夏思思 趙文明 榮雨佳

1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，北京 100020；2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，北京 100069；3.中國(guó)航天科工集團(tuán)七三一醫(yī)院檢驗(yàn)科血庫，北京 100074

骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）可明顯改善類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）的骨流失，但對(duì)抑制滑膜炎沒有作用[1-2]。熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）中某些保守的、具有與哺乳動(dòng)物HSP同源序列的交叉反應(yīng)性T 細(xì)胞表位可抑制關(guān)節(jié)炎進(jìn)展[3-4]。為了改善RA 骨破壞及炎癥損傷，本實(shí)驗(yàn)室將結(jié)核桿菌HSP70的部分基因序列引入到人OPG 功能性基因片段中，制備了OPG-HSP70融合蛋白，并利用膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）模型鼠評(píng)估其改善滑膜炎和骨侵蝕的作用。CIA 是經(jīng)典的RA 動(dòng)物模型，常用來研究RA 病理改變和評(píng)估新藥[5-6]。鑒于中和抗體產(chǎn)生是生物制劑長(zhǎng)期應(yīng)用后療效降低的機(jī)制之一[7-8]，本研究分析了應(yīng)用OPGHSP70融合蛋白后血清核因子κB 受體活化因子配基（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）、Ca2+、Ⅱ型膠原（collagen type Ⅱ，CⅡ）抗體與CIA小鼠滑膜炎及骨量改變的相關(guān)性，并檢測(cè)了融合蛋白的免疫原性，為研發(fā)同時(shí)拮抗RA 炎癥和骨破壞藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

OPG、OPG-HSP70融合蛋白為首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。牛CⅡ蛋白、含4 mg/mL卡介苗的完全弗氏佐劑（complete Freund′s adjuvant，CFA）和牛CⅡ抗體測(cè)定試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Chondrex公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 抗體購(gòu)自美國(guó)SAB 公司；小鼠RANKL 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)試劑盒和人OPG 重組蛋白均購(gòu)自美國(guó)R&D 公司；鈣離子檢測(cè)試劑盒（DICA-500）購(gòu)自美國(guó)BioAssay公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

4～6周齡的SPF 級(jí)雄性DBA/1小鼠和雌雄各半的BALB/c 小鼠，體重（17±2）g，均購(gòu)自北京華阜康科技有限公司，合格證號(hào)：0219345。小鼠在首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照《首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理規(guī)范》進(jìn)行，倫理審批號(hào)：SYXK2007-005。DBA/1小鼠按體重分為3組：OPGHSP70治療組（n=20）、OPG 治療組（n=12）和模型對(duì)照組（n=12）。BALB/c 小鼠按體重分為3組，OPGHSP70治療組、OPG 治療組和PBS 對(duì)照組，每組6只。

1.3 CIA 模型制備和評(píng)估

用CFA 與牛CⅡ（1∶1混合）在距DBA/1小鼠尾根部1.5 cm 處，皮內(nèi)注射（100 μL/只）誘導(dǎo)CIA 模型。誘導(dǎo)后18 d 小鼠開始發(fā)病，最初表現(xiàn)為單關(guān)節(jié)腫脹，繼而由趾端向踝關(guān)節(jié)發(fā)展。隔天按0～4分五級(jí)進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分：無紅腫記0分；累及一個(gè)關(guān)節(jié)紅和/或腫脹記1分；累及兩個(gè)關(guān)節(jié)的腫脹記2分；累及兩個(gè)以上關(guān)節(jié)的腫脹記3分；包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹記4分，每個(gè)足爪最高記4分，一只小鼠最高記16分，關(guān)節(jié)炎指數(shù)越高，炎癥程度越重[9-10]。

1.4 給藥方法

DBA/1小鼠發(fā)病后即參照文獻(xiàn)進(jìn)行相應(yīng)給藥處理[11-12]，連續(xù)4周隔日一次腹腔注射給藥，劑量如下：OPG-HSP70治療組[50 mg/（kg·次）]、OPG 治療組[45 mg/（kg·次）]、模型對(duì)照組（等劑量PBS）。BALB/c小鼠免疫原性測(cè)定的給藥劑量、方式、次數(shù)同DBA/1小鼠。

1.5 骨相對(duì)灰度值計(jì)算

DBA/1小鼠給藥4周后斷頸處死，將后肢去皮毛和多余皮下組織，按相同姿勢(shì)固定于小動(dòng)物專用的Micro-CT 測(cè)定板（由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）上，將四肢踝關(guān)節(jié)到趾間的部分掃描后進(jìn)行三維重建，并進(jìn)行灰度值計(jì)算[13]。

1.6 血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

DBA/1小鼠處死當(dāng)日眼眶靜脈采血，分離血清，ELISA 法檢測(cè)血清中抗CⅡ抗體和RANKL 的水平，化學(xué)法檢測(cè)血清鈣離子水平；BALB/c 小鼠給藥后0、1、2、3周間斷采集血清，ELISA 法檢測(cè)OPG 抗體的水平。具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD 檢驗(yàn)；參數(shù)之間的相關(guān)性采用Logistic 線性回歸分析。以P <0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OPG-HSP70融合蛋白CIA 小鼠炎癥和骨破壞的改善作用

膠原誘導(dǎo)后18 d，各組小鼠開始發(fā)病，與模型對(duì)照組比較，OPG-HSP70治療組的關(guān)節(jié)炎指數(shù)明顯降低（P ＜0.01），骨密度值明顯增加（P ＜0.05），CⅡ抗體明顯下降（P ＜0.01）；RANKL 水平下降，Ca2+水平增高，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P >0.05）。與OPG 治療組比較，OPG-HSP70治療組關(guān)節(jié)炎指數(shù)降低（P ＜0.05），骨密度增加（P ＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，OPG 治療組CⅡ抗體顯著降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。見表1。

2.2 血清學(xué)指標(biāo)與病情相關(guān)性分析

血清學(xué)指標(biāo)與病情相關(guān)性分析的結(jié)果顯示，血清中CⅡ抗體越高，關(guān)節(jié)炎指數(shù)越高，滑膜炎越重，呈正相關(guān)（r=0.892，P ＜0.01）。血清中Ca2+和RANKL 水平越高，骨密度值越低，骨破壞程度越重，呈負(fù)相關(guān)（r=-0.582、r=-0.588，均P ＜0.01）。見圖1。提示應(yīng)用OPG-HSP70治療后，可以用血清學(xué)指標(biāo)監(jiān)測(cè)治療敏感度。

表1 CIA 小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)和血清學(xué)指標(biāo)（）

表1 CIA 小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)和血清學(xué)指標(biāo)（）

注：與模型對(duì)照組比較，*P <0.05，**P <0.01；與OPG 治療組比較，#P <0.05。CⅡ：Ⅱ型膠原；RANKL：核因子κB 受體活化因子配基；Ca2+：鈣離子

2.3 血清免疫原性分析

為了明確OPG-HSP70融合蛋白的免疫原性，采用間接ELISA 法動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)血清抗OPG 抗體的滴度。給藥后，OPG-HSP70治療組和抗OPG 治療組均可檢測(cè)到相應(yīng)的抗體。給藥后，OPG-HSP70給藥組抗OPG 抗體水平均高于PBS 對(duì)照組（P <0.01）。但與OPG 治療組比較，OPG-HSP70治療組的OPG 抗體滴度在給藥后2周開始低于OPG 治療組，且隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）。見表2。

圖1 血清學(xué)指標(biāo)與病情相關(guān)性分析

表2 血清抗OPG 抗體水平（OD450nm，）

表2 血清抗OPG 抗體水平（OD450nm，）

注：與PBS 對(duì)照組比較，*P <0.05，**P <0.01；與OPG 治療組比較，##P <0.01。OPG：骨保護(hù)素；OPG-HSP70：骨保護(hù)素-熱休克蛋白70；PBS：磷酸鹽緩沖液

3 討論

OPG 是1997年發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子受體家族新成員，為一種含有401個(gè)氨基酸的可溶性分泌型糖蛋白[14]。OPG 作為RANKL 的可溶性誘餌受體與破骨細(xì)胞上的核轉(zhuǎn)錄因子-κB 受體活化因子（receptor activator of nuclear factor κB，RANK）競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合RANKL，抑制破骨細(xì)胞分化、成熟而終止骨吸收，并通過接觸到臨近的成骨細(xì)胞促進(jìn)骨形成。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)在RA 的關(guān)節(jié)滑膜及局部骨侵蝕處可見RANKL 表達(dá)異常增高[15]，而OPG 在RA 關(guān)節(jié)中的表達(dá)相對(duì)不足[16]。因此促進(jìn)OPG 表達(dá)成為防治RA 關(guān)節(jié)骨侵蝕的有效途徑。研究表明，OPG 在體內(nèi)外能有效地阻止RA 患者破骨細(xì)胞的成熟與分化，抑制骨破壞，但對(duì)滑膜炎癥沒有作用[1]。為了使OPG 具有抑制炎癥作用，本研究引入了HSP70片段制備了OPG-HSP70融合蛋白，關(guān)節(jié)炎指數(shù)和CⅡ抗體的明顯下降提示引入HSP70后融合蛋白具備了抑制炎癥的作用；且骨密度值出現(xiàn)上升，表明抑制炎癥可進(jìn)一步降低骨破壞。

HSP70的生物學(xué)作用主要是防止細(xì)胞凋亡、抗氧化、作為分子伴侶輔助蛋白折疊與轉(zhuǎn)運(yùn)[17-18]。近年研究表明HSP70具有抗炎作用，主要與其抑制NF-κB 的活性、減少炎癥介質(zhì)產(chǎn)生、增強(qiáng)抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)有關(guān)[19-20]。本研究中，HSP70引入后構(gòu)建的OPGHSP70融合蛋白不僅增加了抑制滑膜炎的效果，而且還具有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的作用，血清中反映疾病預(yù)后指標(biāo)的CⅡ抗體水平下降，而且影響療效的OPG 抗體也明顯低于OPG 治療組，這提示引入HSP70后可以使融合蛋白的免疫原性降低，有助于增加療效。這可能是由于OPG 功能蛋白與HSP70重組后，蛋白空間結(jié)構(gòu)的改變降低了其免疫原性，具體原因有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，滑膜炎和骨損傷是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎兩個(gè)最顯著的病理學(xué)特征。本研究將OPG 和HSP70兩者的功能性片段連接，制備了OPG-HSP70融合蛋白，去除了與RA 治療無關(guān)，甚至對(duì)機(jī)體有害的肽段，也解決了由于HSP70發(fā)揮抑炎作用的功能片段小，可能不利于單獨(dú)應(yīng)用的問題；該融合蛋白能同時(shí)發(fā)揮兩種功效，可一并治療RA 的炎性反應(yīng)和骨損傷這兩個(gè)密切相關(guān)的病癥。