陳林波，夏麗飛，劉悅，孫云南，蔣會(huì)兵，田易萍，陳亮

基于高通量測(cè)序篩選‘紫娟’花青素合成相關(guān)的miRNA

陳林波1,2，夏麗飛1，劉悅1，孫云南1，蔣會(huì)兵1，田易萍1，陳亮2*

1. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所/云南省茶樹(shù)種質(zhì)資源創(chuàng)新與配套栽培技術(shù)工程研究中心/云南省茶學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 勐海 666201；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，浙江 杭州 310008

為篩選調(diào)控紫娟茶樹(shù)花青素合成相關(guān)miRNA，以茶樹(shù)品種紫娟（ZJ）、云抗10號(hào)（YK）和福鼎大白茶（FD）為材料，構(gòu)建了miRNA文庫(kù)。鑒定出46種已知的miRNAs和67種新的miRNAs，預(yù)測(cè)到具有注釋的靶基因765個(gè)。通過(guò)差異表達(dá)分析，篩選出在ZJ與YK、ZJ與FD共有差異表達(dá)的miRNA 24個(gè)。通過(guò)對(duì)24個(gè)差異表達(dá)miRNA的靶基因分析，篩選出可能參與調(diào)控花青素合成的miRNA 4個(gè)，包括miR828a、miR845c、novel_14和novel_87，其預(yù)測(cè)的靶基因包括轉(zhuǎn)錄因子基因、、、、以及4-香豆酰輔酶A鏈接酶（）、二氫黃酮醇4-還原酶（）和UDP-葡萄糖黃酮3--葡糖基轉(zhuǎn)移酶（）等基因。利用RT-PCR分析8個(gè)差異表達(dá)的miRNA，其結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組分析一致。本研究結(jié)果為進(jìn)一步開(kāi)展茶樹(shù)花青素生物合成的調(diào)控機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

茶樹(shù)；花青素合成；高通量測(cè)序；miRNA；靶基因

MicroRNA又稱miRNA，是廣泛存在于生物體內(nèi)的一種長(zhǎng)度約21~25個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源非編碼小分子RNA[1]。miRNA通過(guò)與靶mRNA互補(bǔ)配對(duì)來(lái)識(shí)別靶基因mRNA，在轉(zhuǎn)錄水平上降解靶mRNA或抑制靶mRNA的翻譯，從而調(diào)節(jié)靶mRNA的豐度和功能[2]。研究表明，miRNA對(duì)于植物花青素的生物合成具有一定的調(diào)控作用。在擬南芥中，miR156通過(guò)靶向SPL轉(zhuǎn)錄因子對(duì)花青素的生物合成起著負(fù)調(diào)控作用[3-4]；miR828通過(guò)介導(dǎo)調(diào)控靶基因，在缺磷條件下對(duì)、和的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而影響花青素的積累[5]。過(guò)量表達(dá)miR778的擬南芥在缺磷條件下會(huì)促進(jìn)花青素的積累[6]。在番茄中，miR858可通過(guò)靶向R2R3 MYB轉(zhuǎn)錄因子參與花青素合成的調(diào)控[7]。

目前關(guān)于茶樹(shù)花青素代謝的研究主要集中在關(guān)鍵酶和轉(zhuǎn)錄因子方面，例如MYB[8]、bHLH[9]、花青素合成酶[10-11]。然而，有關(guān)茶樹(shù)中miRNA介導(dǎo)的茶樹(shù)花青素生物合成的調(diào)節(jié)機(jī)制研究較少。紫娟是一種特異的茶樹(shù)品種，其幼嫩新梢芽、葉、莖均為紫色，富含花青素?；ㄇ嗨厥亲暇瓴铇?shù)葉片呈現(xiàn)紫色的特征成分，是區(qū)別于其他茶樹(shù)的主要生化物質(zhì)，也是決定紫娟茶健康功效的主要成分[12-13]。此外，紫娟茶還是提取天然花青素的重要來(lái)源物[14-15]。因此，我們利用Illumina HiSeq 2500測(cè)序平臺(tái)和生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)紫葉茶樹(shù)和綠葉茶樹(shù)中的花青素代謝相關(guān)的miRNA以及靶基因進(jìn)行比較分析，為進(jìn)一步研究miRNA對(duì)茶樹(shù)花青素合成的調(diào)控機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

分別采摘云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所品種園內(nèi)樹(shù)齡均為10年的紫葉茶樹(shù)品種紫娟（ZJ）、綠葉茶樹(shù)品種云抗10號(hào)（YK）和福鼎大白茶（FD）的一芽二葉，其中紫娟和云抗10號(hào)為阿薩姆茶（var.），福鼎大白茶為茶種（var.），液氮速凍后置于–80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA的提取與質(zhì)量評(píng)估

RNA的提取采用美國(guó)Invitrogen公司的Trizol試劑盒，分別提取ZJ、YK、FD的總RNA，采用1%的瓊脂糖凝膠電泳分析RNA降解程度以及是否有污染，利用Nanodrop 2000微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的純度，利用Qubit 4.0（美國(guó)）熒光定量?jī)x對(duì)RNA濃度進(jìn)行定量，利用Agilent 2100精確檢測(cè)RNA的完整性。

1.2.2 sRNA文庫(kù)的構(gòu)建和測(cè)序

利用Small RNA Sample Pre Kit分別構(gòu)建ZJ、YK、FD小RNA的cDNA文庫(kù)。采用Qubit 4.0熒光定量?jī)x進(jìn)行初步定量，使文庫(kù)濃度為1?ng·μL-1，再利用Agilent 2100對(duì)文庫(kù)的質(zhì)量和Insert size進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)序與分析由北京諾禾致源生物有限公司完成。

1.2.3 sRNA測(cè)序數(shù)據(jù)分析

高通量測(cè)序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)堿基識(shí)別（Base calling）分析轉(zhuǎn)化為Raw reads。再將Raw reads帶接頭、低質(zhì)量的reads進(jìn)行處理，得到Clean reads。篩選長(zhǎng)度范圍為18~30?nt的sRNA進(jìn)行分析。用bowtie將長(zhǎng)度為18~30?nt的sRNA定位到參考序列上，分析small RNA在參考序列上的分布情況。將mapped sRNA與miRBase中指定范圍序列進(jìn)行比對(duì)，得到各樣品匹配上的sRNA詳細(xì)情況。選取Rfam中的rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA來(lái)注釋測(cè)序所得的小RNA。通過(guò)檢索miRBase21.0數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.mirbase.org）來(lái)確定已知的miRNA，采用miRNA前體的標(biāo)志性發(fā)夾結(jié)構(gòu)來(lái)預(yù)測(cè)新的miRNA[16-17]。

1.2.4 茶樹(shù)miRNA靶基因預(yù)測(cè)與功能分析

分析得到的已知miRNA和新的miRNA，利用psRobot軟件[18]對(duì)前期獲得的ZJ、YK和FD的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[19]進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，根據(jù)miRNA與其靶基因間的對(duì)應(yīng)關(guān)系獲得miRNA靶基因。靶基因通過(guò)在線網(wǎng)站（http://www.geneontology.org）進(jìn)行Gene ontology分析和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genome.jp）進(jìn)行Pathway顯著性富集分析。

1.2.5 茶樹(shù)葉色相關(guān)miRNA篩選

對(duì)3個(gè)樣本中已知的和新的miRNA進(jìn)行表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)，采用TPM對(duì)miRNA表達(dá)水平的readcount數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，再用DEGseq[20]進(jìn)行差異分析。差異miRNA篩選條件為：qvalue<0.01 & |log2(foldchange)|>1。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)

表1 實(shí)時(shí)定量PCR所使用引物

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹(shù)葉片總RNA的提取

采用Trizol試劑方法提取ZJ、YK和FD中的總RNA，經(jīng)凝膠電泳（圖1）和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，其總RNA濃度分別為709、482、559?ng·μL-1，OD260/OD230值分別為2.05、2.00和1.90，OD260/OD280值分別為2.12、2.11、2.11，28?S和18?S條帶亮度等均符合轉(zhuǎn)錄組分析的要求。

2.2 茶樹(shù)葉片miRNA測(cè)序分析

利用高通量Illumina測(cè)序技術(shù)分別對(duì)ZJ、YK和FD的cDNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)去除接頭、低質(zhì)量reads、polyA/T/G/C以及N，分別獲得12?361?695（98.16%）、13?930?750（98.20%）、13?528?588（98.37%）條clean reads。篩選長(zhǎng)度在18~30?nt范圍的sRNA分別有10?702?304（54.58%）、12?061?820（54.34%）、11?202?955（43.15%）條clean reads（表2）。

3個(gè)文庫(kù)中sRNA主要分布在21~24?nt范圍內(nèi)，其中24?nt的最多（圖2），這些sRNA分布情況與其他報(bào)道的結(jié)果一致[22-23]。再利用bowtie將篩選后的sRNA定位到參考序列上，分析small RNA在參考序列上的分布情況。ZJ、YK和FD的clean reads中能mapped到參考序列的分別有5?774?584、6?835?843、6?278?768條。將mapped的sRNA通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）和Rfam數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋。被注釋到的非編碼RNAs，包括已知miRNA、新miRNA、rRNAs、tRNAs、snRNAs、snoRNAs、TAS基因等（表3）。

注：M為DL5000 DNA Marker；1為紫娟；2為云抗10號(hào)；3為福鼎大白茶

表2 3個(gè)miRNA文庫(kù)測(cè)序數(shù)據(jù)

表3 被注釋到的各種miRNA數(shù)

注：ZJ：紫鵑，YK：云抗10號(hào)，F(xiàn)D：福鼎大白茶。下同

Note: ZJ: Zijuan. YK: Yunkang10. FD: Fuding dabaicha. The same as follow

2.3 茶樹(shù)已知miRNA的鑒定

為了鑒定茶樹(shù)已知miRNA，將3個(gè)文庫(kù)中mapped到參考序列上的reads利用miRBase 21.0數(shù)據(jù)庫(kù)中葡萄（）的miRNA數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，共鑒定出46條已知miRNA，分為26個(gè)家族，其中miR171、miR172和miR399分別有4個(gè)成員，miR167和miR319分別有3個(gè)成員，miR156、miR160、miR169、miR394、miR396和miR398分別有2個(gè)成員，其他均為1個(gè)成員。獲得已知的miRNA的長(zhǎng)度為19~23?nt，其中大多數(shù)miRNA的長(zhǎng)度為21?nt（表4）。

圖2 miRNA的長(zhǎng)度分布

表4 已知的miRNA家族成員

續(xù)表4

2.4 茶樹(shù)新miRNA的預(yù)測(cè)

由于茶樹(shù)缺乏RNA背景，只能將獨(dú)特的小RNA序列映射到茶樹(shù)轉(zhuǎn)錄識(shí)別潛在的新miRNA序列。利用miRNA前體的標(biāo)志性發(fā)夾結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)新的miRNA[16-17]。通過(guò)BLASTn進(jìn)行搜索和發(fā)夾結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，共發(fā)現(xiàn)了新的成熟miRNAs 67條。這些新miRNA序列長(zhǎng)度為19~25?nt（表5），其中24?nt最多，占所有新預(yù)測(cè)miRNA的52.24%。這些沒(méi)有被歸類到已知miRNA家族的新miRNA，可能是茶樹(shù)miRNA新家族成員。

2.5 茶樹(shù)葉片miRNA靶基因預(yù)測(cè)

為了研究miRNAs對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用，利用ZJ、YK和FD的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為參考[19]，采用psRobot軟件[18]對(duì)分析得到的已知miRNA和新miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。113個(gè)miRNA共預(yù)測(cè)到2?200個(gè)基因，其中765個(gè)基因具有注釋。這些被注釋到的基因包括、、、、、和等轉(zhuǎn)錄因子家族。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單個(gè)miRNA可同時(shí)調(diào)節(jié)多個(gè)靶基因，而單靶基因也可由多個(gè)miRNA調(diào)節(jié)，說(shuō)明茶樹(shù)中miRNA具有多重靶向性。這些預(yù)測(cè)到的miRNA靶基因的準(zhǔn)確性需要在未來(lái)的研究中進(jìn)行驗(yàn)證。

2.6 差異miRNA的篩選

通過(guò)高通量測(cè)序產(chǎn)生的序列可通過(guò)在文庫(kù)中的讀取數(shù)來(lái)計(jì)算miRNA的豐度。ZJ、YK和FD中已知和新miRNA的讀取數(shù)通過(guò)TPM進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，采用DEGseq進(jìn)行差異分析[21]，差異miRNA篩選條件為|log2(foldchange)|>1和qvalue<0.01。篩選出在ZJ與YK、ZJ與FD之間共有的差異表達(dá)miRNA 24個(gè)（表6），在ZJ中上調(diào)表達(dá)的miRNA有13個(gè)，包括已知miRNA（miR845c、miR828a、miR482、miR399e、miR398a、miR398b、miR169a和miR162）和新miRNA（novel_93、novel_108、novel_36和novel_35）；在ZJ中下調(diào)表達(dá)的miRNA有9個(gè)，均為新miRNA（novel_87、novel_86、novel_84、novel_80、novel_46、novel_42、novel_37、novel_18和novel_14）。

2.7 差異miRNA靶基因分析

對(duì)獲得的24個(gè)差異miRNA的靶基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)具有注釋的靶基因227個(gè)，其中可能參與花青素合成調(diào)控相關(guān)的靶基因包括轉(zhuǎn)錄因子基因、、、和，參與花青素合成相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因包括4-香豆酰輔酶A鏈接酶5（）、UDP-葡萄糖黃酮3--葡糖基轉(zhuǎn)移酶3（）和UDP-葡萄糖黃酮3--葡糖基轉(zhuǎn)移酶6（）等（表7）。因此，推測(cè)在紫娟茶樹(shù)中差異表達(dá)的miR828a、miR845c、novel_14和novel_87可能參與花青素生物合成的調(diào)控，其成熟miRNA見(jiàn)圖3。這些預(yù)測(cè)到的參與花青素合成調(diào)控相關(guān)的miRNA需要在未來(lái)的研究中進(jìn)行驗(yàn)證。

表5 新的miRNA

表6 差異表達(dá)的miRNA

表7 miRNA部分靶基因

2.8 miRNA的qRT-PCR驗(yàn)證

隨機(jī)選取8個(gè)miRNA，利用qRT-PCR檢測(cè)其在ZJ、YK、FD等茶樹(shù)葉片中的表達(dá)情況（圖4）。發(fā)現(xiàn)miR398a、miR398b、miR399e、miR828a在ZJ中的表達(dá)量高于YK和FD，novel_87、novel_84、novel_37和novel_14在ZJ中的表達(dá)量均低于YK和FD。8個(gè)差異表達(dá)miRNA在ZJ、YK和FD的相對(duì)表達(dá)量與測(cè)序分析的變化趨勢(shì)一致，說(shuō)明高通量測(cè)序技術(shù)分析結(jié)果可靠。

3 討論

隨著對(duì)植物中miRNA研究的不斷深入，它已被證實(shí)廣泛作用于植物的生長(zhǎng)發(fā)育[24-26]、次生代謝[27-29]、器官形態(tài)建成[30]等過(guò)程。近年來(lái)人們發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄后水平上miRNA對(duì)植物花青素合成具有不可替代的調(diào)控作用[3,5,31]。為了研究miRNA對(duì)茶樹(shù)花青素合成的調(diào)控機(jī)制，本研究構(gòu)建了紫娟（ZJ）、云抗10號(hào)（YK）、福鼎大白茶（FD）的miRNA文庫(kù)并進(jìn)行測(cè)序，分別獲得12?361?695、13?930?750、13?528?588條clean reads。miRNA讀數(shù)主要是21~24?nt，這與大多數(shù)被子植物中相應(yīng)的讀數(shù)相似；以24?nt的數(shù)量最多，與煙草[32]、蘆筍[22]、杜仲[33]等作物一樣。

圖3 關(guān)鍵miRNA的前體莖環(huán)結(jié)構(gòu)

圖4 miRNA表達(dá)的qRT-PCR分析

在本研究獲得的miRNA以及篩選在紫葉與綠葉茶樹(shù)差異表達(dá)的miRNA中，新預(yù)測(cè)的miRNA數(shù)量均遠(yuǎn)高于已知miRNAs，表明本研究中新發(fā)現(xiàn)的miRNAs對(duì)紫娟茶樹(shù)葉片呈色和花青素合成貢獻(xiàn)較大。在擬南芥中miR828介導(dǎo)調(diào)控的靶基因與花青素合成有關(guān)，miR828能夠誘發(fā)轉(zhuǎn)錄本的剪切，進(jìn)而調(diào)控下游靶基因、和轉(zhuǎn)錄因子以調(diào)控花青素的合成[31]。本研究預(yù)測(cè)到miR828的靶向基因?yàn)?、、。在擬南芥中超表達(dá)miR828能阻礙轉(zhuǎn)錄因子[31]，推測(cè)參與了花青素的合成。本研究中還發(fā)現(xiàn)了新的novel_87靶向UDP-葡萄糖黃酮3--葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因（）、4-香豆酰CoA連接酶基因（）和轉(zhuǎn)錄因子基因，novel_14靶向二氫黃酮醇4-還原酶基因（）。本課題組前期研究紫葉茶樹(shù)和綠葉茶樹(shù)葉片轉(zhuǎn)錄組差異，篩選花青素合成相關(guān)基因時(shí)，發(fā)現(xiàn)了4-香豆酰CoA連接酶（）、二氫黃酮醇4-還原酶（）、類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶（）在紫葉茶樹(shù)葉片中為上調(diào)表達(dá)[19]，這與本研究獲得的miRNA存在相反的表達(dá)模式。推測(cè)新預(yù)測(cè)的novel_87和novel_14可能參與了紫娟茶樹(shù)葉片呈色和花青素合成的調(diào)控。此外，預(yù)測(cè)到miR845c靶向和，MYB是重要的一類轉(zhuǎn)錄因子，可以直接或與bHLH和WD形成MYB-bHLH-WD復(fù)合物參與花青素合成[8-9]。在本研究中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)miR858[5]，這可能是由于不同植物具有不同調(diào)控機(jī)制所導(dǎo)致。因此，本研究獲得的miRNA中一部分參與調(diào)控茶樹(shù)花青素的合成，但對(duì)于那些功能未知的miRNA與茶樹(shù)花青素合成的關(guān)系仍需進(jìn)一步研究證實(shí)和確定。

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Screening of miRNA Related to Anthocyanin Synthesis in Tea Cultivar ‘Zijuan’ Based on High Throughput Sequencing

CHEN Linbo1,2, XIA Lifei1, LIU Yue1, SUN Yunnan1, JIANG Huibing1,TIAN Yiping1, CHEN Liang2*

1. Tea Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences/Yunnan Engineering Research Centerof Tea Germplasm Innovation and Matching Cultivation /Yunnan Provincial Key Laboratory of Tea Science, Menghai 666201, China; 2. Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China

In order to screen the miRNAs related to anthocyanin synthesis in 'Zijuan', the miRNA library was constructed by using the tea cultivars 'Zijuan' (ZJ), 'Yunkang 10' (YK) and 'Fuding Dabaicha' (FD). In this study, 46 known miRNAs and 67 unknown miRNAs were identified, and 765 annotated target genes were predicted. A total of 24 miRNAs were screened out, which were differentially expressed between ZJ and YK, and between ZJ and FD. Four target miRNAs involved in the regulation of anthocyanin synthesis, namely miR828a, miR845c, novel_14 and novel_87, were identified by target gene analysis of 24 differentially expressed miRNAs. The predicted target genes include transcription factor genes,,,,and(4-coincyl-CoA-linked enzyme),(dihydroflavonol 4-reductase) and(UDP-glucoside flavonoid 3--glucosyltransferase). Eight differentially expressed miRNAs were analyzed by RT-PCR and the results were consistent with transcriptome analysis. Finally, a theoretical basis for further study of regulation mechanisms related to anthocyanin biosynthesis in tea plant was provided.

, anthocyanin synthesis, high throughput sequencing, microRNAs, target genes

S571.1；Q52

A

1000-369X(2019)06-681-11

2019-03-04

2019-05-25

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.31560220）、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2016YFD0200903）、國(guó)家茶葉額產(chǎn)業(yè)體系（CARS-19）、云南省人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目（2015HB105）

陳林波，男，研究員，主要從事茶樹(shù)資源育種研究。

liangchen@mail.tricaas.com