張舒羽 許 哲 周守寧 鄭卓玲 湯世凡 張 希 黃 民 李嘉麗

1.國家兒童醫(yī)學中心 首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院臨床研究中心，北京 100045；2.中山大學藥學院藥物代謝實驗室中山大學臨床藥理研究所，廣東廣州 510006；3.中山大學附屬第一醫(yī)院心臟外科，廣東廣州 510080

華法林廣泛用于人工心臟瓣膜置換術后的抗凝治療[1]，其治療窗窄、個體差異大，需根據國際標準化比值（INR）的監(jiān)測值不斷調整劑量[2-3]。華法林的不良反應主要發(fā)生在給藥初期[4]，因而準確地預測華法林的初始給藥劑量和減少華法林抗凝初期的劑量波動是華法林個體化治療的當務之急。近年來的研究表明，華法林的主要代謝細胞色素P450酶2C9（CYP2C9）以及靶點蛋白維生素K 環(huán)氧化物還原酶復合體亞單位1（VKORC1），其基因多態(tài)性是造成個體間華法林劑量差異的主要原因。目前尚未見研究探討遺傳因素對華法林抗凝劑量波動的影響[5-7]。本研究以人工心臟病瓣膜置換術患者為研究對象，考察VKORC1和CYP2C9基因多態(tài)性對華法林抗凝初期（術后給藥90 d）維持劑量及劑量波動的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2014年6月～2016年12月中山大學附屬第一醫(yī)院（以下簡稱“我院”）心血管外科人工心臟瓣膜置換術患者201例，性別不限，年齡為18～65歲。所有患者均簽署知情同意書，試驗方案經我院醫(yī)學倫理委員會批準。所有患者術前采集1～2 mL 靜脈血，放置于含有乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）的抗凝管中；術后開始服用華法林鈉片（3 mg×100片，芬蘭奧利安）；接受90 d 的隨訪，并按要求復診調整用藥劑量；監(jiān)測INR 保持在1.8～2.5之間。

1.2 試劑與儀器

聚合酶鏈反應（PCR）引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；限制性內切酶購自美國Thermo Fisher 公司；臺式高速低溫冷凍離心機（日本HITACHI 公司）。

1.3 基因分型方法

全血樣本參照實驗室優(yōu)化的NaI 裂解法[8]提取基因組DNA，VKORC1 rs7294和CYP2C9*3（rs1057910）的基因型采用聚合酶鏈反應限制性片段長度多態(tài)性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）進行檢測，所用引物及方法參照Cen等[9]、Hadjipanagi等[10]、Turgut等[11]的報道。

1.4 華法林抗凝治療波動指標

本部分通過以下指標來描述劑量波動：①華法林日劑量波動幅度（dose differerence，DD，mg/d）：在隨訪期內，最大日劑量與最小日劑量之差，DD=dose maximum-dose minimum。②華法林持久波動日劑量（lasting dose，LD，mg/d）：隨訪頻率和時間間隔相同的前提下，劑量共計發(fā)生X 次變動，出現D1、D2……Dx……Dn共計n 個華法林劑量值（X≤n）；D1劑量在總共X 次劑量變動中出現過C1次，C1次總共給藥維持天數為L1天，以此類推，Dn劑量在總共X 次劑量變動中出現過Cn次，Cn次總共給藥維持天數為Ln天，其中Dx給藥維持天數Lx最大，則該Dx為華法林持久波動日劑量（LD）。

1.5 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件對所得數據進行處理，計量資料的平均水平用均數±標準差（）表示；組間比較采用Kruskal-Wallis 檢驗。以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義；應用Haploview 4.2統(tǒng)計軟件對基因型進行哈迪-溫伯格平衡（hardy-weinberg equilibrium，HWE）χ2檢驗，P ＞0.05，說明群體基因遺傳符合HWE。

2 結果

2.1 臨床資料

本研究共納入201例患者，其中男性116例，女性85例；平均年齡為（47.9±0.7）歲，平均術后首次華法林劑量為（2.89±0.05）mg/d，首次給藥合用可達龍患者17例（8.5%）；平均LD 值為57 d。

2.2 基因型分布頻率

VKORC1 rs7294和CYP2C9*3的基因型分布具體如表1所示，本研究群體基因遺傳平衡。

表1 VKORC1 rs7294和CYP2C9＊3的基因型分布（n=201）

2.3 VKORC1和CYP2C9基因型對華法林抗凝治療初期維持劑量LD 及劑量波動DD 的影響

對于VKORC1 rs7294，CT 突變雜合子攜帶者的LD 為（3.44±0.20）mg/d，CC 野生純合子攜帶者的LD為（2.55±0.08）mg/d，兩組比較，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.001）。對于CYP2C9*3，*1*3突變雜合子攜帶者的LD 為（2.85±0.09）mg/d，*1*1野生純合子攜帶者的LD 為（2.59±0.21）mg/d，兩組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.485）。

對于VKORC1 rs7294，CT 突變雜合子攜帶者的DD 為（2.43±0.12）mg/d，CC 野生純合子攜帶者的DD為1.99±0.08 mg/d，兩組比較，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。對于CYP2C9*3，*1*3突變雜合子攜帶者的DD 為（2.10±0.29）mg/d，*1*1野生純合子攜帶者的DD 為（2.19±0.08）mg/d，兩組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.799）。

3 討論

當前華法林藥物基因組學研究主要分為基于現有基因型指導下預測給藥劑量模型的前瞻性研究和尋找新遺傳因素為目的的回顧性研究[12-13]。本實驗室前期前瞻性研究發(fā)現：在90 d 隨訪期內，分別采用遺傳因素和臨床因素模型預測給藥的兩組患者華法林劑量變動均超過8次，DD 均超過2 mg/d，跨度從1～9 mg/d，兩組比較，差異無統(tǒng)計學意義。這意味著基因型指導下的給藥劑量模型尚不能改善傳統(tǒng)抗凝方案的劑量波動現狀[14-15]。

INR 在治療范圍內的時間（time in therapeutic range，TTR）和穩(wěn)態(tài)劑量兩個指標雖然常規(guī)被用來評價口服華法林的達標情況和效果差異，但不足以全面體現華法林抗凝效應波動性的個體差異。筆者認為劑量達穩(wěn)是實際給藥劑量圍繞持久波動的日劑量上下浮動，逐漸達到最適藥物劑量，并趨于穩(wěn)定的過程，換言之LD持續(xù)累計時間最長；同時，最適藥物劑量受病理狀態(tài)、飲食等多因素影響，隨時間動態(tài)變化，并不是絕對一成不變的[15]。因此，本部分研究以LD 和DD 指征華法林抗凝初始階段的波動性。

近年來，國內外已有多項研究顯示VKORC1和CYP2C9基因多態(tài)性是影響華法林穩(wěn)態(tài)劑量大小個體差異的主要遺傳因素，但針對這兩個基因對華法林抗凝初始階段的劑量波動性的研究較少[16]。Wypasek等[17]隨訪3個月發(fā)現CYP2C9*3攜帶者較CYP2C9*1*1的INR 達標百分比明顯降低，本研究在考察平均日劑量波動幅度時未見統(tǒng)計學差異，考慮有可能是CYP2C9*3在中國人群中突變率較低，以及本研究人群中CYP2C9*3攜帶者例數較少所致。Liu等[4]通過監(jiān)測心臟瓣膜置換術患者給藥7 d 內的INR 值，發(fā)現達到相同INR 值，VKORC1 rs7294 T 突變基因攜帶者較CC 野生型攜帶者需要更高的華法林給藥劑量。Wang等[18]以及Chen等[19]分別考察了華法林抗凝治療3個月以上的穩(wěn)定劑量，發(fā)現VKORC1 rs7294 T 突變基因攜帶者的穩(wěn)態(tài)劑量也明顯高于CC 野生型攜帶者。本研究發(fā)現VKORC1 rs7294 T 突變基因攜帶者的DD 和LD 顯著高于CC 野生純合子攜帶者，不僅印證了VKORC1 rs7294對華法林初始抗凝維持劑量大小的影響，也說明VKORC1是影響華法林抗凝波動性的主要遺傳因素。

VKORC1 rs7294與華法林抗凝劑量降低和波動顯著相關，原因可能是：①VKORC1 rs7294作為VKORC1上游調控區(qū)的突變，可能上調了mRNA 的表達，導致維生素K 環(huán)氧化物還原成維生素K 醌形式的反應增強，使T 突變基因攜帶者需要更多的華法林拮抗這一過程[20]；②華法林作為抗凝前體藥物，半衰期較長，需待內源性凝血因子消耗盡才能發(fā)揮抗凝作用，T 突變基因攜帶者由于還原維生素K 環(huán)氧化物的能力較強，體內凝血因子儲量較多，新生凝血因子的能力也較CC 野生型攜帶者強。因此，VKORC1 rs7294 T 突變基因攜帶者的DD 明顯高于CC 野生型攜帶者。

綜上所述，遺傳因素不僅影響華法林初期抗凝劑量大小，也是導致劑量波動個體差異的重要影響因素。本研究從LD 和DD 兩個方面考察了華法林抗凝初始階段給藥劑量的波動性，發(fā)現VKORC1 rs7294 T突變基因攜帶者較CC 野生型攜帶者所需華法林抗凝維持劑量高，更易發(fā)生劑量波動，應該加強INR監(jiān)測。這或是對目前廣泛開展的基因型指導下華法林劑量預測給藥方案的補充，以期為華法林的長期個體化抗凝治療、加強患者用藥教育和自我管理提供參考和依據。