余光輝,向宇,宮雅昕,李剛

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，南方少數(shù)民族地區(qū)生物資源保護(hù)與綜合利用聯(lián)合工程中心，武漢 430074)

根毛是根部表皮細(xì)胞分化形成的一種單細(xì)胞管狀物, 根毛可以增加根的表面積,有助于植物對(duì)水分和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收以及植物在土壤中的固定[1].

γ-氨基丁酸(GABA)是一種含有四碳的非蛋白氨基酸[8],研究發(fā)現(xiàn)植物在脅迫的條件下，GABA可以作為一種代謝物積累,并抑制ROS的產(chǎn)生[9].此外GABA還可以作為一種信號(hào)分子誘導(dǎo)氣孔的關(guān)閉[10].

為研究GABA在擬南芥根毛發(fā)育中的調(diào)控作用，本研究以擬南芥特異性表達(dá)的GABA合成酶基因突變體(gad1)的根為材料,通過外源施加GABA，對(duì)根部活性氧進(jìn)行染色和對(duì)活性氧合成及清除相關(guān)基因表達(dá)水平的分析,探討GABA和根毛發(fā)育調(diào)控的潛在機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

擬南芥(Arabidopsisthaliana)包括野生型Columbia(Col)和內(nèi)源性GABA合成突變體(gad1).

將擬南芥的種子用氯氣消毒2～3 h. 在超凈臺(tái)中,用無菌牙簽將擬南芥種子分別接種于1/2MS和含有不同濃度GABA的1/2MS(pH=5.8)固體培養(yǎng)基上,用膠帶對(duì)方形塑料培養(yǎng)皿(10 cm×10 cm)進(jìn)行密封,放于4 ℃冰箱，春化2 d. 然后放入溫室(16 h/8 h光/暗循環(huán),溫度22 ℃)垂直培養(yǎng)8 d.

1.2 擬南芥根部根毛形態(tài)及長(zhǎng)度的測(cè)量

將擬南芥幼苗(8 d)培養(yǎng)皿置于體視顯微鏡(V8,德國蔡司)下,對(duì)距根尖前8 mm區(qū)域上的根毛進(jìn)行拍照. 用軟件SPOT Advanced對(duì)根毛長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)量(每條根上選取25～30個(gè)完全伸長(zhǎng)的根毛的進(jìn)行統(tǒng)計(jì)). 每個(gè)株系統(tǒng)計(jì)20株以上的幼苗.

1.3 活性氧(ROS)染色觀察

植物體內(nèi)活性氧(ROS)的水平可以通過H2DCFDA(2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate)熒光探針進(jìn)行檢測(cè)[11]. H2DCFDA進(jìn)入細(xì)胞后能被活性氧基團(tuán)分解為DCF而產(chǎn)生熒光,其熒光強(qiáng)度與活性氧濃度成正比.

將生長(zhǎng)8 d的擬南芥幼苗放入含有10 μmol·L-1H2DCFDA染液的溶液中,避光孵育1 h. 隨后用蒸餾水沖洗3次,將染好的幼苗制片后放入IX73熒光顯微鏡(日本奧林巴斯 )的載物臺(tái)上,在相同的曝光時(shí)間和背景下觀察熒光并拍照.

1.4 超氧陰離子染色

將8 d齡的擬南芥幼苗置于含有2 mmol·L-1NBT(氮藍(lán)四唑)的磷酸鹽緩沖液(pH=6.1)中[12]. 避光染色15 min,用蒸餾水沖洗,將染好的幼苗制片后放入IX73熒光顯微鏡下觀察并拍照.

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

采用AxyPrep總RNA小量制備試劑盒(康寧公司)提取擬南芥根部總RNA,利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Goldenstartm RT6)用于cDNA的合成. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用2×T5 Fast qRT-PCR Mix (SYBR Green Ⅰ)試劑盒(北京擎科),操作按照說明書進(jìn)行,引物參見表1. 用MyGo Pro 定量PCR儀 (英國IT-IS公司)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR,反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性1 min,95 ℃變性10 s,53 ℃退火15 s,72 ℃延伸10～15 s,40次循環(huán). 基因相對(duì)表達(dá)水平用2-ΔΔCq進(jìn)行計(jì)算分析.

表1 本研究所用的引物Tab.1 Primers used in this study

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

根毛長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)每組實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次,每次統(tǒng)計(jì)9棵擬南芥幼苗. 利用SPSS 23軟件對(duì)統(tǒng)計(jì)的根毛長(zhǎng)度及qRT-PCR結(jié)果進(jìn)行顯著性分析(t-檢驗(yàn)),用Image J軟件對(duì)熒光和染色強(qiáng)度進(jìn)行量化.

2 結(jié)果與分析

2.1 gad1突變體根毛長(zhǎng)度高于野生型

在培養(yǎng)基(1/2MS)上垂直生長(zhǎng)8 d后,測(cè)量野生型和gad1突變體根毛的長(zhǎng)度. 野生型根毛平均長(zhǎng)度為490 μm,gad1突變體根毛平均長(zhǎng)度為700 μm, 是野生型的1.5倍, 顯著大于野生型(P<0.05) (圖1A～C). 說明GABA合成缺陷促進(jìn)了擬南芥根毛的頂端生長(zhǎng),導(dǎo)致其根毛的長(zhǎng)度增加.

A)8 d齡的野生型擬南芥初生根和根毛;B)8 d齡的gad1突變體初生根和根毛;Bar=1 mm;C)根毛長(zhǎng)度的測(cè)量，各柱形圖上不同小寫字母標(biāo)識(shí)表示數(shù)據(jù)間差異顯著(P<0.05)圖1 野生型和gad1突變體的根毛長(zhǎng)度Fig.1 Root hair length of wild type and gad1 mutants

2.2 外源性GABA抑制野生型根毛伸長(zhǎng)

用不同濃度的GABA處理野生型擬南芥,在生長(zhǎng)8 d后在體視顯微鏡下觀察根毛生長(zhǎng)情況. 結(jié)果表明, 不同濃度的外源GABA (1、10、100和1000 μmmol·L-1)的添加均顯著抑制了野生型擬南芥根毛的生長(zhǎng)，處理組長(zhǎng)度明顯低于對(duì)照組,分別比對(duì)照組降低了44.8%、53.9%、57.1%、73%，抑制呈現(xiàn)明顯的劑量依賴效應(yīng)(P<0.05)(圖2，A～F).

A)、B)、C)、D)和E)分別為0、1、10、100和1000 μmol·L-1 GABA處理后生長(zhǎng)8 d的野生型擬南芥,Bar =1 mm; F) 不同濃度GABA處理下野生型擬南芥根毛長(zhǎng)度的測(cè)量，各柱形圖上不同小寫字母標(biāo)識(shí)表示數(shù)據(jù)間差異顯著(P<0.05)圖2 不同濃度GABA處理下野生型擬南芥根毛的長(zhǎng)度Fig.2 Length of root hair of wild type Arabidopsis thaliana treated with different concentrations of GABA

2.3 外源 GABA一定程度上抑制gad1突變體的根毛生長(zhǎng)

為進(jìn)一步證實(shí)根毛生長(zhǎng)和GABA代謝的關(guān)系,用外源GABA處理gad1突變體.結(jié)果表明,10 μmol·L-1GABA處理情況下,gad1突變體中快速生長(zhǎng)的根毛生長(zhǎng)得到顯著抑制, 其長(zhǎng)度也短于野生型(P<0.05)(圖3，A～E). 以上結(jié)果說明GABA代謝參與了擬南芥根毛生長(zhǎng)的調(diào)節(jié).

2.4 gad1突變體根部ROS的水平高于野生型

活性氧(ROS)是調(diào)控根毛發(fā)育的重要信號(hào)[2].為證實(shí)gad1根毛生長(zhǎng)和ROS的關(guān)系，用H2DCFDA探針來檢測(cè)ROS的水平.在培養(yǎng)8 d的野生型擬南芥和gad1突變體進(jìn)行H2DCFDA標(biāo)記后,在根尖和根毛區(qū)都觀察到ROS的熒光分布,但gad1突變體中ROS的熒光信號(hào)強(qiáng)度明顯高于野生型(P<0.05) (圖4A～D;E,F).上述結(jié)果表明,ROS介導(dǎo)了gad1突變體根毛伸長(zhǎng)的過程.

2.5 gad1突變體根部超氧陰離子水平高于野生型

A) 1/2MS培養(yǎng)基上野生型生長(zhǎng)的根;B) 1/2MS培養(yǎng)基上gad1突變體生長(zhǎng)的根; C)添加10 μmol ·L-1 GABA的生長(zhǎng)的野生型的根; D)添加10 μmol ·L-1 GABA的生長(zhǎng)的gad1突變體的根,Bar =1 mm; E) 根毛長(zhǎng)度的統(tǒng)計(jì)，各柱形圖上不同小寫字母標(biāo)識(shí)表示數(shù)據(jù)間差異顯著(P<0.05)圖3 10 μmol·L-1GABA處理下gad1突變體根毛的長(zhǎng)度Fig.3 Length of root hair of gad1 mutant treated with 10 μmol ·L-1 GABA

A)、C)分別代表野生型和gad1突變體擬南芥根尖的ROS染色結(jié)果;B)、D)分別代表野生型和gad1突變體根毛區(qū)的ROS染色結(jié)果， Bar =50 μm;E)、F)根尖和根毛尖端平均熒光強(qiáng)度的量化統(tǒng)計(jì)，各柱形圖上不同小寫字母標(biāo)識(shí)表示數(shù)據(jù)間差異顯著(P<0.05)圖4 根尖和根毛區(qū)ROS的分布Fig.4 Distribution of ROS in root tip and root hair region

A)、B)分別為野生型和gad1突變體根尖NBT染色的結(jié)果;C)、D)分別為野生型和gad1突變體根毛區(qū)域NBT染色的結(jié)果， Bar=100 μm,箭頭指向根毛尖端; E)根毛尖端NBT染色信號(hào)的量化統(tǒng)計(jì)，各柱形圖上不同小寫字母標(biāo)識(shí)表示數(shù)據(jù)間差異顯著(P<0.05)圖5 根部的NBT染色Fig.5 NBT staining for in root

2.6 外源GABA抑制根毛尖端ROS的產(chǎn)生

A)、B)分別為根毛尖端ROS熒光染色和NBT染色信號(hào)的量化統(tǒng)計(jì)，各柱形圖上不同小寫字母標(biāo)識(shí)表示數(shù)據(jù)間差異顯著(P<0.05)圖6 外源GABA對(duì)根毛尖端ROS熒光染色和NBT染色的抑制效應(yīng)Fig.6 Inhibition of exogenous GABA on the staining of ROS fluorescence and NBT staining for

2.7 根部ROS合成及清除相關(guān)基因的表達(dá)變化

各柱形圖上不同小寫字母標(biāo)識(shí)表示數(shù)據(jù)間差異顯著(P<0.05)圖7 野生型和gad1突變體根部合成及清除ROS基因的表達(dá)變化Fig.7 Gene expression involving in synthesis and scavenging ofROS in the roots of wild type and gad1 mutants

2.8 外源GABA誘導(dǎo)根部ROS清除基因的表達(dá)

各柱形圖上不同小寫字母標(biāo)識(shí)表示數(shù)據(jù)間的差異顯著(P<0.05)圖8 外源GABA處理對(duì)ROS清除基因表達(dá)的影響Fig.8 Effect of exogenous GABA treatment on the expression of ROS scavenging genes

3 討論

根毛是植物吸收土壤水分和營養(yǎng)的關(guān)鍵器官,根毛的發(fā)育直接關(guān)系到植物吸收養(yǎng)分的能力. 研究表明,γ-氨基丁酸(GABA)在植物細(xì)胞中產(chǎn)生，具有調(diào)控生長(zhǎng)和抗逆性的作用[13].本文利用GABA合成突變體gad1及外源性GABA的添加證明了GABA在擬南芥根毛生長(zhǎng)中的調(diào)控作用.

脅迫條件下, GABA與ROS有著密切的聯(lián)系.脅迫導(dǎo)致線粒體中的ROS水平升高從而激活GABA的產(chǎn)生,大量積累的GABA又會(huì)對(duì)ROS進(jìn)行清除[15]. 研究表明,在萵苣幼苗中,外源GABA的應(yīng)用可以降低ROS的產(chǎn)生,使自身的耐鹽性增強(qiáng)[16]. 在大麥幼苗中,鋁和質(zhì)子的脅迫會(huì)造成大麥的氧化損傷,外源GABA的添加可以減輕這種損傷[17].所以在脅迫的條件下, GABA確實(shí)可以作為一種抑制ROS產(chǎn)生的調(diào)節(jié)器發(fā)揮功能;前期的研究證實(shí)了外源GABA對(duì)ROS具有抑制和清除效應(yīng)[9,18].