蔡清紅 馬松炎 鐘俊鋒

廣東省惠州市第三人民醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東惠州 516000

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）是指一類病因不明的特發(fā)性慢性腸道炎癥性疾病，多累及回腸、結(jié)直腸部位，主要包括兩個(gè)獨(dú)立的疾?。簼冃越Y(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）、克羅恩病（Crohn disease，CD）[1]。該病主要臨床特征包括腹痛、腹瀉、黏液血便等[2]。近年來，我國IBD 發(fā)病率呈不斷上升趨勢，且易反復(fù)性發(fā)作，對患者生活及工作造成嚴(yán)重不良影響[3]。據(jù)報(bào)道，該病可由疲勞、飲食失衡以及精神刺激和免疫異常等因素誘發(fā)，但多數(shù)患者為受到免疫異常影響而發(fā)病，患者主要表現(xiàn)出炎性細(xì)胞浸潤類型黏膜炎癥，并且有多種趨化因子以及其受體共同參與該病發(fā)展[4-5]。因此，深入探討IBD 發(fā)病機(jī)制，并尋找出和該病發(fā)病存在密切聯(lián)系的標(biāo)志物，進(jìn)而為其治療提供可靠新靶點(diǎn)，以提高臨床IBD 治療效果，是當(dāng)前研究工作的重點(diǎn)。有學(xué)者指出[6-7]，CXC 趨化因子受體1（CXC chemokine receptor1，CXCR1）和白細(xì)胞介素-17（interleukin-17，IL-17）均參與IBD 發(fā)病，其中CXCR1屬于促炎多肽性細(xì)胞因子有關(guān)超家族的成員之一，其通常由造血微環(huán)境所含的基質(zhì)細(xì)胞所分泌，能夠激活及趨化機(jī)體內(nèi)白細(xì)胞的移動(dòng)。而IL-17 主要由Th17細(xì)胞所分泌，可以激活和募集中性粒細(xì)胞不斷聚集在炎癥區(qū)域，同時(shí)引起或擴(kuò)大機(jī)體的炎性反應(yīng)。二者在IBD 中的具體表達(dá)作用仍需進(jìn)一步分析。本研究通過分析CXCR1 和IL-17 在炎癥性腸病患者中的表達(dá)及其意義，旨在為臨床更好地治療IBD 提供數(shù)據(jù)支持，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

2016 年1 月～2017 年12 月惠州市第三人民醫(yī)院（以下簡稱“我院”）收治的80 例IBD 患者進(jìn)行回顧性分析。入選標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者的診斷均符合中華醫(yī)學(xué)會消化病學(xué)分會炎癥性腸病學(xué)組在2012 年時(shí)制定的IBD 診斷及治療共識意見[8]；②年齡≥18 歲；③近6 個(gè)月內(nèi)就診次數(shù)＞3 次；④全部患者均處于疾病的活動(dòng)期。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他種類的消化系統(tǒng)性疾病者；②有惡性腫瘤者；③有血液疾病者；④有其他嚴(yán)重的內(nèi)科疾病者。IBD 患者中，UC 患者70 例，納入U(xiǎn)C 組，其中男42 例，女28 例；年齡30～56 歲，平均（42.37±2.14）歲；病程3～7 個(gè)月，平均（4.30±1.47）個(gè)月。CD 患者10 例，納入CD 組，其中男7 例，女3 例；年齡32～57 歲，平均（42.41±2.03）歲；病程3～6 個(gè)月，平均（4.10±1.39）個(gè)月。另選同期在醫(yī)院進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查的健康志愿者50 例納入對照組，其中男36 例，女14 例；年齡31～55 歲，平均（42.50±2.12）歲。三組一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 主要試劑 cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas 公司，生產(chǎn)批號：20150423）；real time PCR 試劑盒（Takara公司，生產(chǎn)批號：20151212）；CXCR1 兔抗人的多克隆抗體（Santa Cruz 公司，生產(chǎn)批號：20150129）；羊抗兔IgG（H+L）-HRP（天津三箭生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號：20150611）。

1.2.2 檢測各組血清IL-17 及CXCR1 mRNA 的表達(dá)抽取各組的空腹靜脈血約6 mL，用real time PCR 測定IL-17 及CXCR1 mRNA 的表達(dá)情況，相關(guān)引物序列均由Takara 公司提供。通過Trizol 法對靜脈血的RNA 進(jìn)行提取，取RNA 產(chǎn)物約2 μL，用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶常規(guī)合成cDNA，再由real time PCR 儀（CFX Connect，BioRad）實(shí)施熒光定量擴(kuò)增，得到CT 值，并用2-△△Ct法進(jìn)行計(jì)算。其中PCR 的反應(yīng)參數(shù)為：預(yù)變性為95℃下5 min，變性為95℃下30 s，退火為56～62℃下30 s，延伸為72℃下1 min，共30 個(gè)循環(huán)，再給予10 min 72℃的終延伸。IL-17 引物序列：正向引物為：5′-TCGTCCACGGGTCCTCTCTCCC-3′；反向引物：5′-GTACAGTTTTGTAAACGATGG-3′。CXCR1 引物序列：正向引物：5′-CCCGTTGGATTACCAGACGAACG-3′；反向引物為：5′-CGGAAACTCTGTCCTCATGTCATGG-3′。將β-actin 作為內(nèi)對照。

1.2.3 檢測各組腸黏膜IL-17 及CXCR1 mRNA 的表達(dá) 將提取的各組腸黏膜組織用real time PCR 法測定IL-17 及CXCR1 mRNA 表達(dá)，其中腸黏膜組織均取自結(jié)腸鏡的活檢組織，對照組取志愿者正常腸段的組織。檢測步驟同“1.2.2”，相關(guān)引物序列均由Takara公司提供，嚴(yán)格根據(jù)說明書的要求逐步實(shí)施。

1.2.4 蛋白免疫印跡法檢測腸黏膜組織CXCR1 蛋白的表達(dá) 通過蛋白免疫印跡法進(jìn)行測定操作，將各組的20 mg 腸黏膜組織在研磨并粉碎之后添加100 μL冷蛋白裂解液（①50 mmol/L 的Tris-HCL；②pH 為7.5；③150 mmol/L 的NaCl；④1%的NP-40；⑤0.1%的SDS；⑥對每100 μL 的裂解液添加1 μL 100 mmol/L的PMSF 液），待其充分裂解之后給予3 min 4℃下10 000 r/min 的離心，離心半徑12.5 cm，提取上清液并檢測蛋白濃度。將40 μg 蛋白同上樣緩沖液進(jìn)行混合，并煮沸5 min，給予SDS-PAGE，再電轉(zhuǎn)移到PVDF膜，用5%BSA 配制的脫脂牛奶予以封閉，再添加二抗行室溫孵育2 h，用TBST 緩沖液清洗3 次，最后用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行曝光顯影，并應(yīng)用Image J 軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析。

1.3 觀察指標(biāo)

比較各組血清及腸黏膜IL-17 及CXCR1mRNA表達(dá)水平，各組腸黏膜的CXCR1 蛋白表達(dá)水平，分析患者血清及腸黏膜IL-17 與CXCR1 表達(dá)的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，其中計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示；多組間比較采用方差分析，組間計(jì)量資料兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。采用Spearman 進(jìn)行相關(guān)性分析，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清IL-17 及CXCR1 mRNA 表達(dá)水平比較

與對照組比較，UC 組及CD 組血清IL-17 mRNA表達(dá)水平升高（均P ＜0.05），但UC 組與CD 組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）；各組血清CXCR1 mRNA表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見表1。

表1 各組血清IL-17 mRNA 及CXCR1 mRNA 表達(dá)比較（）

表1 各組血清IL-17 mRNA 及CXCR1 mRNA 表達(dá)比較（）

注：與對照組比較，*P ＜0.05。IL-17：白細(xì)胞介素-17；CXCR1：CXC趨化因子受體1

2.2 各組腸黏膜IL-17、CXCR1 mRNA 表達(dá)及CXCR1 蛋白表達(dá)水平比較

與對照組比較，UC 組及CD 組腸黏膜IL-17 mRNA、CXCR1 mRNA 及CXCR1 蛋白表達(dá)水平升高（均P ＜0.05）；與CD 組比較，UC 組腸黏膜CXCR1 mRNA 及CXCR1 蛋白表達(dá)水平升高（P ＜0.05），但UC 組與CD 組腸黏膜IL-17 mRNA 表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見表2。

表2 各組腸黏膜IL-17、CXCR1 mRNA 表達(dá)及CXCR1 蛋白表達(dá)水平比較（）

表2 各組腸黏膜IL-17、CXCR1 mRNA 表達(dá)及CXCR1 蛋白表達(dá)水平比較（）

注：與對照組比較，*P ＜0.05；與CD 組比較，#P ＜0.05。IL-17：白細(xì)胞介素-17；CXCR1：CXC 趨化因子受體1

2.3 患者血清及腸黏膜IL-17 mRNA 與CXCR1 mRNA 表達(dá)的相關(guān)性分析

Spearman 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，患者血清及腸黏膜IL-17 與CXCR1 表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.435、0.505，P=0.043、0.038）。

3 討論

臨床將IBD 分為UC 以及CD 兩種類型，其中UC 為結(jié)腸黏膜層以及黏膜下層等出現(xiàn)的連續(xù)性炎性反應(yīng)，其多數(shù)首先累及患者直腸，而后不斷向全結(jié)腸蔓延。而CD 則是累及整個(gè)消化道，屬于非連續(xù)性質(zhì)全層炎癥，最易累及位置包括末端回腸以及結(jié)腸、肛周等。目前臨床對于該病發(fā)病機(jī)制以及治病因素等均無確切定論，有學(xué)者指出，該病的發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，主要是由環(huán)境、遺傳以及感染和免疫等多種因素共同導(dǎo)致[9-12]。同時(shí)，臨床研究顯示，腸道黏膜自身免疫系統(tǒng)發(fā)生異常反應(yīng)，并引發(fā)系列炎性反應(yīng)，是IBD 患者發(fā)病的關(guān)鍵[13-14]。因此，IBD 發(fā)病與免疫功能異常之間存在直接聯(lián)系，使得有關(guān)腸道免疫功能紊亂問題的研究成為當(dāng)前IBD 疾病研究的重點(diǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，UC 組及CD 組血清IL-17 mRNA 表達(dá)水平更高（P ＜0.05），但UC 組與CD 組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）；而UC 組及CD 組腸黏膜IL-17 及CXCR1 mRNA 表達(dá)水平與對照組比較明顯升高，且UC 組腸黏膜CXCR1 mRNA 表達(dá)水平較CD 組明顯更高（P ＜0.05），但I(xiàn)L-17 mRNA差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。這與胡梅等[15]的報(bào)道結(jié)果一致。提示IL-17 及CXCR1 均可能參與到IBD的發(fā)病過程中，但二者的作用機(jī)制有所差異。CXCR1能夠特異性地結(jié)合IL-17，并介導(dǎo)相應(yīng)的中性粒細(xì)胞趨化和磷脂酶D 的活化，及超氧化物的形成，在IBD中重點(diǎn)參與到UC 的發(fā)病過程當(dāng)中，并與UC 的活動(dòng)性緊密相關(guān)[16]。而IL-17 則主要可能是通過促進(jìn)白細(xì)胞釋放過量的化學(xué)因子引起組織炎癥的發(fā)生，最終強(qiáng)化了腸道內(nèi)的炎性反應(yīng)而導(dǎo)致IBD 的形成[17]。同時(shí)，本文還發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，UC 組及CD 組腸黏膜CXCR1 蛋白表達(dá)水平升高（P ＜0.05），且UC 組較CD組更高（P ＜0.05），再次提示了CXCR1 蛋白雖然可參與到IBD 的發(fā)病，但以UC 為主。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，患者血清及腸黏膜IL-17 與CXCR1 mRNA 表達(dá)呈正相關(guān)。這提示了炎癥因子與趨化因子之間存在著一定程度的聯(lián)系，主要由于多種炎癥細(xì)胞不斷向腸道轉(zhuǎn)移，并且釋放出大量趨化因子。以上炎癥細(xì)胞以及趨化因子等共同參與IBD 發(fā)生，并造成炎癥損傷[18]。趨化因子是指一種通過組織細(xì)胞以及炎癥細(xì)胞合成并分泌，具備對炎癥細(xì)胞進(jìn)行趨化募集以及活化等功能的蛋白質(zhì)，其能夠和相應(yīng)受體相結(jié)合，并誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞不斷趨化游走，介導(dǎo)其向發(fā)生炎癥位置聚集，并且活化[19]。CXC為趨化因子一個(gè)典型亞家族，與其相結(jié)合的受體則是CXC 受體，CXCR1 為其中一個(gè)類型。CXC 與CXCR 可以互相結(jié)合并發(fā)揮出一定生物學(xué)功能，且對炎性反應(yīng)產(chǎn)生一定作用[20-21]。IL-17 則具備較高的炎癥活性，其可通過引起下游多類細(xì)胞因子及趨化因子表達(dá)，不斷招募機(jī)體的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞遷移至炎癥部位區(qū)域，從而產(chǎn)生組織損傷，而腸道內(nèi)的微生物及局部性的細(xì)胞因子微環(huán)境則共同促使了IL-17 的表達(dá)[22]。因此，監(jiān)測CXCR1 和IL-17 有利于更好地輔助治療IBD。這在Verstockt 等[23]的報(bào)道中也有類似的結(jié)論可加以佐證。

綜上所述，IBD 患者CXCR1 和IL-17 呈高表達(dá)，且患者血清及腸黏膜的IL-17 與CXCR1 表達(dá)呈正相關(guān)，臨床上可考慮監(jiān)測CXCR1 和IL-17 水平，從而更好地輔助治療IBD。