何敏超，劉云云，陳小燕，許敬亮，閆志英，張金峰

（1.中國(guó)科學(xué)院 廣州能源研究所 中國(guó)科學(xué)院可再生能源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省新能源和可再生能源研究開發(fā)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510640；2.中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所 中國(guó)科學(xué)院環(huán)境與應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 環(huán)境微生物四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041；3.淮陰工學(xué)院江蘇省生物質(zhì)轉(zhuǎn)化與過程集成工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 淮安 223003）

木聚糖是被子植物細(xì)胞壁中半纖維素的主要成分，其含量?jī)H次于纖維素，是一種豐富的可再生資源。作為一種雜多糖，其主鏈由D-木糖以β-1,4-糖苷鍵連接而成，其側(cè)鏈由種類各異的糖基側(cè)鏈組成[1]。木聚糖酶是指能夠降解木聚糖的一組酶的總稱。根據(jù)對(duì)木聚糖作用方式的不同，分為β-1,4-外切木聚糖酶、β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶、β-木糖苷酶和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶等。狹義上的木聚糖酶僅限于β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶。木聚糖酶的來源相當(dāng)廣泛，已報(bào)道產(chǎn)木聚糖酶的微生物主要有曲霉屬、木霉屬、青霉屬、殼霉屬、芽孢桿菌和鏈霉菌等[2-5]。

木聚糖酶在食品、制漿造紙、飼料、生物能源等領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景。在食品行業(yè)中，木聚糖酶可有效改善面團(tuán)的持水性和穩(wěn)定性，增大烘烤后面包的體積，改善面包心質(zhì)地，降低面包的老化速率，延長(zhǎng)貨架壽命[6-7]。在制漿造紙領(lǐng)域中，它可用于紙漿漂白，提高紙漿白度并降低化學(xué)漂白劑的用量[8-10]。在飼料行業(yè)中，它可降低水溶性木聚糖導(dǎo)致的食糜黏性增高，同時(shí)木聚糖酶可作用于非淀粉多糖，破碎植物細(xì)胞壁，最終釋放出營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[11-12]。在生物能源領(lǐng)域中，木聚糖酶可以提升木糖的得率，增大總還原糖的量[13-14]。

國(guó)內(nèi)關(guān)于木聚糖酶的研究側(cè)重于產(chǎn)木聚糖酶菌株的篩選及選育[15-16]、基因工程菌的構(gòu)建[17-18]、培養(yǎng)條件的優(yōu)化等方面[19-20]。盡管高活力木聚糖酶菌株的研究報(bào)道較多，仍有必要對(duì)不同酶學(xué)性質(zhì)的高活力木聚糖酶菌株進(jìn)行研究。本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)室篩選出能發(fā)酵木聚糖酶的野生菌株進(jìn)行分子鑒定及固態(tài)發(fā)酵單因素優(yōu)化，并對(duì)木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步研究，為今后菌株大規(guī)模酶解預(yù)處理后農(nóng)業(yè)廢棄物原料提供前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

土壤樣品：采自廣西壯族自治區(qū)河池市環(huán)江縣木論自然保護(hù)區(qū)富含腐殖質(zhì)的土壤。

1.1.2 試劑

木聚糖（純度≥90%）：美國(guó)Sigma公司。D-木糖（純度≥99%）：上海源聚生物有限公司；3,5-二硝基水楊酸（純度≥98%）：上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。其他試劑均為市售分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：土豆200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L。

初篩培養(yǎng)基：木聚糖10.0 g/L，KNO31.0 g/L，MgSO40.5 g/L，NaCl 0.5 g/L，K2HPO40.5 g/L，瓊脂20 g/L，pH 6.0。

復(fù)篩培養(yǎng)基：玉米芯3.0 g/L，（NH）42SO41.4 g/L，KH2PO42.0 g/L，CaCl20.3 g/L，MgSO40.3 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 5 mg/L，CoCl220 mg/L，MnSO41.6 mg/L，ZnSO41.4 mg/L，pH 5.6。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米芯與麩皮3.6 g，固液比1∶2.5（g∶mL），液體為pH 5.6的Mandels營(yíng)養(yǎng)液[21]。Mandels營(yíng)養(yǎng)液為不加玉米芯的復(fù)篩培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

BIOTECK-EON酶標(biāo)儀：基因有限公司；HH-S8數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇金怡儀器科技有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱、HCQ-X300C恒溫振蕩器：上海一恒科技有限公司；JG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)木聚糖酶菌株的篩選

（1）初篩：在50 mL無菌生理鹽水中加入1.0 g土樣，搖床振蕩60 min，使得土樣中的微生物充分混于液體中。取1 mL搖勻的液體置于15 mm×150 mm試管中，加入9 mL無菌生理鹽水，搖勻后梯度稀釋至10-6。分別吸取10-3、10-4、10-5和10-64個(gè)稀釋度的菌懸液0.25 mL涂布于初篩培養(yǎng)基上，放入恒溫培養(yǎng)箱30 ℃倒置培養(yǎng)，在48 h到96 h觀察水解圈大小，選擇水解圈與菌落圈直徑比值較大的菌落進(jìn)行純化、保藏和后續(xù)研究。

（2）復(fù)篩：將初篩得到的菌株接種于種子培養(yǎng)基中，150 r/min、30 ℃培養(yǎng)72 h后以2.5%接種量接種至復(fù)篩培養(yǎng)基中，于相同條件下?lián)u瓶培養(yǎng)4 d，5 d，6 d，吸取1 mL發(fā)酵液稀釋到適當(dāng)倍數(shù)測(cè)定木聚糖酶活力。篩選出木聚糖酶酶活力超過500 IU/mL的菌株。

1.3.2 菌種的分子生物學(xué)鑒定

采用改良十六烷基三甲基溴化銨（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法提取菌株總脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），選擇擴(kuò)增真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列的通用引物ITS1：5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG CG-3'和ITS4：5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3'對(duì)曲霉SM24/a總DNA進(jìn)行序列擴(kuò)增。在20 μL的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）體系中含有10×緩沖體系（Buffer）2 μL（含MgCl2，2.5 mmol/L），脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（10 mmol/L）0.4 μL，上下游引物量為10 pmol，Taq酶（5 U/μL）0.2 μL，約50 ng的模板DNA，其余體積以無菌超純水補(bǔ)足。

PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，52 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行割膠回收，并測(cè)序。將該序列與美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行基本局部比對(duì)搜索工具（basiclocalalignmentsearch tool，BLAST）比較分析，并從數(shù)據(jù)庫獲得相關(guān)種屬的18S核糖體DNA（ribosome deoxyribonucleic acid，rDNA）序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 培養(yǎng)基組分單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

在初始固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基（玉米芯與麩皮的總質(zhì)量為3.6 g，固液比1∶2.5（g∶mL），液體為pH 5.6的Mandels營(yíng)養(yǎng)液）的基礎(chǔ)上，考察不同玉米芯與麩皮質(zhì)量比（9∶1、7∶1、5∶1、3∶1、1∶1、1∶3、1∶5、1∶7、1∶9、全玉米芯和全麩皮）、不同氮源（硝酸銨、酵母粉、尿素、磷酸氫二銨、碳酸銨、硫酸銨、氯化銨和蛋白胨）、不同初始pH值（3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0和6.5）、不同料水比（1∶1.0、1∶1.5、1∶2.0、1∶2.5、1∶3.0、1∶3.5（g∶mL））、不同接種量（2.5%、5.0%、7.5%、10.0%）對(duì)菌株產(chǎn)木聚糖酶的影響。30 ℃發(fā)酵96 h。固態(tài)發(fā)酵pH用營(yíng)養(yǎng)液的pH來調(diào)控，營(yíng)養(yǎng)液的pH用10%硫酸或者10%氫氧化鈉調(diào)節(jié)。

1.3.4 木聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)初步研究

酶的最適作用pH：在50 ℃條件下，分別于不同pH（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）條件下測(cè)定木聚糖酶活力，確定最適作用pH。

酶的最適作用溫度：在pH 5.5條件下，分別于不同溫度（37 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃）條件下測(cè)定木聚糖酶活力，確定最適作用溫度。

1.3.5 木聚糖酶活力的測(cè)定

D-木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：配制1 g/LD-木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，取7支15 mL刻度試管，分別加入D-木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL，分別加入蒸餾水補(bǔ)至2.0 mL，制成D-木糖含量為0、0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L和1.2 g/L的溶液。最后加入2.0 mL DNS搖勻，在沸水浴中煮沸10 min。冷卻后用蒸餾水定容至15 mL并于波長(zhǎng)540nm下測(cè)定吸光度值。以D-木糖含量（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制D-木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.7546x，相關(guān)系數(shù)R2=0.9948。

木聚糖酶活力的測(cè)定：于15 mL的具塞刻度試管里加入1 mL的1%木聚糖溶液（由0.2 mol/L，pH 4.8的醋酸緩沖液配制）、0.5 mL醋酸緩沖液和0.1 mL適當(dāng)稀釋酶液于50 ℃條件靜置反應(yīng)30 min，后加入2 mL的DNS溶液搖勻煮沸10 min后，定容至15 mL后于波長(zhǎng)540 nm下測(cè)定吸光度值。空白中的酶液用滅活的酶液代替[22]。

酶活力單位定義：在上述測(cè)定條件下，1 mL粗酶液或1 g固體酶每分鐘水解木聚糖底物產(chǎn)生1 μmol木糖所需的酶量（IU/g或者IU/mL）。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)木聚糖酶微生物的篩選與鑒定

2.1.1 產(chǎn)木聚糖酶微生物的篩選

以木聚糖為唯一碳源的篩選培養(yǎng)基，經(jīng)觀察水解圈與菌落圈比值的初篩和液體發(fā)酵復(fù)篩，從廣西壯族自治區(qū)環(huán)江縣木論自然保護(hù)區(qū)諸多土樣中分離出一株水解圈直徑與菌落圈直徑比值較大（6.3）、酶活性較高的菌株（873.99IU/mL），將其編號(hào)為SM24/a。

2.1.2 菌株的分子生物學(xué)鑒定

圖1 菌株SM24/a基于ITS rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain SM24/a based on ITS rDNA gene sequences

菌株SM24/a基于ITS rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1。由圖1可知，菌株SM24/a與Aspergillus niger聚于一支，親緣關(guān)系很近。結(jié)合菌落形態(tài)特征，鑒定菌株SM24/a為黑曲霉（Aspergillus niger）。

2.2 產(chǎn)酶條件優(yōu)化

2.2.1 玉米芯、麩皮不同質(zhì)量比對(duì)菌株SM24/a產(chǎn)酶的影響

考察玉米芯與麩皮不同比例對(duì)菌株SM24/a產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知，以純麩皮為碳源時(shí)，木聚糖酶酶活力達(dá)到最高（6 869.76 IU/g）。在玉米芯與麩皮比例為1∶7時(shí)，木聚糖酶的酶活為6 713.88 IU/g。玉米芯與麩皮比例為1∶1、1∶3、1∶5、1∶7和1∶9的木聚糖酶酶活遠(yuǎn)大于玉米芯與麩皮比例為9∶1、7∶1、5∶1和3∶1的木聚糖酶酶活，以純玉米芯為碳源的木聚糖酶酶活最?。? 235.89 IU/g）?？紤]到純麩皮與1∶7混合比例的酶活相差不大且麩皮價(jià)格高于玉米芯，因此，選擇玉米芯與麩皮質(zhì)量比為1∶7。

圖2 玉米芯、麩皮不同比例對(duì)菌株SM24/a產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of different corncob and wheat bran ratio on xylanase production by strain SM24/a

2.2.2 不同氮源對(duì)菌株SM24/a產(chǎn)酶的影響

分別用1.4 g/L的硝酸銨、酵母粉、尿素、磷酸氫二銨、碳酸銨、硫酸銨、氯化銨和蛋白胨為氮源制作培養(yǎng)基，考察不同氮源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 不同氮源對(duì)菌株SM24/a產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of different nitrogen sources on xylanase production by strain SM24/a

由圖3可知，以硫酸銨作為氮源，其木聚糖酶酶活力最高為8150.18IU/g。酵母粉木聚糖酶酶活力最低（5834.28IU/g）。因此，選擇添加量為1.4 g/L的硫酸銨為最佳氮源。

2.2.3 不同初始pH對(duì)菌株SM24/a產(chǎn)酶的影響

利用10%的硫酸或者10%的氫氧化鈉調(diào)節(jié)Mandels營(yíng)養(yǎng)液，控制固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)的pH，不同初始pH對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響見圖4。由圖4可知，在初始pH值為5.0時(shí)，其木聚糖酶酶活為7 615.74 IU/g。在初始pH值為6時(shí)，其木聚糖酶酶活為7 660.28 IU/g。菌株SM24/a對(duì)于環(huán)境的要求比較苛刻，發(fā)酵條件稍微的變動(dòng)，就可能會(huì)引起產(chǎn)酶活力的較大變化，在初始pH值為5.5時(shí)，該pH相較其他pH不適宜微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)酶，木聚糖酶酶活力最低，為5 845.42 IU/g。選擇最佳初始pH值為5.0。

圖4 不同初始pH值對(duì)菌株SM24/a產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of different initial pH value on xylanase production by strain SM24/a

2.2.4 不同料水比對(duì)菌株SM24/a產(chǎn)酶的影響

圖5 不同料水比對(duì)菌株SM24/a產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of different solid to liquid ratio on xylanase production by strain SM24/a

不同料水比對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響見圖5。由圖5可知，在料水比為1∶1.5、1∶2.5、1∶3.5（g∶mL）時(shí)，木聚糖酶酶活力分別為4 459.80 IU/g，7 208.99 IU/g和8 174.26 IU/g。隨著料水比中液體比例的增大，木聚糖酶酶活力增大，料水比的繼續(xù)增大時(shí)，物料會(huì)出現(xiàn)塌陷情況，而且，隨著水分比例的增大，物料的透氣性將會(huì)降低，影響微生物氧氣的吸收，不利于好氧微生物的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶。因此，選擇最佳料水比為1∶3.5（g∶mL）。

2.2.5 不同接種量對(duì)菌株SM24/a產(chǎn)酶的影響

不同接種量對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響見圖6。由圖6可知，在接種量為7.5%時(shí)，木聚糖酶的酶活力達(dá)到最高，為9176.18IU/g。在接種量為10%時(shí)，酶活力最低，為7722.17IU/g。接種量2.5%和接種量5%的木聚糖酶酶活力相差不大，為196 IU/g。因此，選擇最佳接種量為7.5%。

圖6 不同接種量對(duì)菌株SM24/a產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of different inoculum on xylanase production by strain SM24/a

2.2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了驗(yàn)證單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在單因素試驗(yàn)的最優(yōu)條件下進(jìn)行產(chǎn)酶菌株固態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，在玉米芯與麩皮比例為1∶7、硫酸銨添加量為1.4 g/L、初始pH值為5.0、料水比為1∶3.5（g∶mL）、接種量為7.5%的條件下進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，96 h后木聚糖酶酶活力為10 801.3 IU/g。

2.3 菌株SM24/a木聚糖酶的酶學(xué)特性

2.3.1 不同pH對(duì)菌株SM24/a木聚糖酶酶活的影響

在溫度50 ℃條件下，分別于pH3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5條件下測(cè)定木聚糖酶酶活力，結(jié)果見圖7。由圖7可知，木聚糖酶酶活在pH 5.5時(shí)最大。該木聚糖酶為偏酸性木聚糖酶，耐受pH值的范圍較寬，木聚糖酶的最佳pH值為5.5。

圖7 不同pH值對(duì)菌株SM24/a木聚糖酶酶活的影響Fig.7 Effect of different pH value on xylanase production by strain SM24/a

2.3.2 不同溫度對(duì)菌株SM24/a木聚糖酶酶活的影響

在pH5.5條件下，分別于25 ℃、30 ℃、37 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃條件下測(cè)定木聚糖酶酶活。以最高酶活力為100%計(jì)算各溫度下的相對(duì)酶活力，結(jié)果見圖8。由圖8可知，木聚糖酶酶活在37 ℃時(shí)酶活力最高。

圖8 不同溫度對(duì)菌株SM24/a木聚糖酶酶活的影響Fig.8 Effect of different temperature on xylanase production by strain SM24/a

3 結(jié)論

從木論自然保護(hù)區(qū)土壤中篩選到1株高產(chǎn)木聚糖酶曲霉菌株，經(jīng)鑒定該菌為黑曲霉（Aspergillus niger）。固態(tài)產(chǎn)酶條件優(yōu)化結(jié)果表明其最佳玉米芯與麩皮質(zhì)量比為1∶7，1.4 g/L硫酸銨為氮源，初始pH值為5.0，料水比為1∶3.5（g∶mL），接種量為7.5%，發(fā)酵96 h，木聚糖酶酶活力可達(dá)到10 801.3 IU/g。酶學(xué)性質(zhì)表明，在pH為5.5，37 ℃條件下木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)最優(yōu)。這表明該酶在飼料領(lǐng)域具有優(yōu)良的應(yīng)用潛力。后續(xù)將進(jìn)一步研究該酶克隆表達(dá)、發(fā)酵優(yōu)化等試驗(yàn)，以期實(shí)現(xiàn)該黑曲霉菌株的生產(chǎn)應(yīng)用。