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        幾種茶多糖降血糖活性的研究

        2019-12-25 12:01:24劉丹奇任發(fā)政李景明侯彩云
        茶葉科學 2019年6期
        關鍵詞:降血糖紅茶胰島

        劉丹奇,任發(fā)政,,李景明,侯彩云,*

        幾種茶多糖降血糖活性的研究

        劉丹奇1,任發(fā)政1,2,李景明2,侯彩云1,2*

        1. 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心,中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院,北京 100083;2. 食品質(zhì)量安全北京實驗室,中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院,北京 100083

        研究和對比白茶多糖(White tea polysaccharide,WTP)、綠茶多糖(Green tea polysaccharide,GTP)和紅茶多糖(Black tea polysaccharide,BTP)的成分、降血糖效果及機理。分別選取壽眉、龍井、白琳工夫作為白茶、綠茶和紅茶的代表,測定分析茶多糖提取物的成分和分子量。以鏈脲佐菌素誘導小鼠糖尿病模型,二甲雙胍作為陽性對照,研究茶多糖降血糖效果,qPCR測定小鼠肝臟中相關基因表達水平。結(jié)果表明,所選白茶、綠茶和紅茶多糖的絕對重均分子量分別為18?180、19?470、8?745?Da。所選茶多糖提取物均具有降血糖功效,白茶、綠茶和紅茶多糖干預組小鼠的血糖下降率分別為53.2%、52.8%及61.6%。茶多糖均可改善小鼠葡萄糖耐量,調(diào)節(jié)糖代謝相關基因表達,并且存在一定差異。

        茶多糖;降血糖;糖代謝

        糖尿病是一種常見的非傳染性內(nèi)分泌代謝紊亂疾病,已成為當前影響人類健康的第三大疾病[1]。當前糖尿病常用治療藥物如磺酰脲類和雙胍類等,盡管療效好、見效快,但易帶來多種毒副作用[2],往往導致胰島素依賴。因此尋求日常食物中的輔助治療功能成分成為研究熱點。

        民間已有采用粗老茶治療糖尿病的記載。張陽春等[3]研究表明,茶多糖(Tea polysaccharide,TPS)可能是粗老茶治療糖尿病的主要藥理成分。Zhou等[4]對茶葉提取物、粗茶多糖和茶多糖的降血糖效果進行了研究,得出茶多糖是茶葉中主要降血糖因子的結(jié)論。茶多糖是茶葉中存在的一類具有多種生物活性的多糖復合物,多為與蛋白質(zhì)結(jié)合的酸性糖蛋白[5]。目前已有研究表明茶多糖具有降血糖[1]、抗氧化[6]、降血脂[7]、抗癌[8]、免疫調(diào)節(jié)[9]、抗疲勞[10]等多種生物功效。茶葉種類對茶多糖的降血糖活性會產(chǎn)生影響[11],但相關研究較少,且多集中于綠茶、紅茶、烏龍茶等茶類[12],白茶多糖缺少深入研究和對比。本研究選取壽眉白茶多糖作為研究對象,與龍井綠茶多糖、白琳工夫紅茶多糖的成分和降血糖效果進行研究和對比,并進一步探究其潛在作用機制。

        1 材料與方法

        1.1 材料、試劑與試驗動物

        白茶多糖提取物(White tea polysaccharide,WTP)、綠茶多糖提取物(Green tea polysaccharide,GTP)、紅茶多糖提取物(Black tea polysaccharide,BTP),定購于陜西楊凌慈緣生物技術有限公司,參照文獻[13]中的工藝進行提取。

        鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)、葡聚糖標準品(美國Sigma公司);鹽酸二甲雙胍片[中美(上海)施貴寶制藥有限公司];異丙醇、氯仿、無水乙醇等(分析純,北京化工廠有限責任公司);DEPC水、Trizol試劑(碧云天生物科技有限公司);5X All-In-One RT MasterMix試劑盒、EvaGreen 2X qPCR MasterMix-No Dye試劑盒(美國abm公司);引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]。

        SPF級雄性4周齡ICR小鼠[許可證號SCXK(京)2016-0002,北京斯貝福生物技術有限公司];45%脂肪供能高脂高糖飼料(北京華阜康生物科技股份有限公司)。小鼠于屏障環(huán)境動物房[溫度(22±2)℃,濕度(50±5)%,壓差20~50?Pa,12?h晝夜交替]進行試驗。

        1.2 儀器與設備

        Wyatt Technology DAWN EOS多角度激光光散射儀;Biometra T-personal梯度PCR儀;Roche lightcycler 96熒光定量PCR儀等。

        1.3 方法

        1.3.1 茶多糖提取物分子量的測定

        采用尺寸排阻色譜和多角度激光光散射儀聯(lián)用裝置(SEC-MALLS)測定樣品的絕對重均分子量。選用Shodex OHpak SB-806MHQ(8?mm×300?mm,13?μm)色譜柱,示差折光檢測器檢測。多角度激光光散射儀波長為658.0?nm,柱溫25℃,流動相為0.1?mol·L-1氯化鈉+疊氮化鈉的水溶液,洗脫流速為0.5?mL·min-1,進樣量200?μL,樣品溶液濃度1?mg·mL-1,用0.2?μm濾膜過濾。用Mn=40?000?Da的葡聚糖標準品作為對照。

        1.3.2 茶多糖提取物的理化成分測定

        分別采用苯酚-硫酸比色法[14]測定茶多糖含量,考馬斯亮藍試劑盒法測定蛋白質(zhì)含量,福林酚法[15]測定茶多酚含量。

        1.3.3 動物試驗

        小鼠置于屏障環(huán)境動物房適應性喂養(yǎng)7?d后,隨機選取10只作為正常對照組(NC)喂養(yǎng)小鼠維持飼料,其余小鼠換為45%高脂高糖飼料,連續(xù)喂養(yǎng)4周后,隔夜禁食12?h,使粉末狀STZ溶解于pH為4.2~4.5的檸檬酸鹽緩沖液,小鼠腹腔注射STZ溶液110?mg·kg-1,1周后測定血糖,空腹血糖(Fasting blood glucose,F(xiàn)BG)≥11.1?mmol·L-1視為造模成功[16]。將造模成功的小鼠按照FBG隨機分組:模型對照組(MC)、陽性對照組(PC)、WTP干預組、GTP干預組和BTP干預組,每組10只小鼠。

        茶多糖干預組參照已有研究[12],制定小鼠每日灌胃劑量為300?mg·kg-1。PC組選用藥物鹽酸二甲雙胍,根據(jù)成年人的每日最大劑量(1.0~1.5?g),換算成小鼠每日用藥劑量為:250?mg·kg-1[17]。各干預組灌胃時間均為4周。

        1.3.4 葡萄糖耐量試驗

        4周干預結(jié)束前,將所有小鼠隔夜禁食不禁水15?h,取尾尖血測定FBG,作為0時血糖。之后對每只小鼠灌胃葡萄糖1.5?g·kg-1,記錄灌胃后30、60、90、120?min血糖,并繪制時刻-血糖折線圖[18],按照以下公式計算折線圖的曲線下面積(Area under the curve,AUC)。

        AUC/mmol·h-1·L-1=(/2++++/2)/2

        式中,、、、、分別表示0、30、60、90、120?min時刻的血糖值。

        1.3.5 生化指標檢測

        4周干預結(jié)束后,將所有小鼠禁食12?h,采血后處死。將血樣在4℃,4?000?r·min-1離心15?min,分離血清樣本,按照試劑盒說明書方法測定血清中胰島素含量(Fasting insulin,F(xiàn)IS)。

        1.3.6 胰腺組織病理學分析

        小鼠斷頸處死后剖取胰腺組織,置于4%多聚甲醛固定液固定48?h,常規(guī)取材,脫水,石蠟包埋,制片(4?μm厚),HE染色,光學顯微鏡觀察胰腺組織的病理學變化,并于200倍視野拍照。

        1.3.7 實時熒光定量PCR檢測

        測定基因:叉頭轉(zhuǎn)錄因子(Forkhead boxo1,F(xiàn)oxo1)、葡萄糖-6-磷酸酶(Glucose-6-phosphatase,G6Pc)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)和硫氧還蛋白互作蛋白(Thioredoxin interacting protein,TXNIP),引物序列如表1所示。

        1.4 數(shù)據(jù)處理

        2 結(jié)果與分析

        2.1 茶多糖提取物的分子量測定結(jié)果

        先采用1.3.1所述方法對葡聚糖標準品進行測定,確定方法的精確度后對3種樣品進行測定,結(jié)果如圖1所示。

        圖譜表明,TPS均含有雜峰,且峰形較寬,不具有單一對稱的峰形,三者均為不均一的雜多糖。根據(jù)測定方法換算出WTP、GTP及BTP的絕對重均分子量分別為18?180?Da、19?470?Da及8?745?Da。三者分子量的差異推測與原料種類有關。綠茶在殺青工序時就已經(jīng)使酶失活了,白茶和紅茶經(jīng)過了不同程度的氧化,利用了各種氧化酶、水解酶的作用,使得糖鏈和肽鏈都相對較短[11],可能使重均分子量減小。

        表1 引物序列

        2.2 茶多糖提取物的主要成分

        由表2可見,3種茶多糖提取物的主要成分含量均無顯著差異。

        2.3 茶多糖提取物降血糖作用的相關測定結(jié)果

        2.3.1 對糖尿病小鼠體重、始末血糖及胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)的影響

        造模成功后的小鼠均出現(xiàn)糖尿病典型的多尿、多飲、多食、體重減輕癥狀[20]。胰島素抵抗作為糖尿病的發(fā)病基礎,表現(xiàn)為胰島素作用的靶器官對胰島素的敏感性下降,機體代償性分泌過多胰島素產(chǎn)生高胰島素血癥的狀態(tài)[21]。改善小鼠的胰島素抵抗水平可有效提高胰島素敏感性,從而改善高胰島素血癥。衡量的指標之一為胰島素抵抗指數(shù),計算公式參照文獻[22]:HOMA-IR=FBG×FIS/22.5。對小鼠體重變化、始末血糖及HOMA-IR的測定結(jié)果如圖2所示。

        圖1 茶多糖提取物的分子量測定結(jié)果

        表2 茶多糖提取物的主要成分

        注:表格每列字母不同表示差異顯著,<0.05,字母相同表示差異不顯著,

        Note: The difference in the letter in each column of the table indicates that the difference is significant,<0.05, and the same letter indicates that the difference is not significant

        由圖2-A可見,NC組體重較穩(wěn)定,MC及PC組波動幅度較大,整體呈下降趨勢。多糖干預組整體體重在第3、4周趨于平緩。為明顯區(qū)分組間差異,以造模成功后的第1周體重為起始體重,計算各組的體重增長百分比,如圖2-B所示。MC組呈現(xiàn)負增長,推測與糖尿病模型誘導有關。TPS組的體重增長百分比均顯著高于MC組(<0.05),PC組極顯著高于MC組(<0.01),表明它們都有利于緩解糖尿病造成的體重下降情況。

        由圖2-C可知,小鼠在造模成功后測定初始FBG,各組間無顯著差異(>0.05)。經(jīng)4周喂養(yǎng)后,MC組FBG有所升高,但并未達到顯著水平(>0.05),藥物和多糖干預組FBG均降低,PC組、WTP組、GTP組和BTP組的血糖下降率分別為53.2%、53.2%、52.8%、61.6%。由此可知WTP組降血糖效果和PC組相當,遜于BTP組,略優(yōu)于GTP組。

        由圖2-D可見,小鼠造模成功后的IR值明顯增加,其中MC組極顯著高于NC組(<0.01)。藥物組及多糖干預組極顯著低于MC組(<0.01),均有很好的緩解胰島素抵抗效果,其中BTP組效果最優(yōu),WTP組效果略遜于GTP組和BTP組,但未達到顯著差異水平(>0.05)。

        注:(A)體重;(B)體重增長比;(C)始末血糖;(D)胰島素抵抗指數(shù);*表示與正常組相比,P<0.05,**表示P<0.01;#表示與模型組相比,P<0.05,##表示P<0.01

        2.3.2 茶多糖提取物對糖尿病小鼠葡萄糖耐量的影響

        口服葡萄糖耐量試驗(Oral glucose tolerance test,OGTT)作為一種用以了解胰島細胞功能和機體對血糖調(diào)節(jié)能力的葡萄糖負荷試驗,具有衡量降血糖效果的意義[23]。小鼠在4周喂養(yǎng)結(jié)束后進行該試驗,記錄小鼠2?h內(nèi)血糖變化如圖3-A所示。NC組小鼠血糖在120?min時恢復正常,MC組血糖下降較為緩慢,表現(xiàn)出明顯的葡萄糖不耐受。為區(qū)分其他干預組的組間差異,對曲線AUC進行計算,結(jié)果如圖3-B所示。GTP組AUC顯著低于MC組(<0.05),顯示出較好的改善小鼠葡萄糖耐量的效果;PC組、WTP組和BTP組AUC則極顯著低于MC組(<0.01),三者之間無顯著差異(>0.05),其中BTP效果最優(yōu),PC組次之,WTP組略遜于PC組,GTP組最差。

        2.3.3 小鼠胰腺組織的病理學分析

        小鼠胰腺組織HE染色結(jié)果如圖4所示。NC組小鼠胰島形狀規(guī)則,胰島細胞分布均勻,腺泡細胞形態(tài)正常,組織未發(fā)生病變。MC組小鼠胰島形狀不規(guī)則,腺泡大量消失,并伴有組織增生,可見較多絲網(wǎng)狀物質(zhì),整體表明MC組胰島損傷嚴重,有脂肪變性征兆。PC組胰島形狀不規(guī)則,大量胰島細胞胞質(zhì)疏松或呈空泡狀,局部胰島附近可見淋巴細胞浸潤,整體表明小鼠胰島細胞損傷較嚴重,可見二甲雙胍藥物對改善小鼠胰腺組織病變的效果并不明顯。

        注:(A)2?h內(nèi)血糖變化;(B)血糖曲線下面積。*表示與正常組相比,P<0.05,**表示P<0.01;#表示與模型組相比,P<0.05,##表示P<0.01

        圖4 小鼠胰腺組織病理學分析

        組小鼠局部導管周圍結(jié)締組織中可見少量炎性細胞浸潤;BTP組小鼠一處胰島周圍少量炎性細胞灶性浸潤,未見其他明顯異常。整體表明,試驗所選茶多糖提取物均能改善小鼠胰腺組織的病理狀態(tài),但未能使其恢復正常,組間差異也并不明顯。多糖干預組在改善小鼠胰腺組織病變方面明顯優(yōu)于二甲雙胍藥物組。

        2.3.4 茶多糖提取物對糖尿病小鼠肝組織相關基因表達的影響

        為探究茶多糖提取物的潛在降血糖機理,對小鼠肝臟中有關基因的相對表達量進行定量測定,結(jié)果如圖5所示。

        基因是胰島細胞的一種關鍵調(diào)控因子,對其增殖存在抑制作用[24],進而導致胰島素分泌減少,使血糖升高。由圖5-A可知,MC組的基因相對表達量極顯著高于NC組(<0.01),干預組與MC組相比均極顯著下調(diào)了基因相對表達量(<0.01),其中BTP組效果最優(yōu)。由此可見,茶多糖能夠通過下調(diào)基因的相對表達量這一途徑降低小鼠高血糖水平。

        注:(A)叉頭轉(zhuǎn)錄因子基因;(B)葡萄糖-6-磷酸酶基因;(C)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因;(D)硫氧還蛋白互作蛋白基因。*表示與正常組相比,P<0.05,**表示P<0.01;#表示與模型組相比,P<0.05,##表示P<0.01

        基因和基因均為糖異生途徑調(diào)控基因,在肝臟中表達量的增加會促進非糖物質(zhì)轉(zhuǎn)化為葡萄糖,進而轉(zhuǎn)運至血管中提高血糖水平[25]。由圖5-B和圖5-C可知,MC組的兩種基因相對表達量均極顯著高于NC組(<0.01),藥物和多糖干預組與MC組相比均能夠極顯著下調(diào)兩種基因的相對表達量(<0.01),但各組之間無顯著差異(>0.05)。其中,BTP組效果最優(yōu)。這表明茶多糖能夠通過抑制糖異生途徑關鍵基因表達降低小鼠血糖水平。

        基因是一種細胞炎癥因子,其表達量的增加會促進胰島細胞的凋亡[26]。由圖5-D可知,MC組的相對表達量極顯著高于NC組(<0.01),與MC組相比,藥物與多糖干預組均能極顯著下調(diào)基因相對表達量(<0.01)。多糖組效果均明顯弱于PC組,其中WTP組在多糖干預組中效果最優(yōu),表明白茶茶多糖在消除炎癥因子,保護胰島細胞方面具有優(yōu)勢。

        3 結(jié)論

        本文選取的茶多糖提取物均具有改善小鼠糖尿病癥狀的作用,降血糖效果存在差異。其中紅茶多糖在降低小鼠空腹血糖水平、降低胰島素抵抗指數(shù)、改善葡萄糖耐量等方面具有優(yōu)勢;白茶多糖在改善小鼠體重減輕情況等方面具有優(yōu)勢。

        試驗所選茶多糖提取物均可下調(diào)和基因的表達量,抑制葡萄糖的生成,進而降低血糖;同時,茶多糖均可下調(diào)基因的表達,減弱對胰島細胞的抑制,從而改善糖尿病癥狀,其中紅茶多糖效果最優(yōu)。此外,茶多糖對細胞炎癥分子基因的表達也有抑制作用,緩解胰島細胞的凋亡,其中白茶多糖效果最優(yōu)。整體表明,茶多糖可通過調(diào)控糖代謝途徑和調(diào)控胰島細胞途徑發(fā)揮降血糖活性。

        茶多糖的分子量范圍、單糖組成、糖鏈結(jié)構(gòu)等均為影響其生物活性的因素[27]。原料來源、提取方法等都會對茶多糖的基礎理化結(jié)構(gòu)造成影響,進而影響生物活性。本試驗選取的茶多糖提取物降血糖效果整體規(guī)律與茶葉氧化程度較為一致(紅茶>白茶>綠茶),分子量由大到小分別為綠茶多糖、白茶多糖和紅茶多糖。推測茶葉原料的發(fā)酵氧化可能使得糖鏈縮短,導致茶多糖提取物重均分子量的降低,進而提高了茶多糖提取物的降血糖活性。茶多糖在不同生化指標和基因表達調(diào)節(jié)中呈現(xiàn)的不同優(yōu)勢為針對性選擇降血糖的物質(zhì)提供了參考。

        茶多糖的降血糖活性會受到很多因素影響,降糖作用途徑較多,靶點也不止一處[25],劑量、純度、結(jié)構(gòu)、吸收方式等因素對其降血糖活性的影響以及茶多糖的其他作用途徑和降糖靶點有待進一步研究。

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        Comparative Study on the Structure and Hypoglycemic Activity of Several Tea Polysaccharides

        LIU Danqi1, REN Fazheng1,2, LI Jingming2, HOU Caiyun1,2*

        1. Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health, College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China; 2. Beijing Laboratory for Food Quality and Safety, College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China

        To study and compare the composition, blood sugar lowering effect and composition of WTP, GTP and BTP. Shoumei, Longjing and Bailingongfu were selected as representatives of white tea, green tea and black tea, and the composition, molecular weight of tea polysaccharides were determined. The mice diabetes model was induced by streptozotocin, metformin was used as a positive control to study the hypoglycemic effect of tea polysaccharides, and qPCR was used to determine the expression level of related genes in mice liver. The results showed thatthe molecular weights of WTP, GTP and BTP are 18?180?Da, 19?470?Da and 8?745?Da, respectively. The selected tea polysaccharides have hypoglycemic effect, the fasting blood glucose decline rates of WTP, GTP and BTP were 53.2%, 52.8% and 61.6%, respectively. Tea polysaccharides can all improve glucose tolerance, down-regulate the expression of,,andgenes in mice and there are some differences.

        tea polysaccharides, hypoglycemic, sugar metabolism

        TS201.4

        A

        1000-369X(2019)06-652-09

        2019-03-11

        2019-06-12

        北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心開放基金項目

        劉丹奇,女,碩士,主要從事茶葉功能性成分評價方面的研究,951442196@qq.com。

        food319@139.com

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