呂 君 雷淑英

人皮膚鱗狀細胞癌(human skin squamous cell carcinoma，SCC)已經(jīng)成為與癌癥相關的人類死亡的重要原因[1]。流行病學統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，大約20%人口一生中可能發(fā)生皮膚癌，并且其發(fā)病率每年呈逐漸增高的趨勢[2]。目前，皮膚癌的治療手段主要包括手術(shù)、放療和化療[2,3]。對于晚期、復發(fā)性或轉(zhuǎn)移性SCC的預后不理想，可能的原因是缺乏有效藥物的治療[4]。因此，開發(fā)治療皮膚癌的新型高效化合物具有重大意義。

槲皮黃酮(quercetin，Qu)是一類黃酮類化合物，主要分布在蕨類植物、裸子植物及被子植物中，具有較強的抗炎活性、參與免疫調(diào)節(jié)及具有抗腫瘤的功效[5]；早期已有研究證實Qu對輻射誘導的皮膚纖維化具有保護作用[6]。然而，Qu對SCC細胞的增殖活性是否具有抑制作用，尚未見報道。鞘氨醇激酶2(sphingosine kinase 2，SphK2)是SCC或其他腫瘤治療的重要藥物靶點[7,8]，SphK2活化可誘導1-磷酸神經(jīng)鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)的產(chǎn)生，進而導致腫瘤細胞增殖、生存、血管生存及凋亡抵抗[9]。然而，SphK2基因沉默則會引起S1P前體鞘氨醇和神經(jīng)酰胺的積累，后者會誘導腫瘤細胞凋亡及分裂周期停滯[10]。因此，本文觀察了Qu對SCC細胞活力、增殖及凋亡的影響，并初步探討其作用機制。

1 材料及方法

1.1 藥品與試劑 槲皮黃酮、Akt激動劑SC79、S1P和JNK抑制劑SP600125均購自美國Sigma公司；Annexin V-FITC/PI和CCK8試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；Caspase-glot-3/-9活性測定試劑盒購買于美國Promega公司；BrdU試劑盒購自上海Roche Diagnostics公司；兔anti-t-PARP、兔anti-Cle-PARP、兔anti-Cle-PARP、兔anti-Akt、兔anti-p-Akt、兔anti-S6K1、兔anti-p-S6K1、兔anti-JNK1/2、兔anti-p-JNK1/2、兔anti-Sphk2和兔anti-β-actin購自英國Abcam公司；羊抗兔IgG二抗購自上海谷歌生物公司。

1.2 主要儀器 單人超凈臺(蘇州華新空調(diào)凈化有限公司)；細胞培養(yǎng)箱(上海醫(yī)用分析儀器廠)；Victor3 1420 Multilable Counter酶標儀(DX540，美國)；SDS-PAGE凝膠電泳儀(型號DYCZ-24DN，北京六一儀器廠)；成像系統(tǒng)(BIO-RAD，美國)，F(xiàn)ACS-Calibur流式細胞儀(BD公司，美國)。

1.3 A431細胞培養(yǎng) A431細胞購買于武漢巴菲爾生物有限公司，采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件為5% CO2、37℃、恒濕，顯微鏡觀察細胞生長至90%左右時，便可開始傳代培養(yǎng)。

1.4 A431細胞增殖實驗 將對數(shù)期A431細胞接種于96孔板，每孔1×104個細胞，培養(yǎng)過夜，然后加入10～200 μg/mL的Qu處理細胞24、48、72、96 h后，棄去舊培養(yǎng)液，每孔加入100 μL含10 μL的CCK8試劑的DMEM培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1.5 h，在酶標儀450 nm波長處檢測細胞吸光度OD值，并計算A431細胞相對活力。計算公式如下：細胞相對活力(%)=OD實驗組/OD對照組×100%。

1.5 細胞克隆實驗 將對數(shù)期A431細胞接種于6孔板，每孔1000個細胞，培養(yǎng)過夜，然后加入10～200 μg/mL的Qu處理細胞9 d后，每3 d更換一次含藥的新鮮培養(yǎng)液；然后對克隆細胞進行染色并計數(shù)。

1.6 BrdU ELISA實驗 將對數(shù)期A431細胞接種于96孔板，每孔1×104個細胞，培養(yǎng)過夜；Qu(10～200 μg/mL)處理細胞48 h后，加入BrdU試劑孵育12 h；再采用ELISA試劑盒檢測BrdU偶聯(lián)的細胞，并在酶標儀405 nm處測定其吸光度OD值。

1.7 細胞凋亡及周期檢測 將對數(shù)期A431細胞接種于6孔板，每孔5×104個細胞，培養(yǎng)過夜，然后加入10～200 μg/mL的Qu處理細胞48 h后，PBS清洗2次，收集細胞，采用2.0 mg/mL的PI染液和RNase I染色30 min，流式細胞儀立即檢測A431細胞周期分布情況。另外，收集細胞，PBS重懸后，分別加入Annexin-V FITC和PI處理細胞(按照試劑盒操作說明書進行)，最后用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.8 Western blotting實驗 收集各組細胞，每組加入200 μL的裂解液，置于冰上充分裂解30 min，收集細胞裂解液，12000 rpm、4 ℃條件下離心12 min，收集上清。BCA法檢測上清中總蛋白濃度，每孔上樣40 μg進行電泳分離，恒壓70 V，電泳3 h。然后在恒流275 mA條件下電轉(zhuǎn)70 min，5%脫脂牛奶封閉1 h后，將印跡膜放入對應的一抗溶液(稀釋比1∶1000)中，4℃搖床孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min，再把條帶放入盛二抗(稀釋比1∶3000)的平皿中室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。加入4 mL的ECL顯影液顯色3 min，凝膠成像系統(tǒng)曝光。

1.9 組蛋白DNA水平檢測 收集各組細胞，每組加入200 μL的裂解液，置于冰上充分裂解30 min，收集細胞裂解液，12000 rpm、4℃條件下離心12 min，收集上清。然后采用組蛋白DNA ELISA試劑盒分析細胞凋亡情況，酶標儀405 nm處測定其吸光度OD值。

1.10 Caspase活性試驗 收集Qu處理后的各組A431細胞，采用Caspase-glot-3/-9活性測定試劑盒檢測Caspase-3/9活性，酶標儀在405 nm處測定其吸光度值。

1.11 S1P水平檢測 收集Qu處理后的各組A431細胞，充分裂解后，離心，收集上清。取20 μg細胞裂解液與20 mM的D-erythro-Sphingosine(溶于0.1% Triton X-100)、2 mmol/L的ATP和[Y-32P]ATP在37℃條件下反應30 min。然后，加入20 mL的HCl終止反應；再加入氯仿/甲醇/HCl(100∶200∶1，v/v)，充分振蕩、離心；采用薄層色譜法(溶劑為氯仿/丙酮/甲醇/乙酸/水(10∶4∶3∶2∶1,v/v))分離S1P，采用閃爍計數(shù)器對其進行定量。

1.12 神經(jīng)酰胺水平檢測 收集各組細胞裂解液，采用神經(jīng)酰胺ELISA試劑盒檢測分析A431細胞中神經(jīng)酰胺水平，其操作步驟嚴格按照說明書進行。

1.13 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較采用單因素方差分析檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 槲皮黃酮抑制A431細胞活力、周期及增殖 為了觀察槲皮黃酮對人皮膚鱗狀細胞癌細胞A431生長的影響，CCK8法檢測了A431細胞活力，發(fā)現(xiàn)槲皮黃酮呈時間和濃度依賴性抑制槲皮黃酮細胞活力(P<0.05)，見圖1a。進一步對A431細胞克隆分析發(fā)現(xiàn)，槲皮黃酮處理細胞9 d后，藥物呈濃度依賴性抑制細胞克隆(P<0.05)，見圖1b。采用BrdU聯(lián)合ELISA法分析了A431細胞增殖情況，發(fā)現(xiàn)槲皮黃酮呈濃度依賴性抑制細胞增殖(P<0.05)，見圖1c。對A431細胞分析發(fā)現(xiàn)，G1期的A431細胞數(shù)明顯增多，而S期和G2期細胞數(shù)明顯減少，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1d。

2.2 槲皮黃酮誘導A431細胞凋亡 槲皮黃酮能夠誘導A431細胞凋亡，主要表現(xiàn)在槲皮黃酮明顯抑制抗凋亡蛋白t-PARP表達，誘導促凋亡蛋白Cle-PARP和Cle-caspase3表達，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2a；同時，槲皮黃酮明顯增強Caspase-3和Caspase-9活性，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2b。另外，槲皮黃酮還能明顯誘導A431細胞中組蛋白DNA水平，并顯著增強細胞凋亡率，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2c、2d。

2.3 槲皮黃酮調(diào)節(jié)A431細胞中Akt/S6K1和JNK信號傳導 槲皮黃酮呈濃度依賴性的誘導A431細胞中神經(jīng)酰胺積累，抑制S1P水平，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3a、3b。進一步分析了槲皮黃酮對A431細胞中Akt/S6K1和JNK信號通路的影響，發(fā)現(xiàn)槲皮黃酮明顯抑制Akt和S6K1的磷酸化水平，明顯誘導JNK1/2蛋白的磷酸化，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3c、3d。

注：與對照組比較，*P<0.05

圖1槲皮黃酮抑制A431細胞活力、細胞周期進展和增殖

注：與對照組比較，*P<0.05

注：與對照組比較，*P<0.05

2.4 槲皮黃酮通過Akt/S6K1和JNK信號通路調(diào)節(jié)A431細胞生長 為了觀察槲皮黃酮是否通過Akt/S6K1和JNK信號通路調(diào)節(jié)A431細胞生長，實驗采用了Akt激動劑SC79、S1P和JNK抑制劑SP600125與Qu共同干預細胞，發(fā)現(xiàn)槲皮黃酮能明顯降低細胞活力，增加細胞凋亡(P<0.05)，見圖4；另外，SC79、S1P和SP600125與Qu共同處理細胞后，發(fā)現(xiàn)A431細胞活力相比于單純Qu組明顯增高，而細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。由此說明，槲皮黃酮可通過Akt/S6K1和JNK信號通路調(diào)節(jié)A431細胞生長。

2.5 槲皮黃酮對Sphk2信號的影響 進一步檢測了槲皮黃酮對Sphk2信號通路的影響，發(fā)現(xiàn)藥物呈濃度依賴性的抑制Sphk2蛋白表達(P<0.05)。接著采用SiRNA對Sphk2基因進行過表達和沉默發(fā)現(xiàn)，Qu+Sphk2 mimics組細胞活力相比于單純Qu組明顯增高，細胞凋亡明顯降低(P<0.05)；Qu+Sphk2 inhibitor組細胞活力相比于單純Qu組明顯降低，Qu+Sphk2 inhibitor組細胞凋亡明顯增高(P<0.05)，說明Sphk2過表達能部分逆轉(zhuǎn)槲皮黃酮對A431細胞增殖的抑制作用；另外，Qu+Sphk2 mimics組S1P水平相比于單純Qu組明顯升高，Qu+Sphk2 inhibitor組S1P水平明顯降低(P<0.05)。Qu+Sphk2 mimics組p-Akt和p-S6K1表達水平相比于單純Qu組升高，而p-JNK1/2表達水平降低；Qu+Sphk2 inhibitor組p-Akt和p-S6K1表達水平降低，p-JNK1/2表達水平升高，說明Sphk2過表達能部分逆轉(zhuǎn)Qu對Akt/S6K1信號的抑制作用及對JNK信號的激活作用(圖5)。

注：與對照組比較，*P<0.05；與Qu組比較，#P<0.05

圖4SC79、S1P和SP600125對A431細胞活力和凋亡的影響圖5槲皮黃酮對Sphk2信號傳導的影響

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)鱗狀細胞癌和基底細胞癌患者組織中Sphk2信號通路處于高度活化的狀態(tài)，提示該信號通路參與了皮膚癌的發(fā)病機制[11]。Sphk2在SCC的發(fā)生中起著重要的致癌功能，其過表達誘導了腫瘤的惡化及化療或放療的耐藥。早期研究報道在皮膚黑素細胞、角質(zhì)細胞和成纖維細胞中Sphk2表達量非常低，而在原代SCC細胞和細胞系中Sphk2呈高表達狀態(tài)[11]，其可成為SCC治療的靶點。

Qu屬于一種藥理活性較強的天然成分，在多種病理反應中均起著較好的作用。研究發(fā)現(xiàn)槲皮黃酮不僅對多種致癌劑、促癌劑有拮抗作用，而且可以抑制多種惡性腫瘤細胞的生長；并且Qu對人卵巢癌細胞、乳腺癌細胞、肝癌細胞、結(jié)腸癌細胞、前列腺癌細胞等生長均有較好的抑制作用[12]。本實驗發(fā)現(xiàn)Qu對A431細胞具有抗生存、抗增殖和促凋亡的藥理活性，提示Qu可能成為治療SCC的潛在藥物。

Akt/S6K1和JNK信號通路參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[13,14]，并且在皮膚癌組織中發(fā)現(xiàn)Akt信號通路異?；罨癑NK信號傳導的異常失活[15,16]，并且該信號傳導與多個關鍵的癌變行為關系密切，包括腫瘤細胞存活、增殖、遷移、細胞凋亡抵抗、癌細胞轉(zhuǎn)移及血管生成和轉(zhuǎn)化等[13,14]。因此這兩個通路在皮膚癌的治療和預防中常被作為靶點[17]。本實驗發(fā)現(xiàn)Qu可以顯著抑制A431細胞中Akt/S6K1信號傳導，并激活JNK信號通路。采用分子靶標藥物對Akt信號進行抑制，在體內(nèi)外實驗中均表現(xiàn)出較好的抗SCC的作用[18]。Qu對Akt/S6K1信號通路進行抑制，可能是其誘導SCC細胞凋亡的原因之一；采用Akt特異性激動劑SC79處理細胞時，可明顯減弱Qu誘導腫瘤細胞凋亡的活性。SphK2基因沉默能誘導神經(jīng)酰胺的積累，還會誘導Akt的去磷酸化[19]。同樣，Qu處理A431細胞在降低Akt/S6K1信號傳導時伴隨著S1P水平的降低，與前期報道結(jié)果類似[20]。早期研究也表明，Qu可通過抑制Akt信號傳導進而降低乳腺癌細胞侵襲[21]，也可通過降低S6K1磷酸化水平抑制增殖表皮癌細胞生長[22]；另外，Qu可通過調(diào)節(jié)JNK信號活化誘導結(jié)腸癌細胞凋亡[23]。既往研究已證實，Akt/S6K1和JNK通路為SphK2的下游信號[11,24]，本文研究也發(fā)現(xiàn)過表達SphK2能部分逆轉(zhuǎn)Qu對Akt/S6K1信號的抑制作用及對JNK信號的激活作用。

另外，Qu處理A431細胞可以明顯激活JNK信號通路，進而誘導腫瘤細胞凋亡。當采用JNK信號通路的特異性抑制劑SP600125與Qu共同處理細胞時，降低了Qu對A431細胞凋亡的誘導作用。A431細胞中JNK的激活可能是神經(jīng)酰胺積累所引起的，也可能是Qu抑制SphK2表達的效應分子。已有研究提出神經(jīng)酰胺能誘導JNK信號通路活化，進而促使腫瘤細胞凋亡；對JNK信號通路進行抑制可以明顯改善神經(jīng)酰胺誘導的細胞凋亡[25]。Qu降低A431細胞中SphK2表達可以誘導神經(jīng)酰胺的產(chǎn)生，促使皮膚癌細胞的凋亡。綜上所述，Qu可通過抑制Sphk2信號通路降低SCC細胞的增殖活性。