(fā)或繼發(fā)耐藥現(xiàn)象導(dǎo)致部分胃癌患者的治療效果欠佳，研究胃癌的分子靶向藥物的耐藥調(diào)控機(jī)制，可能為胃癌的精準(zhǔn)治療提供新的研究方向[5]。本研究通過冬凌草甲素、西妥昔單抗單藥或聯(lián)合與SGC7901胃癌細(xì)胞株共培養(yǎng)后，檢測(cè)冬凌草甲素對(duì)SGC7901胃癌細(xì)胞株增殖、凋亡的影響，探討冬凌草甲素增強(qiáng)西妥昔單抗化療敏感性的機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系、試劑與儀器

人胃癌細(xì)胞系SGC7901購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。RPMI- 1640細(xì)胞培養(yǎng)基(美國Hyclone 公司); 四甲基偶氮唑藍(lán)(美國Promega); 熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(日本TaKaRa公司); 冬凌草甲素(碧云天生物技術(shù)有限公司); Western Blot檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司); 流式細(xì)胞儀(BD Biosciences公司); 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國Bio Rad公司); SDS- PAGE 蛋白電泳槽(美國Bio- Rad公司)。

目的基因引物序列如下: 人B細(xì)胞淋巴瘤- xL(Bcl- xL)的正向引物序列(5′- 3′)TCGAGGCCTATGTAACG, 反向引物序列(5′- 3′)ACCGTCGGTAAGCTGAG; 細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的正向(5′- 3′)CGTGTTACCAGATA, 反向(5′- 3′)ATCGTCTAGGACCTGTACC; β激動(dòng)蛋白(β- actin)的正向(5′- 3′)CGAGTCAGGGCTAATGC, 反向(5′- 3′)ACGTGTTGGCAAGCTACC。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT法)檢測(cè)冬凌草甲素對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901的增殖抑制: 人胃癌SGC7901細(xì)胞系均置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的RPMI1640, 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，待細(xì)胞鋪滿瓶底面積80%～90%時(shí)用0.25%胰酶終止培養(yǎng)，按5 000/孔接種于96孔板，加入冬凌草甲素使終濃度分別為10.00、20.00、40.00、80.00 μmol/L, 共培養(yǎng)48 h; 將5.00 mg/mL MTT溶液20.00 μL加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，繼續(xù)培養(yǎng)箱孵育4 h; 棄上清液，每孔加入150.00 μL 二甲基亞砜(DMSO), 振蕩5 min, 在酶標(biāo)儀上測(cè)吸光度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞抑制率。另取5組細(xì)胞，加入冬凌草甲素使其終濃度40.00 μmol/L, 共培養(yǎng)0、24、48、72 h，同樣方法計(jì)算細(xì)胞抑制率。

1.2.2 冬凌草甲素、西妥昔單抗單藥、聯(lián)合用藥對(duì)SGC7901胃癌細(xì)胞凋亡的影響: 取對(duì)數(shù)生長期胃癌細(xì)胞SGC7901, 將細(xì)胞分為4組，即空白對(duì)照組; 冬凌草甲素組，終濃度40.00 mol/L; 西妥昔單抗組，終濃度0.05 g/L; 冬凌草甲素(40.00 mol/L)聯(lián)合西妥昔單抗(0.05 g/L)用藥組。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，共培養(yǎng)24 h后MTT法計(jì)算細(xì)胞抑制率。取上述4組細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后, PBS洗滌3次，制備單細(xì)胞懸液, 100.00 μL的單細(xì)胞懸液中，加入5.00 μL Annexin V- FITC和2.50 μL PI, 避光孵育15 min, 加入結(jié)合緩沖液后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率及各細(xì)胞周期細(xì)胞數(shù)。

1.2.3 細(xì)胞中表皮生長因子受體(EGFR)、蛋白激酶B(AKT)、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)、信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3(STAT3)磷酸化表達(dá)水平以及Bcl- xL、Cyclin D1的轉(zhuǎn)錄水平: 取對(duì)數(shù)生長期胃癌細(xì)胞SGC7901, 將細(xì)胞分為4組，即空白對(duì)照組; 冬凌草甲素組，終濃度40.00 mol/L; 西妥昔單抗組，終濃度0.05 g/L; 冬凌草甲素(40.00 mol/L)聯(lián)合西妥昔單抗(0.05 g/L)用藥組; Trizol法提取細(xì)胞內(nèi)總RNA, RT- PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Bcl- xL、Cyclin D1 mRNA的表達(dá)。另取上述4組細(xì)胞, RIP法裂解細(xì)胞; 提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)SDS- PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)膜、抗體結(jié)合、顯色后檢測(cè)磷酸化表皮生長因子受體(pEGFR)、磷酸化蛋白激酶B(pAKT)、磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(pERK)、磷酸化信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3(pSTAT3)蛋白的表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 冬凌草甲素對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901的增殖抑制

胃癌細(xì)胞SGC7901與不同濃度冬凌草甲素共培養(yǎng)48 h后，冬凌草甲素濃度越高，對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖抑制作用越強(qiáng), 80.00 μmol/L的冬凌草甲素的細(xì)胞抑制率達(dá)(83.60±10.80)%, 高于10.00、20.00、40.00 μmol/L冬凌草甲素的細(xì)胞抑制率(F=67.78,P<0.01)。40.00 μmol/L的冬凌草甲素濃度與SGC7901共培養(yǎng)不同時(shí)間后，隨著作用時(shí)間的延長，其對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制也逐漸增強(qiáng), 72 h細(xì)胞抑制率為(95.60±21.40)%, 高于其他時(shí)點(diǎn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=41.78,P<0.01)。見圖1。

A: 不同質(zhì)量濃度的冬凌草甲素對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制率; B: 40 μmol/L冬凌草甲素不同作用時(shí)間下對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制率

圖1 冬凌草甲素對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901增殖的抑制作用

2.2 冬凌草甲素、西妥昔單抗單藥及聯(lián)合用藥對(duì)SGC7901胃癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響

MTT檢測(cè)冬凌草甲素、西妥昔單抗單藥、聯(lián)合用藥與SGC7901胃癌細(xì)胞共培養(yǎng)后，聯(lián)合用藥組對(duì)細(xì)胞的抑制率為(86.40±11.60)%, 顯著高于單藥處理組(F=77.46,P<0.01)。見圖2。流式細(xì)胞儀檢測(cè)冬凌草甲素聯(lián)合西妥昔單抗處理組細(xì)胞凋亡率高達(dá)(57.10±8.70)%, 顯著高于西妥昔單抗組(9.30±2.20)%、冬凌草甲素組(18.20±4.20)%、對(duì)照組(2.90±0.90)%, 且冬凌草甲素組高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。冬凌草甲素作用細(xì)胞后G0/G1期細(xì)胞比例為(48.60±7.30)%, 西妥昔單抗作用后G0/G1期細(xì)胞比例為(45.80±6.70)%, 聯(lián)合用藥組G0/G1期細(xì)胞增加至(70.30±8.50)%, S期細(xì)胞減少至(15.10±2.60)%, 與其他各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

2.3 細(xì)胞中EGFR、AKT、ERK、STAT3磷酸化表達(dá)水平以及Bcl- xL、Cyclin D1的轉(zhuǎn)錄水平

以SGC7901胃癌細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用 Western blot 法檢測(cè)pEGFR、pAKT、pERK、pSTAT3表達(dá)變化，結(jié)果顯示，冬凌草甲素處理細(xì)胞后pEGFR、pAKT、pERK、pSTAT3表達(dá)下降，冬凌草甲素聯(lián)合西妥昔單抗聯(lián)合用藥組細(xì)胞下降更明顯，與其余各組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Real- time PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Bcl- xL、Cyclin D1 mRNA的表達(dá)變化，結(jié)果顯示冬凌草甲素處理細(xì)胞后, Bcl- xL、Cyclin D1表達(dá)下降，冬凌草甲素聯(lián)合西妥昔單抗聯(lián)合用藥組細(xì)胞下降更明顯，與其余各組比較均有顯著差異(P<0.05)。見圖4。

圖2 冬凌草甲素、西妥昔單抗單藥、聯(lián)合用藥對(duì)SGC7901胃癌細(xì)胞增殖的影響

圖3 冬凌草甲素、西妥昔單抗單藥、聯(lián)合用藥對(duì)SGC7901細(xì)胞周期的影響

A: 不同組別中pEGFR、pAKT、pERK、pSTAT3的蛋白相對(duì)表達(dá); B: Real- time PCR檢測(cè)不同組別中Bcl- xL、Cyclin D1的mRNA表達(dá)

圖4 冬凌草甲素、西妥昔單抗單藥、聯(lián)合用藥對(duì)pEGFR、pAKT、pERK、pSTAT3、Bcl- xL、Cyclin D1表達(dá)的影響

3 討 論

中國胃癌的發(fā)病率居惡性腫瘤第2位，進(jìn)展期胃癌的病死率較高，以外科手術(shù)切除為主的治療方案是進(jìn)展期胃癌的主要治療手段，但發(fā)生轉(zhuǎn)移時(shí)的胃癌患者5年存活率僅為2.00%。多項(xiàng)研究[6-7]證實(shí), EGFR在胃癌中呈高表達(dá)，并與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后有關(guān)。近年來，針對(duì)EGFR的靶向藥物西妥昔單抗聯(lián)合常規(guī)化療藥已用于晚期胃癌患者的治療，然而療效欠佳[8-9]。研究[10-12]發(fā)現(xiàn)，西妥昔單抗的原發(fā)耐藥及獲得性耐藥可能是導(dǎo)致其療效不顯著的主要原因。

冬凌草甲素是一種從冬凌草植物提取的二萜類化合物，具有抗腫瘤等多種生物活性，對(duì)人表皮癌A431細(xì)胞、宮頸癌Hela細(xì)胞、人前列腺PC- 3癌細(xì)胞具有抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用[13]。胃癌組織中過表達(dá)的EGFR能通過磷酸化上調(diào)下游信號(hào)通路ERK、AKT/NFκB和 JNK- STAT3, 從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲能力[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素抑制胃癌細(xì)胞的增殖呈濃度與時(shí)間依賴性，濃度越高，作用時(shí)間越長，抑制細(xì)胞增殖作用越明顯。冬凌草甲素聯(lián)合西妥昔單抗用藥對(duì)細(xì)胞的抑制率(86.40±11.60) %,高于冬凌草甲素、西妥昔單抗單藥處理，表明冬凌草甲素聯(lián)合西妥昔單抗能有效增強(qiáng)其抑制細(xì)胞的增殖作用。冬凌草甲素聯(lián)合西妥昔單抗誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡較單藥明顯，初步證實(shí)冬凌草甲素可抑制胃癌細(xì)胞增殖及增強(qiáng)西妥昔單抗化療敏感性。

人類信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3(STAT3)基因定位于第17號(hào)染色體(q21.31)[16], 研究[17]證實(shí)胃癌中酪氨酸激酶異常激活將導(dǎo)致STAT3磷酸化，磷酸化的STAT3轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)控下游靶基因Cyclin D1、Bcl- xL, 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。目前, EGFR抑制劑西妥昔單抗并未顯示出顯著的抗癌療效，但本研究發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素聯(lián)合西妥昔單抗處理組細(xì)胞凋亡率高達(dá)(57.10±8.70)%, G0/G1期細(xì)胞比例增至(70.30±8.50)%, S期細(xì)胞比例降低至(15.10±2.60)%, 與單獨(dú)用藥比較均有顯著差異，表明冬凌草甲素不但能增強(qiáng)西妥昔單抗誘導(dǎo)凋亡能力，還能阻滯人胃癌細(xì)胞SGC7901于G0/G1期，從而使腫瘤細(xì)胞對(duì)常規(guī)細(xì)胞周期毒性化療藥物敏感性增加。