孫 燕，楊 峰，李成忠

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院 園林園藝學(xué)院，江蘇 泰州 225300）

白背三七（Gynura divaricataL.）為菊科菊三七屬多年生草本植物，又名白子菜、明月草、大肥牛等，原產(chǎn)于廣西、福建一帶潮濕的陰地上[1]。白背三七莖葉中含有豐富的粗蛋白、粗纖維、礦物質(zhì)、維生素等營(yíng)養(yǎng)素，我國(guó)南方民間常以白背三七為上等野菜食用；同時(shí)《中藥大辭典》記載，白背三七味辛、淡，性平，具有清熱涼血、活血止痛、止血等功效，對(duì)高血壓、糖尿病、高血脂等癥狀能起到良好的改善作用。由于同時(shí)具有良好的食、藥兼用特性，且扦插繁殖系數(shù)高、生長(zhǎng)迅速，近年來(lái)長(zhǎng)江中下游地區(qū)陸續(xù)出現(xiàn)白背三七大面積的種苗生產(chǎn)和栽培。研究表明，白背三七含有大量的活性多糖、類黃酮、萜類、生物堿等天然有效成分[2-4]，可全草入藥。目前，關(guān)于白背三七的研究大多集中于活性多糖提取和功能性上[5-8]，而針對(duì)該植物另外一種主要活性成分類黃酮的研究較少[9-10]。

類黃酮化合物是植物在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的一類次生代謝產(chǎn)物，主要貯藏在葉片之中，是藥用植物的主要活性成分之一?，F(xiàn)在醫(yī)學(xué)研究表明，黃酮類化合物具有抗氧化、抑制癌細(xì)胞增殖，消除炎癥、降低血糖、血脂等生理活性[11-14]，是制備功能性食品和開(kāi)發(fā)高效低毒天然藥物的重要原材料。類黃酮化合物一般難溶水，易溶于石油醚、正丁醇、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑；因分子中多有酚羥基而呈酸性，故可溶于稀堿液，常見(jiàn)的提取方法有有機(jī)溶劑萃取法、醇提取法、堿法及超臨界流體（CO2）萃取法[15-16]。有機(jī)溶劑萃取雖然操作方便，提取率高，但產(chǎn)品中容易混入較多雜質(zhì)，分離困難；堿法提取雜質(zhì)較少，提取物純度高，但提取率較低；超臨界流體萃取需要在高壓的環(huán)境下進(jìn)行，對(duì)設(shè)備的要求高，提取成本大；醇提取法設(shè)備要求簡(jiǎn)單，產(chǎn)物雜質(zhì)少，提取率高等優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是甲醇具有揮發(fā)性和毒性[17]。因此，本研究采用無(wú)毒性的乙醇水溶液作為溶劑，對(duì)白背三七類黃酮化合物進(jìn)行提取，并采用單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝條件，旨在為白背三七深加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白背三七鮮葉：采自江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院園林園藝學(xué)院校內(nèi)實(shí)訓(xùn)基地（2017年8月）；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）：上海伊卡生物技術(shù)有限公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇、過(guò)硫酸鉀（均為分析純）：中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204-型分析天平：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；THZ-82A水浴恒溫振蕩器：江蘇榮華儀器制造有限公司；6L-冷凍干燥機(jī)：美國(guó)LABCONCO公司；SP-2100UV紫外分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；ELTA-320精密pH計(jì)：梅特勒-托利多中國(guó)有限公司；TGL-16MB高速離心機(jī)：長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；TF101-2電熱鼓風(fēng)干燥箱：蘇州同福烘箱制造有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 白背三七類黃酮提取工藝

白背三七鮮葉低溫烘干（45 ℃、12 h）后，粉碎過(guò)60目篩。準(zhǔn)確稱取一定量樣品粉末于錐形瓶中，按不同料液比加入乙醇溶液，水浴振蕩提取一定時(shí)間后過(guò)濾，將濾液真空濃縮至黏稠態(tài)，冷凍干燥后即得白背三七類黃酮提取物凍干粉，置冰箱冷藏備用[18]。

1.3.2 提取工藝條件優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)：?jiǎn)我蛩卦囼?yàn)主要考察不同料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g∶mL））、乙醇體積分?jǐn)?shù)（45%、55%、65%、75%、85%、95%）、提取溫度（45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃）和提取時(shí)間（30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min）對(duì)白背三七類黃酮得率的影響。

（2）正交試驗(yàn)：在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定不同因素的水平范圍，以類黃酮得率為考察指標(biāo)，進(jìn)行4因素3水平L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化白背三七最佳的提取工藝組合，各因素與水平見(jiàn)表1。

表1 提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for extraction technology optimization

1.3.3 白背三七類黃酮化合物的測(cè)定

類黃酮化合物的測(cè)定采用分光光度法[19]。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：配制不同質(zhì)量濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，以亞硝酸鈉-硝酸鋁為顯色劑，采用分光光度法于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度值[19]。以蘆丁質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)、吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線；標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=11.436x+0.000 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 5，說(shuō)明蘆丁在質(zhì)量濃度為0～0.06mg/mL范圍內(nèi)，有良好的線性關(guān)系。

白背三七類黃酮化合物得率：準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量白背三七類黃酮提取物，用體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇溶液定容于25 mL比色管中，混合均勻，于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度值，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中類黃酮化合物的含量。白背三七類黃酮化合物得率計(jì)算公式如下：

式中：M為白背三七葉干粉質(zhì)量，g；N為類黃酮提取物的質(zhì)量，g；X為提取物中類黃酮含量，%。

2 結(jié)果與分析

2.1 白背三七類黃酮提取工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)類黃酮得率的影響

準(zhǔn)確稱取10 g白背三七葉干粉6份放入500 mL燒杯，按照料液比1∶20（g∶mL）分別加入不同體積分?jǐn)?shù)（45%、55%、65%、75%、85%、95%）乙醇溶液，60 ℃水浴振蕩提取90 min后過(guò)濾，將濾液真空濃縮至黏稠態(tài)，冷凍干燥后測(cè)定類黃酮得率。不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)白背三七類黃酮得率的影響如圖1所示。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)類黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of flavonoids

乙醇溶液是從植物中提取類黃酮的最常用溶劑。提取過(guò)程中，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)類黃酮的提取效果具有較大影響：一般認(rèn)為高濃度的乙醇溶液適用于黃酮苷元的提取，低濃度乙醇溶液有利黃酮苷類物質(zhì)的溶出。因此，選擇合適的乙醇濃度可以提高類黃酮的得率。由圖1可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)在45%～75%范圍內(nèi)，類黃酮得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增大；乙醇體積分?jǐn)?shù)增加至75%時(shí)，類黃酮得率達(dá)到最大值（3.36%）；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)＞75%之后，類黃酮得率明顯降低，主要由于高濃度的乙醇溶液使得一些醇溶性雜質(zhì)、色素及親脂性強(qiáng)的成分溶出量增加，同類黃酮化合物競(jìng)爭(zhēng)與乙醇-水分子溶液體系結(jié)合，導(dǎo)致類黃酮類化合物的得率不升反降。因此，白背三七類黃酮提取適宜的乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%。

2.2.2 料液比對(duì)類黃酮得率的影響

準(zhǔn)確稱取10 g白背三七葉干粉6份放入500 mL燒杯，按照1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g∶mL）等不同料液比分別加入體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液，60 ℃水浴振蕩提取90 min后過(guò)濾，將濾液真空濃縮至黏稠態(tài)，冷凍干燥后測(cè)定白背三七類黃酮得率。不同料液比對(duì)白背三七類黃酮得率的影響如圖2所示。

圖2 不同料液比對(duì)類黃酮得率的影響Fig.2 Effect of different material-liquid ratio on the yield of flavonoids

類黃酮化合物是以黃酮（2-苯基色原酮）為母核而衍生的一類植物次生代謝產(chǎn)物，其中包括黃酮的同分異構(gòu)體及其氫化和還原產(chǎn)物，即以C6-C3-C6為基本碳架的一系列化合物。在植物體內(nèi)大部分與糖結(jié)合成苷類或以碳糖基的形式存在，也有的以游離形式存在。類黃酮乙醇溶液中的溶解度與其化學(xué)組成密切相關(guān)[20]。由圖2可知，料液比在1∶10～1∶20（g∶mL）范圍內(nèi)，類黃酮得率快速提高；當(dāng)料液比達(dá)到1∶25（g∶mL），類黃酮得率達(dá)最大值（3.43%）；繼續(xù)增大提取液的比例，類黃酮得率略有下降，主要原因可能為乙醇溶液例比過(guò)大時(shí)，白背三七中其他組分溶出增加，降低了類黃酮物質(zhì)提取率。因此，白背三七類黃酮提取適宜的料液比為1∶25（g∶mL）。

2.2.3 提取溫度對(duì)類黃酮得率的影響

準(zhǔn)確稱取10 g白背三七葉干粉6份放入500 mL燒杯，按照料液比1∶25（g∶mL）加入體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液，分別在45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃水浴條件下振蕩提取90 min后過(guò)濾，將濾液真空濃縮至黏稠態(tài)，冷凍干燥后測(cè)定白背三七類黃酮得率。不同提取溫度對(duì)白背三七類黃酮得率的影響如圖3所示。

由圖3可知，提取溫度在45～60 ℃范圍內(nèi)，類黃酮得率隨提取溫度的增高而增大；提取溫度在60 ℃時(shí)，類黃酮得率達(dá)最大值（3.27%）；當(dāng)提取溫度＞60 ℃之后，類黃酮得率降低，且提取液顏色變深，主要原因可能為部分類黃酮化合物發(fā)生氧化反應(yīng)，分子中3位羰基、酚羥基及分子內(nèi)氫鍵等結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致少量類黃酮損失。此外，溫度過(guò)高會(huì)增加蛋白質(zhì)、糖類等水溶性雜質(zhì)溶出，對(duì)類黃酮苷形成“包裹”，從而減少了類黃酮的溶出[21]。因此，白背三七類黃酮適宜的提取溫度為60 ℃。

圖3 提取溫度對(duì)類黃酮得率的影響Fig.3 Effect of extracting temperature on the yield of flavonoids

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)類黃酮得率的影響

準(zhǔn)確稱取10 g白背三七葉干粉6份放入500 mL燒杯，按照料液比1∶25（g∶mL）加入體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液，60 ℃水浴條件下分別提取30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min后過(guò)濾，將濾液真空濃縮至黏稠態(tài)，冷凍干燥后測(cè)定白背三七類黃酮得率。不同提取時(shí)間對(duì)白背三七類黃酮得率的影響如圖4所示。

圖4 提取時(shí)間對(duì)類黃酮得率的影響Fig.4 Effect of extracting time on the yield of flavonoids

由圖4可知，提取時(shí)間在30～120 min時(shí)，類黃酮得率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增大；當(dāng)浸提時(shí)間為120 min時(shí)，類黃酮得率達(dá)3.36%；繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，類黃酮得率無(wú)明顯提高，表明浸提120 min，類黃酮幾乎完全溶出，但繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間會(huì)增大能耗。因此，白背三七類黃酮適宜的提取時(shí)間為120 min。

2.3 提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以類黃酮得率為考察指標(biāo)，采用4因素3水平L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化白背三七類黃酮提取工藝，試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表2。

由表2可知，在試驗(yàn)確定水平范圍內(nèi)，各因素對(duì)類黃酮得率的影響大小依次為A（乙醇體積分?jǐn)?shù)）＞D（提取溫度）＞B（料液比）＞C（提取時(shí)間）；類黃酮最優(yōu)工藝組合為A3B2C2D2，即乙醇體積分?jǐn)?shù)85%，料液比1∶25（g∶mL），提取時(shí)間120 min，提取溫度60 ℃。在此優(yōu)化條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，類黃酮平均得率為3.81%。

表2 提取工藝條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for extraction technology optimization

在試驗(yàn)選定的水平范圍內(nèi)，提取時(shí)間對(duì)白背三七類黃酮得率的影響較?。O差最?。云渥髡`差項(xiàng)，采用SPSS16.0對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表3可知，試驗(yàn)?zāi)Ｐ虵值為119.94，產(chǎn)生誤差的可能性只有0.008，具有顯著性。決定系數(shù)R=0.997，說(shuō)明試驗(yàn)?zāi)Ｐ团c實(shí)際試驗(yàn)結(jié)果具有高度的擬合性（P＜0.05），可以用此模型來(lái)預(yù)測(cè)和分析白背三七類黃酮提取過(guò)程中得率與影響因素之間的關(guān)系[20]。乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)類黃酮得率影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），提取溫度對(duì)類黃酮得率均具有顯著影響（P＜0.05），料液比對(duì)類黃酮得率影響不顯著（P＞0.05）。由此可知，白背三七類黃酮提取過(guò)程中，適宜的乙醇體積分?jǐn)?shù)是獲得高得率類黃酮的關(guān)鍵因素。

3 結(jié)論

通過(guò)試驗(yàn)考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間、提取溫度對(duì)白背三七類黃酮得率的影響：料液比影響較小，乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度影響顯著。白背三七類黃酮的最佳提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)85%，料液比1∶25（g∶mL），提取時(shí)間120 min，提取溫度60 ℃。在此優(yōu)化條件下，類黃酮平均得率3.81%。研究結(jié)果可為白背三七的深加工和綜合開(kāi)發(fā)提高參考和依據(jù)。