張?zhí)m，郭華偉，李夢菡,2，廖楊文科，李鑫*，韓文炎*

一種茶枝致病菌的分離鑒定及致病力分析

張?zhí)m1，郭華偉1，李夢菡1,2，廖楊文科3，李鑫1*，韓文炎1*

1. 中國農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所，浙江 杭州 310008；2. 中國農(nóng)業(yè)科學院研究生院，北京 100081；3. 南京林業(yè)大學生物與環(huán)境學院南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037

采用形態(tài)學和分子鑒定方法確定采自建德市大同鎮(zhèn)茶園茶枝的致病菌為鐮刀菌與茶炭疽菌，鑒定并報道為茶樹致病菌。龍井43和中茶108離體葉片及莖稈用于兩種病原菌致病力分析試驗，結(jié)果顯示，對龍井43嫩葉及莖稈具有較強侵染力，是造成該茶枝莖稈病害的主要致病菌，并且可能與.共同侵染茶樹葉片。因此，在今后茶樹病害識別與防控方面需要密切關(guān)注。

形態(tài)學鑒定；分子鑒定；茶枝；鐮刀菌；致病力

茶樹是我國重要的經(jīng)濟作物，多生長在溫暖多雨的暖溫帶、亞熱帶地區(qū)。氣候溫熱多雨導致茶區(qū)病害大量滋生且種類繁多[1]。真菌病害是茶樹病害中數(shù)量最多的一類。據(jù)統(tǒng)計，我國已記載的138種茶樹病害中，真菌病害就有72種[2]，多危害茶樹芽、葉、莖及根部，如茶餅病、茶炭疽病、茶云紋葉枯病、茶枝梢黑點病和茶紅根腐病等，嚴重影響茶樹生長、茶葉品質(zhì)和產(chǎn)量[3]。

因茶樹病原真菌種類多，且部分有性、無性階段分類混亂，同時還存在近似種內(nèi)生菌的干擾，導致了茶樹病原菌鑒定的復雜性[4]。基于DNA序列的分子分類技術(shù)克服了傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定方法繁雜且難以確定真菌合適分類地位的缺陷，成為目前植物真菌病原鑒定的新趨勢。其中，真核生物核糖體DNA（Ribosome DNA，rDNA）的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列（Internal transcribed spacer，ITS）作為分子標記最先應(yīng)用于植物病原真菌的分類、鑒定和病害診斷[5-6]。隨后，多種基因如β-微管蛋白基因（Beta-tublin，β-Tub）、肌動蛋白基因（Actin，ACT）、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、鈣調(diào)蛋白基因（Calmodulin，CAL）等也被應(yīng)用于病原真菌的鑒定和分類研究，多基因序列的系統(tǒng)進化分析克服了單基因序列鑒定的不準確性，應(yīng)用也更加廣泛。

本試驗利用傳統(tǒng)形態(tài)學分類結(jié)合分子分類技術(shù)，鑒定了一種采自建德市大同鎮(zhèn)茶園枝條的致病菌并分析其致病力，為后期茶園病害防治提供理論和指導依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

茶枝采自建德市大同鎮(zhèn)茶園的烏牛早品種，該病害在此茶園普遍發(fā)生。2018年8月15日在茶園均勻取樣進行病原菌分離鑒定。用于病原菌致病力分析的龍井43和中茶108葉片及枝條采自杭州龍冠實業(yè)有限公司茶園。

1.2 試驗方法

將茶枝葉腋及葉片的病健分界處切成小塊，無菌消毒后置于滅好菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基中，封口膜封口，于26℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至產(chǎn)生菌絲。用無菌刀在菌落邊緣切下約1?cm×1?cm的菌絲塊，置于新PDA培養(yǎng)基中，26℃繼續(xù)培養(yǎng)至菌絲產(chǎn)生。按上述方法純化3~4次。

取純化3~4次后的病原菌約0.5?cm×0.5?cm菌絲塊，接種至劃傷的龍井43葉片上，接種后的葉片置于鋪有浸水紗布的托盤中，托盤用保鮮膜封口，于26℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至病斑擴展，采用上述方法再次分離純化得到病原菌。

1.2.2 病原菌形態(tài)學及生長速度觀察

取約0.5?cm×0.5?cm病原菌菌絲塊至PDA培養(yǎng)基中，設(shè)置5個重復，26℃恒溫培養(yǎng)7?d，十字交叉法測量并記錄每天的菌落直徑。觀察并記錄菌落在PDA培養(yǎng)基上的顏色、質(zhì)地及菌絲特征，使用蔡康XSP-13CC顯微鏡觀察菌絲及分生孢子形態(tài)，拍照并測量孢子大小。

1.2.3 病原菌PCR鑒定

菌絲布滿培養(yǎng)基后，用無菌刀刮至1.5?mL無菌離心管中，液氮速凍。采用植物組織DNA提取試劑盒（TIANGEN）提取病原菌DNA，然后進行PCR擴增。試驗采用ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'；BT2a：5'-GGTAACCAAATCGGTCCTGCTTTC-3'，BT2b：5'-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3'；ACTF：5'-ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC-3'，ACTR：5'-TACGAGTCCTTCTGGCCCAT-3'引物分別擴增病原菌DNA的ITS、β-Tub與ACT基因序列[7-8]。50?μL PCR反應(yīng)體系包括：Premix Taq（TAKARA） 25?μL，濃度稀釋為10?μmol·L-1的正、反向引物各2?μL，無菌ddH2O 19?μL，DNA模板2?μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5?min；95℃變性30?s，58℃退火30?s，72℃延伸40?s，40個循環(huán)；72℃延伸10?min，4℃保存。取5?μL PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定條帶，大小符合要求的樣品送杭州尚亞賽生物技術(shù)有限公司純化測序。

1.2.4 多基因進化樹的構(gòu)建

3.1 傳統(tǒng)的數(shù)字PCR是進行絕對核酸量化的方法，它基于在有限稀釋的條件下將各個分析物分子分配成許多重復反應(yīng)的絕對核酸定量方法，在大多數(shù)反應(yīng)中產(chǎn)生1個或0個分子。終點PCR后，模板的起始濃度通過泊松分布統(tǒng)計分析確定陽性（含有擴增的靶標）和陰性（未擴增的靶標檢測的反應(yīng)）。數(shù)字 PCR比qPCR具有許多潛在的優(yōu)勢。近來，該技術(shù)已經(jīng)商業(yè)化，將反應(yīng)分為納米級大小的液滴。數(shù)千個液滴的快速微流體分析每個樣品使ddPCR適用于常規(guī)使用，并大大提高了系統(tǒng)的實際動態(tài)范圍（對每個液滴的多個目標分子進行泊松校正）[20]。

將測序得到的ITS、β-Tub與ACT基因序列分別在NCBI中進行BLAST，根據(jù)比對結(jié)果，參考文獻[7,9]，從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載同源性較高的序列或已知菌種序列，與試驗真菌的測序序列一起，利用MEGA 7.0中Maximum Likelihood方法分別構(gòu)建基因進化樹。

1.2.5 病原菌離體接種

分別取龍井43與中茶108芽下三葉、五葉各15片作為嫩葉和成熟葉接種病原菌。在葉脈一側(cè)葉片表皮上輕劃3道2?mm的平行傷口作為1個接種點（以葉脈對稱，嫩葉劃2個接種點，成熟葉劃4個接種點）。將菌絲均勻的菌落劃成2?mm×2?mm的菌落塊，置于接種點上；混合接種則將兩病原菌各1?mm×2?mm的菌落塊水平放置于同一接種點上。兩品種嫩葉、成熟葉各5片為對照組，接種點上放置同等大小PDA培養(yǎng)基塊。接種好的葉片放于鋪有浸水紗布的托盤內(nèi)保濕，托盤用保鮮膜封閉后放于26℃生化培養(yǎng)箱中。接種4?d后葉片產(chǎn)生擴展性病斑，相機拍照，用十字交叉法測量病斑直徑并統(tǒng)計發(fā)病率（后期接種點處形成圓形病斑即為發(fā)病，各處理發(fā)病率=總發(fā)病接種點數(shù)/總接種點數(shù)）。

剪長度為30?cm的龍井43和中茶108茶枝，在芽下第四葉葉柄處的莖稈上用無菌刀劃5道平行莖稈的0.5?cm傷口作為接種點，接種1?cm×0.5?cm菌絲塊；混合接種則是將兩病原菌各0.5?cm×0.5?cm的菌落塊平行置于同一接種點上。每個處理10個重復。對照組在接種點放置同等大小的PDA培養(yǎng)基塊。接種點接種后纏上無菌紗布，將枝條插入蒸餾水中，室溫放置，紗布每天噴施蒸餾水保持濕度。待接種12?d后莖稈發(fā)病，相機拍照。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010進行數(shù)據(jù)整理，SAS 8.1統(tǒng)計軟件進行顯著性差異分析，MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，Photoshop CS3進行圖像處理，OriginPro 8.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶枝發(fā)病特點觀察

由圖1所示，茶枝從葉柄處的莖稈上發(fā)病，病斑多呈灰黑色不規(guī)則水浸狀。病斑從葉柄處繼續(xù)向葉片擴展，并沿葉脈向葉尖和葉邊緣侵染，葉背面病健交界處呈現(xiàn)深綠色水漬狀。葉片病斑初期為褐色，后變灰白，其上著生許多灰黑色小粒點。后期病斑進一步擴大，致使葉片干枯壞死或脫落。嫩葉葉柄失水變黑，葉片萎蔫、卷曲下垂。

2.2 病原菌分離與形態(tài)學鑒定

采用組織分離法得到分離率為43.8%和37.5%的純培養(yǎng)性狀顯著不同的兩種病原真菌。將兩種病原菌2?mm×2?mm的菌絲塊接種至劃傷的龍井43葉片上，產(chǎn)生病斑后按組織分離法再分離純化，得到的病原菌與接種病原菌的培養(yǎng)性狀相同，分別命名ZJX與ZJY（圖2）。

ZJX在PDA培養(yǎng)基上26℃恒溫培養(yǎng)的生長速度為0.77?cm·d-1（圖2-A）。菌落白色，生長旺盛，后期夾帶淡黃色，背面產(chǎn)生黃色或淡黃褐色色素；氣生菌絲繁茂，羊絨狀，白色至淡黃色，菌絲有橫隔，分枝；大型分生孢子長紡錘形或鐮刀狀，3~5個隔，約(22.0~36.8)μm ×(3.2~5.2)μm；小型分生孢子形態(tài)多樣，長橢圓形、腎形或披針形，0~3個隔，約(8.8~16.3)μm ×(2.0~3.6)μm；未見厚垣孢子（圖2-B）。根據(jù)形態(tài)特征，對比文獻[10-13]，初步判定ZJX為鐮刀菌。

ZJY在PDA培養(yǎng)基上26℃恒溫培養(yǎng)的生長速度為1.17?cm·d-1（圖2-A）。菌落邊緣規(guī)則，氣生菌絲白色、短而致密、絨毛狀，部分菌絲有隔；ZJY產(chǎn)生大量的橙紅色分生孢子堆及黑色的分生孢子座，從菌落中心開始向外擴展生出；分生孢子透明，兩端鈍圓，長橢圓形，大多中間縊縮，大小約(13.2~15.9)μm×(4.0~5.8)μm（圖2-C）。由上述特征初步判定ZJY為炭疽菌屬，但無法確定種。

圖1 茶園采回的病害枝條及葉片

圖2 病原菌分離與形態(tài)學特征

2.3 病原菌分子鑒定

對兩種病原菌DNA的ITS、β-Tub和ACT基因克隆后測序，分別得到519、552?bp的ITS序列，314、463?bp的β-Tub序列和251、256?bp的ACT序列。

將ZJX的ITS、β-Tub及ACT序列分別比對，從結(jié)果中下載同源性較高的序列信息，構(gòu)建進化樹。ITS序列比對結(jié)果顯示，ZJX與（MG808373.1）聚在同一支，支持率94%，親緣關(guān)系最近（圖3-A）。β-Tub序列比對結(jié)果證實，ZJX與（KJ020861.1）聚在一個較大的分支上，兩者親緣關(guān)系最近（圖3-B）。ACT序列比對結(jié)果則表明ZJX與（JQ342171.2）親緣關(guān)系最近（圖3-C）。結(jié)合ZJX的形態(tài)學鑒定結(jié)果，確定其為鐮刀菌。

ZJY的3個基因序列比對后均顯示其為茶炭疽菌。根據(jù)王玉春[9]的研究結(jié)果，從Genbank中下載了我國主要產(chǎn)茶區(qū)分離并鑒定得到的11個茶炭疽菌種的ITS、β-Tub及ACT基因序列信息，分別構(gòu)建進化樹（圖3-D—3-F）。結(jié)果表明，ZJY與聚在同一分支，支持率分別為85%、92%、89%。因此，判定ZJY為茶炭疽菌。

圖3 基于ZJX與ZJY DNA的ITS、β-Tub和ACT序列分析構(gòu)建進化樹

2.4 病原菌致病力比較與分析

采用龍井43、中茶108離體葉片與莖稈單獨或混合接種兩病原菌，進一步比較與分析其致病力。結(jié)果表明，比對龍井43和中茶108葉片的致病力弱。在龍井43嫩葉上形成的病斑面積小于（圖4-A和4-C）；且在龍井43成熟葉、中茶108嫩葉及成熟葉上未形成明顯病斑（圖4-A），發(fā)病率分別只有16.7%、15%、4.2%，顯著低于在龍井43成熟葉、中茶108嫩葉及成熟葉的發(fā)病率86.3%、82.5%、25%（圖4-B）。但對龍井43嫩葉有較強致病力，導致混合接種的發(fā)病率及病斑面積與單獨接種沒有顯著差異（圖4-A—C）莖稈接種結(jié)果顯示，兩病原菌對龍井43的致病力明顯強于中茶108。在龍井43莖稈上產(chǎn)生大面積黑褐色病斑并向葉柄及葉脈處延伸，在龍井43莖稈上未形成擴展性病斑。病原菌混合接種的發(fā)病程度輕于單獨接種，重于單獨接種（圖4-D）。

注：圖中“+”表示接種相應(yīng)菌種，“-”表示未接種；圖4-C中不同的字母表示存在顯著性差異（P＜0.05）

3 討論

本試驗對采自建德市大同鎮(zhèn)茶園茶枝的病原菌進行分離鑒定，利用形態(tài)學與分子鑒定方法確定茶枝致病菌為鐮刀菌.及茶炭疽菌，并進行了兩種病原菌致病力分析。

鐮刀菌是侵染植物維管束系統(tǒng)的重要致病菌，寄主廣泛且危害嚴重[14-18]。鐮刀菌亦是茶樹致病菌，多造成茶樹莖腐和根腐性病害[19-22]，彭成彬等[7]則首次鑒定并報道三線鐮刀菌為金萱茶葉片致病菌。鐮刀菌.可造成甜瓜果腐、玉米莖腐、竹稈潰爛、木蠟果斑[[10-13]等多種病害，而.系烏牛早茶樹的致病菌在本研究中被首次鑒定并報道。

茶炭疽菌是茶樹重要病原菌，我國茶炭疽菌分類鑒定及系統(tǒng)發(fā)育學分析已取得豐富的成果[9,23-24]。炭疽菌菌落顏色、生長速度、氣生菌絲及分生孢子大小等純培養(yǎng)特征在其分類鑒定上具有重要的參考價值[25]。在本研究中，ZJY DNA中ITS、β-Tub和ACT基因序列的進化分析結(jié)果顯示其為茶樹已知炭疽菌（圖3-D—3-F），支持率分別為85%、92%、89%，但ZJY純培養(yǎng)特征與已報道的特征存在差異[9,24]（圖2），這可能與菌變異、地理隔離或培養(yǎng)環(huán)境有著密切關(guān)系。

劉威等[26]首次發(fā)現(xiàn)為茶炭疽病菌的新種，其與同為我國茶樹優(yōu)勢致病種[9]。本試驗結(jié)果也證實對龍井43葉片具有強致病力。而與相比，.對茶樹莖稈的致病力更強，但其也易侵害龍井43嫩葉（圖4）。試驗茶枝病斑從葉柄基部莖稈開始，沿葉柄與葉脈向葉邊緣擴展（圖1），病癥顯著不同于常見茶炭疽病葉表型[3,24]。結(jié)合鐮刀菌易侵染植物維管束系統(tǒng)的現(xiàn)象可推測，.可能是先侵染該茶病枝的莖稈，當侵染至葉脈處后，又與共同侵染。另外，與龍井43相比，中茶108防御[9]與.侵染的抗性更強（圖4），推測中茶108可能對真菌病害具有廣譜抗性。

綜上，本研究首次鑒定并證實鐮刀菌（.）是一種茶樹致病菌，其對龍井43嫩葉、莖稈具有較強致病力，為今后茶樹真菌病害防治提供了理論基礎(chǔ)。

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Identification and Pathogenicity Analysis of Pathogens in Tea Branches

ZHANG Lan1, GUO Huawei1, LI Menghan1,2, LIAO-YANG Wenke3,LI Xin1*, HAN Wenyan1*

1. Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Science, Hangzhou 310008, China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 3. Co-Innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China, College of Biology and the Environment, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China

The pathogens of diseased tea branches in tea garden of Datong town, Jiande city were identified by morphological and molecular methods. Two fungal pathogens were identified, namelyand.here was reportedas the pathogen of tea trees. Leaves and stems of Longjing43 and Zhongcha108 were used in the experiment to analyze the pathogenicity of the two pathogens. The results show thathad strong pathogenicityto young leaves and stems of Longjing43, indicating it is the main pathogen causing relative disease.andmight infect tea leaves together which needs more attention in tea disease recognition, control and prevention in future.

morphological identification, molecular identification, tea branch,,pathogenicity

S571.1；S435.711

A

1000-369X(2019)06-661-08

2019-06-11

2019-07-07

國家重點研發(fā)計劃政府間國際科技創(chuàng)新合作重點專項（2017YFE0107500）、浙江省自然科學基金（LY19C160009）、中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程、國家自然科學基金（31600482）

張?zhí)m，女，碩士，助理研究員，主要從事茶栽培與生理生化研究，zhanglan@tricaas.com。