劉德海，權(quán)淑靜，2，楊文玲，3，王佰濤，2，馬 煥，2，王一雯，3，鞏 濤，3，丁 芳，陳國參*

（1.河南省科學院 生物研究所有限責任公司，河南 鄭州 450008；2.河南省工業(yè)酶工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450008；3.河南省微生物工程重點實驗室，河南 鄭州 450008）

α-半乳糖苷酶（EC3.2.1.22）又稱蜜二糖酶，屬于外切糖苷酶類，水解酶的一種，能夠特異性的水解具有α-半乳糖苷結(jié)構(gòu)的半乳糖類寡糖，能夠?qū)Ｒ恍源呋?半乳寡糖、半乳甘露聚糖（galactomannan，GM）側(cè)鏈、半乳糖脂和糖蛋白的非還原性末端α-1,6-半乳糖苷鍵的水解[1-3]。該酶在食品工業(yè)、輕化工領(lǐng)域有較高的應(yīng)用價值，被認為是最有應(yīng)用潛力的酶制劑之一：α-半乳糖苷酶是解決大豆制品棉子糖家族寡糖造成的食物不耐受的關(guān)鍵酶[4-6]；在制糖工業(yè)中通過添加α-半乳糖苷酶消除棉籽糖增加蔗糖的產(chǎn)量，促進甜菜糖的結(jié)晶[7]；另外，α-半乳糖苷酶還用于生產(chǎn)能夠促進腸道益生菌增值的益生元α-低聚半乳糖（galactooligosaccharides，GOS）。

α-半乳糖苷酶廣泛存在于動物、植物、微生物，其中微生物法生產(chǎn)α-半乳糖苷酶產(chǎn)量高、來源廣泛、反應(yīng)條件溫和、性能優(yōu)良，是目前α-半乳糖苷酶的主要來源[8]。據(jù)報道產(chǎn)α-半乳糖苷酶微生物包括細菌、真菌、放線菌、酵母等，其中真菌α-半乳糖苷酶具有合適的pH、良好的穩(wěn)定性、細胞外分泌和表達量較高等特點[9]。黑曲霉（Aspergillus niger）是食藥生產(chǎn)領(lǐng)域公認的安全菌株，應(yīng)用高生物安全性的真菌黑曲霉生產(chǎn)α-半乳糖苷酶并研究其在相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用是當前的熱點[10-11]。科研工作者采集不同蛋白含量豐富的樣品分離篩選出α-半乳糖苷酶產(chǎn)生菌，李荷等[12-14]分別從發(fā)霉的豆粕、傳統(tǒng)乳制品、豆制品作坊土樣中分離出產(chǎn)α-半乳糖苷酶菌株。紫花苜蓿為豆科多年生草本植物，具有蛋白含量高、營養(yǎng)價值好的特點[15]，但是國內(nèi)目前尚未見從紫花苜蓿草種植土壤資源中篩選產(chǎn)α-半乳糖苷酶菌株的報道。

本研究采集河南鄭州花園口紫花苜蓿草種植基地土壤樣品，從中分離篩選得到一株產(chǎn)α-半乳糖苷酶真菌菌株，對其進行形態(tài)學觀察和分子生物學鑒定，并采用單因素和正交試驗對該菌株發(fā)酵產(chǎn)α-半乳糖苷酶發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，旨在為篩選獲得高產(chǎn)α-半乳糖苷酶提供新思路，并為工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)更佳性能的α-半乳糖苷酶提供新選擇。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

土壤樣品：采集自河南鄭州花園口紫花苜蓿草種植基地距離地表深1 cm左右土壤和紫花苜蓿草根部土壤，烘干過篩備用。

1.1.2 化學試劑

不含核糖核苷酸（ribonucleic acid，RNA）水：北京全式金生物技術(shù)有限公司；ESTaq酶Master Mix：天根生化科技（北京）有限公司；菌株18S rDNA基因的聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增通用真菌引物：北京六合華大基因科技股份有限公司；對硝基酚（ρ-nitrophenol，ρNP）標準品（純度99%）、5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-alpha-D-galactoside，X-α-Gal）（純度95%）、真菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒（D2300）：北京索萊寶科技有限公司；對硝基酚-α-D-吡喃半乳糖苷（ρ-nitrophenyl-alpha-Dgalactopyranoside，ρNPG）（純度98%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；瓊脂糖（純度99%）：法國Biowest公司；DL2000 DNA Marker：上海萊楓生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：土豆200.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，瓊脂20.0 g/L，水1 000 mL。121 ℃滅菌20 min。

富集培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基中加入鏈霉素（含鏈霉素30 U/mL）。121 ℃滅菌20 min。

菌種平板篩選培養(yǎng)基（Ⅰ）：棉籽糖30.0 g，蛋白胨10.0 g，KCl0.5g/L，K2HPO41.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.5 g/L，瓊脂20.0 g/L，水1 000 mL，pH 6.5。121℃滅菌20min。

菌種平板篩選培養(yǎng)基（Ⅱ）：棉籽糖30.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，KCl 0.5 g/L，K2HPO41.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.5 g/L，瓊脂20.0 g/L，水1 000 mL，X-α-Gal 0.06 g/L，pH 6.5。121 ℃滅菌20 min。

菌種復(fù)篩（基礎(chǔ)）培養(yǎng)基：棉籽糖30.0g/L，蛋白胨10.0g/L，KCl0.5g/L，K2HPO41.0 g/L，MgSO·47H2O 0.5 g/L，F(xiàn)eSO·47H2O 0.5 g/L，水1 000 mL，pH 6.5。121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：乳糖15.0 g，牛肉膏10.0 g/L，Na2HPO40.5 g/L，MgSO·47H2O 1.0 g/L，MnCl21.0 g/L，水蘇糖0.8 g/L，水1 000 mL，pH 7.5。121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

Varioskan Flash全波長掃描式多功能讀數(shù)儀、7146超純水機：美國Thermo公司；QYC-2012C恒溫搖床：上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司；C01006小型高速離心機：美國世界精密儀器商貿(mào)有限公司；504315磁力攪拌器：美國WPI公司；ME204E電子天平、FE20實驗室pH計：瑞士Mettler Toledo公司；DNP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；T-Gradient Thermoblock PCR擴增儀：德國Biometra公司；DYY-6C電泳儀：北京六一儀器廠；Axio Image M2全電動正置熒光顯微鏡：德國zeiss公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種初篩[16]

無菌條件下稱取1.0g土壤樣品加入裝液量為100mL/250mL富集培養(yǎng)基中，于30 ℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)18 h。取富集后的培養(yǎng)液分別用無菌水稀釋至10-5、10-6、10-7，分別取10-5、10-6、10-7三個稀釋度溶液200 μL涂布于菌種平板篩選培養(yǎng)基（Ⅰ）表面，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，用無菌牙簽從平板生長的菌落中挑取各種形態(tài)不一樣的單菌落點種于含有X-α-Gal菌種平板篩選培養(yǎng)基（Ⅱ）平板上，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，接種環(huán)挑取藍色單菌落進一步劃線純化（在菌株產(chǎn)生的α-半乳糖苷酶催化下無色的X-α-Gal水解后呈藍色），將純化后的單菌落轉(zhuǎn)接于菌種保藏培養(yǎng)基斜面試管上，30 ℃培養(yǎng)72 h，觀察菌落的生長情況，進行記錄編號，置于甘油管中，放4 ℃冰箱中保存，備用。

1.3.2 菌種復(fù)篩

將初篩純菌種接種（接種量0.3 g斜面種子）于裝液量為100 mL/250 mL菌種液體復(fù)篩（基礎(chǔ)）培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)72 h，發(fā)酵培養(yǎng)酶液離心機于4 ℃、8 000 r/min離心15 min，收集上清液用于α-半乳糖苷酶酶活性分析，選取α-半乳糖苷酶酶活力高的菌株為出發(fā)菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化試驗。

1.3.3α-半乳糖苷酶酶活力分析[17-18]

對硝基酚標準曲線繪制：以對硝基酚濃度（x）為橫坐標，吸光度值OD405nm值（y）為縱坐標，繪制標準曲線。按照標準曲線回歸方程計算α-半乳糖苷酶酶活力，其計算公式如下：

式中：Ax為樣品酶液OD405nm值；A0為空白OD405nm值；K為對硝基酚標準曲線的斜率；C0為對硝基酚標準曲線的截距；Df為稀釋倍數(shù)；v為吸取樣品酶液體積，mL；t為反應(yīng)時間，min。

α-半乳糖苷酶活力單位定義：在37 ℃，pH 5.0條件下，1 min分解底物ρNPG生成1 μmol對硝基苯酚所需的酶量為1個酶活力單位（U）。

1.3.4 菌株A1-19菌落形態(tài)觀察和分子生物學鑒定

形態(tài)學觀察：參照魏景超《真菌鑒定手冊》[19]。

分子生物學鑒定：用真菌基因組DNA提取試劑盒（D2300），按試劑盒說明書操作流程提取菌株A1-19的基因組DNA。以其為模板，采用真菌通用引物（ITS1：5'-TCCG-TAGGTGAACCTGCGG-3'；ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTG-ATATGC-3'），進行菌株A1-19 18S rDNA基因的PCR擴增。PCR擴增體系：不含核糖核苷酸水9.5 μL，ESTaqMasterMix 12.5 μL，模板DNA 1 μL，ITS1上游引物1 μL，ITS4下游引物1 μL；PCR擴增條件：95 ℃預(yù)變性4 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析檢測驗證后，送華大基因完成測序。將菌株測序序列在美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）上提交Genbank數(shù)據(jù)庫采用基本檢索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進行同源性序列比對相似性分析，并用分子進化遺傳分析（molecular evolutionary genetics analysis，MEGA）6.0軟件構(gòu)建18S rDNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹，采用鄰接（neighbor-joining，NJ）法進行菌株18S rDNA基因分析。

1.3.5 菌種A1-19產(chǎn)α-半乳糖苷酶培養(yǎng)基優(yōu)化的單因素試驗

以發(fā)酵酶液產(chǎn)α-半乳糖苷酶酶活力為評價指標，以菌種復(fù)篩（基礎(chǔ)）培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，選擇添加量為30.0 g/L不同碳源（β-環(huán)糊精、葡萄糖、蔗糖、棉籽糖、乳糖、果糖、可溶性淀粉）、添加量為10.0 g/L不同氮源（蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、硝酸鈉、硫酸銨、檸檬酸三銨、豆粕粉）、1.0 g/L不同無機鹽（氯化鉀、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵、硫酸鎂、硫酸銅、磷酸氫二鈉、氯化錳）和添加量0.5 g/L不同誘導物（蔗糖、棉籽糖、蜜二糖、水蘇糖）為單因素，研究其對發(fā)酵液中α-半乳糖苷酶酶活力大小的影響，裝液量為100mL/250mL，在30℃、180r/min搖床振蕩培養(yǎng)72 h，單因素培養(yǎng)基優(yōu)化各作3組平行試驗。

1.3.6 菌種A1-19產(chǎn)α-半乳糖苷酶培養(yǎng)基優(yōu)化的正交試驗

根據(jù)菌種A1-19單因素培養(yǎng)基優(yōu)化試驗結(jié)果，設(shè)計發(fā)酵產(chǎn)α-半乳糖苷酶培養(yǎng)基優(yōu)化正交優(yōu)化試驗。選擇乳糖（A）、牛肉膏（B）、硫酸鎂（C）、磷酸氫二鈉（D）、氯化錳（E）、水蘇糖（F）添加量為6種影響因素，每個因素設(shè)計3個水平，裝液量為100mL/250 mL，30℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)72 h，以α-半乳糖苷酶酶活為評價指標，分析優(yōu)化出菌種A1-19較佳的培養(yǎng)基配方。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離篩選

通過富集培養(yǎng)、菌種平板篩選培養(yǎng)基（Ⅰ）、含有X-α-Gal菌種平板篩選培養(yǎng)基（Ⅱ），初篩得到13株產(chǎn)α-半乳糖苷酶的菌株，分別編號為A1-6、A1-11、A1-19、A1-22、A 2-2、A 2-3、A2-10、B1-3、B1-4、B1-6、B2-7、B2-9、B2-10。將該13株菌株分別接種于菌種復(fù)篩（基礎(chǔ)）培養(yǎng)基，30 ℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)72 h，測定發(fā)酵液酶活，結(jié)果見表1。由表1可知，菌株A1-19發(fā)酵液的α-半乳糖苷酶酶活力最高，為1.16 U/mL。將其選定為實驗菌株并進行后續(xù)實驗。

表1 篩選菌株α-半乳糖苷酶酶活測定結(jié)果Table 1 Determination results of α-galactosidase activity of selected strains

2.2 菌株A1-19的鑒定

2.2.1 菌株A1-19的形態(tài)特征

將菌株A1-19接種到PDA培養(yǎng)基平板上，30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，其菌落形態(tài)變化結(jié)果見圖1。由圖1可知，菌株A1-19菌落菌絲由24 h的白色絨毛狀，逐漸上外漫延發(fā)展為48 h的淺黃色且?guī)в猩倭亢趾谏咦樱敝僚囵B(yǎng)72 h時大量褐黑色孢子布滿整個平板。菌株A1-19孢子顯微特征見圖2，由圖2可知，孢子梗，球形頂囊及球形孢子。

圖1 菌株A1-19在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征Fig.1 Colonial morphology characteristics of strain A1-19 on PDA medium

圖2 菌株A1-19孢子顯微特征Fig.2 Microscopic characteristics of spores of strain A1-19

2.2.2 菌株A1-19的分子生物學鑒定

菌株A1-19的18S rDNA PCR擴增結(jié)果見圖3。由圖3可知，PCR擴增產(chǎn)物序列片段長度為593 bp，與預(yù)期結(jié)果相符。將PCR擴增產(chǎn)物測序結(jié)果提交NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫，進行BLAST同源性序列比對相似性分析，并在18S rDNA基因序列同源性基礎(chǔ)上構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株A1-19的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4。由圖4可知，菌株A1-19與Aspergillus nigerATCC 16888T（NR 111348.1）在同一分支，且相似性為99.65%。結(jié)合菌株A1-19的菌落形態(tài)特征、18S rDNA的基因序列測序及系統(tǒng)發(fā)育樹分析，菌株A1-19被鑒定為黑曲霉（Aspergillus niger）。

圖3 18S rDNA PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.3 Agarose gel electrophoresis result of 18S rDNA PCR product

圖4 基于18S rDNA序列菌株A1-19的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain A1-19 based on 18S rDNA sequence

2.3 黑曲霉A1-19產(chǎn)α-半乳糖苷酶酶培養(yǎng)基優(yōu)化的單因素試驗

2.3.1 碳源對菌株A1-19產(chǎn)α-半乳糖苷酶的影響

不同碳源及最適碳源添加量對黑曲霉A1-19產(chǎn)α-半乳糖苷酶酶活力的影響，結(jié)果見圖5。由圖5A可知，在7種碳源中以乳糖為唯一碳源時，黑曲霉A1-19產(chǎn)α-半乳糖苷酶的酶活力最高，為1.86 U/mL；而以棉籽糖為唯一碳源時最低，為0.91 U/mL；其他碳源（β-環(huán)糊精、葡萄糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉）發(fā)酵液α-半乳糖苷酶的酶活力差別不大，葡萄糖、蔗糖易被黑曲霉吸收利用更好的促進了菌絲生長而產(chǎn)酶不足，β-環(huán)糊精、可溶性淀粉不易被黑曲霉吸收利用菌絲生長不良而酶活力不高。故選擇乳糖作為碳源進行試驗。由圖5B可知，乳糖添加量為5～15 g/L時，α-半乳糖苷酶的酶活力隨之增加；乳糖添加量為15 g/L時，α-半乳糖苷酶的酶活力最大；乳糖添加量＞15 g/L之后，α-半乳糖苷酶的酶活力隨之下降。因此，乳糖最佳添加量為15 g/L。

圖5 不同碳源（A）及乳糖添加量（B）對α-半乳糖苷酶酶活的影響Fig.5 Effect of different carbon sources (A) and lactose addition (B)on α-galactosidase activity

2.3.2 氮源對菌株A1-19產(chǎn)α-半乳糖苷酶的影響

不同氮源及最佳氮源添加量對黑曲霉A1-19產(chǎn)α-半乳糖苷酶酶活力的影響，結(jié)果見圖6。由圖6A可知，有機氮源（蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、豆粕粉）比無機氮源（硝酸鈉、硫酸銨、檸檬酸三銨）產(chǎn)生的α-半乳糖苷酶酶活力高，尤其以牛肉膏為氮源時，黑曲霉A1-19產(chǎn)α-半乳糖苷酶酶活力最高，為3.92 U/mL，以硫酸銨為氮源酶活力最低為0.81 U/mL，有機氮源能夠更好的促進黑曲霉蛋白質(zhì)及遺傳物質(zhì)的合成提高酶活力，故選擇牛肉膏為氮源進行后續(xù)試驗。由圖6B可知，牛肉膏添加量為5～10 g/L時，α-半乳糖苷酶的酶活力隨之增加；牛肉膏添加量為10 g/L時，α-半乳糖苷酶的酶活力最大；牛肉膏添加量＞10 g/L之后，α-半乳糖苷酶的酶活力隨之下降。因此，牛肉膏最佳添加量為10 g/L。

2.3.3 無機鹽對菌株A1-19產(chǎn)α-半乳糖苷酶的影響

不同無機鹽對黑曲霉A1-19產(chǎn)α-半乳糖苷酶酶活力的影響，結(jié)果見圖7。由圖7A可知，添加硫酸鎂、磷酸氫二鈉、氯化錳試驗組α-半乳糖苷酶酶活力高于對照組，尤其氯化錳提高明顯，LEE J等[20]研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中添加硫酸錳可以大幅度提高α-半乳糖苷酶產(chǎn)量；而其他無機鹽氯化鉀、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵、硫酸銅試驗組α-半乳糖苷酶酶活力低于對照組。表明無機鹽硫酸鎂、磷酸氫二鈉、氯化錳促進了黑曲霉A1-19產(chǎn)α-半乳糖苷酶，氯化錳產(chǎn)α-半乳糖苷酶酶活力最高，促進作用較強，這可能是Mg2+、Na+、Mn2+參與并促進了α-半乳糖苷酶的活性基團合成；氯化鉀、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵、硫酸銅抑制了α-半乳糖苷酶的生產(chǎn)，硫酸亞鐵產(chǎn)α-半乳糖苷酶酶活力最低，抑制作用最強。故選擇硫酸鎂、磷酸氫二鈉、氯化錳復(fù)合無機鹽為發(fā)酵培養(yǎng)基無機鹽進行后續(xù)試驗。由圖7B可知，硫酸鎂添加量為0.2～0.8 g/L時，α-半乳糖苷酶的酶活力隨之增加；硫酸鎂添加量為0.8 g/L時，α-半乳糖苷酶的酶活力最大；硫酸鎂添加量＞0.8 g/L之后，α-半乳糖苷酶的酶活力隨之下降。因此，硫酸鎂最佳添加量為0.8 g/L。由圖7C可知，磷酸氫二鈉添加量為0.5～1.0 g/L時，α-半乳糖苷酶的酶活力隨之增加；磷酸氫二鈉添加量為1.0 g/L時，α-半乳糖苷酶的酶活力最大；磷酸氫二鈉添加量＞1.0 g/L之后，α-半乳糖苷酶的酶活力隨之下降。因此，磷酸氫二鈉最佳添加量為1.0 g/L。

圖7 不同無機鹽（A）及硫酸鎂（B）、磷酸氫二鈉（C）、氯化錳（D）添加量對α-半乳糖苷酶酶活的影響Fig.7 Effect of different inorganic salts (A),MgSO4·7H2O (B),Na2HPO4(C) and MnCl2(D) addition on α-galactosidase activity

由圖7D可知，氯化錳添加量為0.5～1.0 g/L時，α-半乳糖苷酶的酶活力隨之增加；氯化錳添加量為1.0g/L時，α-半乳糖苷酶的酶活力最大；氯化錳添加量＞1.0 g/L之后，α-半乳糖苷酶的酶活力隨之下降。因此，氯化錳最佳添加量為1.0 g/L。

2.3.4 誘導物對菌株A1-19產(chǎn)α-半乳糖苷酶的影響

α-半乳糖苷酶為誘導酶[21]，其基因表達調(diào)控遵循一定機制，誘導物大部分為底物、底物類似物，發(fā)酵過程中添加誘導物對產(chǎn)酶有較大影響。蔡國林等[10]從黃酒麥曲中篩選出的黑曲霉wx-07產(chǎn)α-半乳糖苷酶中蔗糖是很好的誘導因子。不同誘導物及最佳誘導物添加量對黑曲霉A1-19產(chǎn)α-半乳糖苷酶酶活力的影響，結(jié)果見圖8。

圖8 不同誘導物（A）及水蘇糖添加量（B）對α-半乳糖苷酶酶活的影響Fig.8 Effect of different inducer (A) and stachyose addition (B) on α-galactosidase activity

由圖8A可知，添加蔗糖、棉籽糖、蜜二糖、水蘇糖試驗組α-半乳糖苷酶酶活力高于對照組，說明蔗糖、棉籽糖、蜜二糖、水蘇糖對黑曲霉A1-19產(chǎn)α-半乳糖苷酶均有一定正向誘導作用，其中添加水蘇糖試驗組黑曲霉A1-19產(chǎn)α-半乳糖苷酶酶活力最高，為4.33 U/mL，這與杜新永[22]的報道一致，蔗糖、棉籽糖、蜜二糖、水蘇糖也是糖類可作為碳源，在碳源優(yōu)化單因素試驗中棉籽糖、蔗糖不是黑曲霉A1-19產(chǎn)α-半乳糖苷酶最佳碳源，但是它們與乳糖組成復(fù)合碳源同時又為酶的誘導物時，能夠促進α-半乳糖苷酶的生產(chǎn)，試驗結(jié)果證明它們作為酶的誘導物時作用更大。故選擇水蘇糖為誘導物進行后續(xù)試驗。由圖8B可知，水蘇糖添加量為0.2～0.5 g/L時，α-半乳糖苷酶的酶活力隨之增加；水蘇糖添加量為0.5 g/L時，α-半乳糖苷酶的酶活力最大；水蘇糖添加量＞0.5 g/L之后，α-半乳糖苷酶的酶活力隨之下降。因此，水蘇糖最佳添加量為0.5 g/L。

2.4 菌株A1-19產(chǎn)α-半乳糖苷酶培養(yǎng)基優(yōu)化的正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以α-半乳糖苷酶酶活為評價指標，選擇碳源乳糖（A）、氮源牛肉膏（B）、硫酸鎂（C）、磷酸氫二鈉（D）、氯化錳（E）、水蘇糖（F）為六種因素，每個因素設(shè)計3個水平，設(shè)計L18（36）正交試驗，正交試驗結(jié)果與分析見表2。由表2可知，發(fā)酵培養(yǎng)基中對菌株A1-19產(chǎn)α-半乳糖苷酶的影響因素強弱依次為F＞A＞E＞B＞D＞C，因素F酶的誘導物水蘇糖影響產(chǎn)酶的主要因素，其他依次為乳糖、氯化錳、牛肉膏、磷酸氫二鈉以及硫酸鎂，其適宜的培養(yǎng)基配方組合為A2B2C3D1E2F3。即乳糖15.0 g/L、牛肉膏10.0 g/L、硫酸鎂1.0 g/L、磷酸氫二鈉0.5 g/L、氯化錳1.0 g/L、水蘇糖0.8 g/L。在此優(yōu)化的培養(yǎng)基條件下，進行3次平行驗證試驗，菌株A1-19產(chǎn)α-半乳糖苷酶酶活力達到7.85 U/mL，是優(yōu)化前酶活力（1.16 U/mL）的6.77倍。

表2 培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for medium formula optimization

3 結(jié)論

本研究從河南鄭州花園口紫花苜蓿草種植土壤中，分離篩選得到一株產(chǎn)α-半乳糖苷酶真菌菌株，經(jīng)過形態(tài)學觀察和分子生物學鑒定，將其鑒定為黑曲霉菌（Aspergillus niger），編號為A1-19，采用單因素和正交試驗得到最佳培養(yǎng)基配方為乳糖15.0 g/L、牛肉膏10.0 g/L、硫酸鎂1.0 g/L、磷酸氫二鈉0.5 g/L、氯化錳1.0 g/L、水蘇糖0.8 g/L，通過優(yōu)化菌株A1-19產(chǎn)α-半乳糖苷酶發(fā)酵培養(yǎng)基成分及組成，發(fā)酵液α-半乳糖苷酶酶活力達到7.85 U/mL，是優(yōu)化前發(fā)酵酶活力（1.16 U/mL）的6.77倍，為其α-半乳糖苷酶生產(chǎn)菌株的工業(yè)生產(chǎn)利用開辟了更多可能的途徑。