李開瑞 劉 潔 李小娜 何迎春 徐朝軍 宋 嵐

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，湖南長(zhǎng)沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410208；3.中醫(yī)藥防治眼耳鼻喉疾病湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙 410208；4.湖南省中醫(yī)藥防治眼耳鼻咽喉疾病與視功能保護(hù)工程技術(shù)研究中心，湖南長(zhǎng)沙 410208；5.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸心外科，湖南長(zhǎng)沙 410000；6.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)國(guó)內(nèi)一流建設(shè)學(xué)科，湖南長(zhǎng)沙 410000

肺癌是目前發(fā)病率和死亡率均居于首位的惡性腫瘤[1]，肺腺癌是肺癌最常見的組織學(xué)類型，約占所有肺癌的50%。目前肺腺癌治療主要以手術(shù)和放化療為主，但術(shù)后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、放化療等不良反應(yīng)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生存率。目前靶向治療[2]對(duì)非小細(xì)胞肺癌療效較好，但前期基因檢測(cè)、后期靶向藥物費(fèi)用高以及耐藥問題都不容忽視[3]。因此，尋找更為安全有效適合的治療方法是目前肺腺癌研究熱點(diǎn)之一。中藥在治療癌癥中效果明顯，安全性高，能提高患者生活質(zhì)量和生存率。齊墩果酸[4]是一種五環(huán)三萜類化合物，廣泛存在于山楂、女貞子、夏枯草等中藥材中，作為廣譜抗菌藥臨床上用于護(hù)肝降酶、治療急性肝炎[4]等，研究發(fā)現(xiàn)其還具有降脂、降糖、抗癌[5-6]等作用，本文主要研究齊墩果酸對(duì)A549細(xì)胞增殖及凋亡的影響，探究其相關(guān)作用機(jī)制。以期為其臨床應(yīng)用于治療肺腺癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論支持。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

人肺腺癌A549細(xì)胞購(gòu)自蘇州北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司，由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

齊墩果酸（上海金穗生物有限公司，貨號(hào)：201804 03）；順鉑（Cis，Sigma 公司，貨號(hào)：P4394-25MG）。

1.3 主要試劑

DMEM-高糖培養(yǎng)基（Hyclone，貨號(hào)：SH30022 02B）；胎牛血清（Gibco，貨號(hào)：A3160802）；線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）（Solarbio，貨號(hào)：M8650），Annexin VFITC/PI apoptosis Kit（聯(lián)科生物，貨號(hào)：70-AP101-100）。

1.4 主要儀器

全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀（ELX800，BioTek 公司）、Cellometer Image Cytometer（K2，Nexcelom 公司）、CytationTM5細(xì)胞成像多功能檢測(cè)系統(tǒng)（cytation5，BioTek 公司）、Odyssey-CLX 雙色紅外熒光成像系統(tǒng)（9140S/N CLX-1801，Gene 有限公司）。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將A549置于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素混合液的DMEM-高糖培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2、濕度飽和培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5.2 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整單細(xì)胞懸液濃度，鋪于96孔板，每孔100 μL、4000個(gè)細(xì)胞，隨機(jī)分為對(duì)照組、不同濃度齊墩果酸（0.625、1.25、2.5、5、10 μmol/L）組、陽(yáng)性對(duì)照組（Cis，0.004 g/L）。待細(xì)胞貼壁后，棄盡原培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)分組每孔加入200 μL 藥物，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48、72 h 后，棄盡原培養(yǎng)基后每孔加入100 μL 0.5 g/L MTT 溶液，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄盡MTT 溶液，每孔加入100 μL 二甲基亞砜（DMSO）于脫色搖床上室溫避光震蕩10 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm 處各孔吸光度值（A），計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率，細(xì)胞增殖率=（實(shí)驗(yàn)組A 值－空白組A 值）/（對(duì)照組A 值－空白組A 值）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.3 實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞分析技術(shù)（RTCA）監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整單細(xì)胞懸液濃度，鋪于RTCA 電子檢測(cè)板（E-Plate），每孔100 μL、4000個(gè)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分組同“1.5.2”。待細(xì)胞指數(shù)（CI）達(dá)到1.0時(shí)，按實(shí)驗(yàn)分組每孔加入200 μL 藥物，每組3個(gè)復(fù)孔，監(jiān)測(cè)72 h 以上，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.4 Hoechst 33342染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整單細(xì)胞懸液濃度，均勻鋪于6孔板，1×105個(gè)細(xì)胞/孔，隨機(jī)分為對(duì)照組、不同濃度齊墩果酸（1.25、5 μmol/L）組、陽(yáng)性對(duì)照組（Cis，0.004 g/L），處理48 h 后，棄盡原培養(yǎng)液，PBS 清洗2次，每孔加入Hoechst 33342染色液（0.01 g/L）1 mL，避光染色30 min，棄盡染色液，PBS 清洗3次，CytationTM5拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.5 線粒體膜電位檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整單細(xì)胞懸液濃度，均勻鋪于6孔板，1×105個(gè)細(xì)胞/孔。實(shí)驗(yàn)分組同“1.5.4”，處理48 h 后，棄盡原培養(yǎng)液，PBS 清洗2次，每孔加入1 mL JC-1染色工作液，避光染色30 min，棄染色液后PBS 洗滌2次，于CytationTM拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.6 Annexin V-FITC/PI 雙熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整單細(xì)胞懸液濃度，均勻鋪于100 mm 培養(yǎng)皿，6×105個(gè)細(xì)胞/皿，實(shí)驗(yàn)分組同“1.5.4”，處理48 h，收集細(xì)胞離心（1000 r/min，3 min），PBS 清洗2次，每管加入1×Binding Buffer 100 μL 重懸，隨后加入5 μL FITC 和10 μL PI，室溫避光染色5 min，最后加入1×Binding Buffer 100 μL 終止染色，于K2檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.7 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整單細(xì)胞懸液濃度，均勻鋪于100 mm培養(yǎng)皿，實(shí)驗(yàn)分組同“1.5.4”，處理48 h 后，PBS 清洗兩遍，每皿加入80 μL 裂解液于冰上裂解30 min，離心（12 000 r/min，10 min）收集蛋白，定量，配制上樣體系，于12% SDS-PAGE 膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，敷育一抗過夜，TBST 洗膜5次，每次6 min，室溫敷育熒光二抗2 h，TBST 洗膜5次，每次6 min，于Odyssey-CLX 掃膜。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料服從正態(tài)分布用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，滿足方差齊性，多重比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，方差不齊者采用Dunnet T3檢驗(yàn)；計(jì)量資料不服從正態(tài)分布采用秩和檢驗(yàn)。以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 齊墩果酸對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

MTT 法檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度齊墩果酸組分別處理A549細(xì)胞24、48、72 h 后的細(xì)胞增殖率均低于對(duì)照組（P ＜0.01）。見圖1。RTCA 結(jié)果顯示，不同濃度齊墩果酸能夠抑制A549細(xì)胞增殖。見圖2。RTCA 和MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，選擇增殖抑制效果較好的低濃度齊墩果酸（1.25、5 μmol/L）作用48 h 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 MTT 法檢測(cè)齊墩果酸對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響（n=3）

2.2 齊墩果酸對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

Hoechst 33342染色法結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞核染成均勻淡藍(lán)色，而各加藥組細(xì)胞部分細(xì)胞核呈顆粒狀亮藍(lán)色，伴有細(xì)胞核固縮、邊集、碎裂等。與對(duì)照組比較，各加藥組熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05或P ＜0.01）。見圖3（封三）。JC-1染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，各加藥組染色后的紅色熒光強(qiáng)度明顯下降，綠色熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)（P ＜0.05或P ＜0.01），提示細(xì)胞線粒體膜電位下降。見圖4（封三）。Annexin V-FITC/PI 雙熒光染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，各加藥組細(xì)胞凋亡明顯增加（P ＜0.05或P ＜0.01）。見圖5。

圖2 RTCA 監(jiān)測(cè)齊墩果酸對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

圖3 Hoechst 33342染色法檢測(cè)齊墩果酸對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響(n=3,200 um,100x)

圖4 線粒體膜電位檢測(cè)齊墩果酸對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響(n=3,100μm,200x)

圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)齊墩果酸對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響（n=3）

2.3 齊墩果酸對(duì)A549細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

齊墩果酸能夠下調(diào)抗凋亡蛋白XIAP、Survivin、Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)促凋亡蛋白Bax、cleaved caspase 3、cleaved caspase 8的表達(dá)，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05或P ＜0.01）。見圖6。

3 討論

肺癌作為發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)最快的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅了人們健康和生命安全，現(xiàn)常用的治療手段，具有一定的局限性、昂貴的治療費(fèi)用、難以逆轉(zhuǎn)的毒副作用等不容忽視的缺點(diǎn)，因此從安全性高、療效確切、不宜耐藥、相對(duì)廉價(jià)的中藥入手，尋找更合適的治療方法及藥物是研究的重點(diǎn)。

在以往的研究中發(fā)現(xiàn)，齊墩果酸對(duì)肝癌[7]、乳腺癌[8]、胰腺癌[9]、結(jié)腸癌[10]、肺癌[11]等腫瘤細(xì)胞均有一定的作用，但在A549細(xì)胞方面相關(guān)研究較少且不夠深入，有待進(jìn)一步研究拓展。本研究通過MTT 及RTCA檢測(cè)齊墩果酸對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度齊墩果酸對(duì)A549細(xì)胞增殖均有顯著的抑制作用，且通過RTCA 圖像可以初步判斷齊墩果酸能夠造成A549細(xì)胞DNA 損傷[12-13]使其失去復(fù)制能力，進(jìn)而抑制其增殖。Hoechst 33342染色觀察細(xì)胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組呈均一的淡藍(lán)色，齊墩果酸干預(yù)的實(shí)驗(yàn)組部分細(xì)胞核呈顆粒狀亮藍(lán)色，并伴有細(xì)胞核固縮、邊集、碎裂，出現(xiàn)凋亡小體等明顯的凋亡特征。有研究顯示，齊墩果酸可以下調(diào)線粒體膜電位促進(jìn)細(xì)胞凋亡[7]，本研究采用JC-1檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組的紅色熒光比較，隨著齊墩果酸濃度的提高綠色熒光的占比也隨之升高，提示線粒體膜電位降低，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡。同時(shí)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，不同濃度齊墩果酸均能誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，以早期凋亡為主，高濃度組的抑制率優(yōu)于低濃度組。已有研究提示，齊墩果酸的誘導(dǎo)凋亡作用主要通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族表達(dá)[14]、上調(diào)抑癌基因p53的表達(dá)[15]、誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生[16]等途徑發(fā)揮作用。本研究發(fā)現(xiàn)，齊墩果酸可以抑制A549細(xì)胞Bcl-2表達(dá)、上調(diào)Bax 表達(dá)。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，齊墩果酸可以下調(diào)A549細(xì)胞XIAP 和Survivin 的表達(dá)。XIAP[17]和Survivin[18]是凋亡抑制蛋白家族的兩個(gè)重要成員，許多中藥單體，如阿魏酸[19]、白藜蘆醇[20]等均通過下調(diào)其表達(dá)發(fā)揮抗腫瘤作用。以上均表明齊墩果酸可以誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。根據(jù)以上結(jié)果推測(cè)齊墩果酸可能通過誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡抑制細(xì)胞增殖。

另外，研究顯示，齊墩果酸可以激活caspase 蛋白酶家族[21]，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，齊墩果酸處理后A549細(xì)胞中cleaved caspase 3和cleaved caspase 8均表達(dá)上調(diào)。死亡受體途徑由caspase 8直接激活caspase 3或是caspase 8通過激活Bid 增加線粒體通透性觸發(fā)線粒體釋放促凋亡因子激活caspase 3導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。線粒體途徑可能是通過DNA 損傷等激活Bcl-2家族促凋亡因子增加線粒體的通透性進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此，推測(cè)齊墩果酸可能是通過死亡受體途徑或線粒體途徑誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

圖6 齊墩果酸對(duì)A549細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響（n=3）

綜上所述，齊墩果酸可能通過死亡受體途徑或線粒體途徑誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，抑制其增殖。