董章勇，舒永馨，陳欣瑜，羅 梅

(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，廣州 510225)

玫煙色棒束孢(Isariafumosorosea，原名玫煙色擬青霉Paecilomycesfumosoroseus)屬于半知菌亞門(Deuteromycotian)絲孢綱(Hyphomycetes)絲孢目(Moniliales)叢梗孢科(Moniliaceae)棒束孢屬(Isaria)，是一種重要的昆蟲致病真菌。其分布廣泛，寄主范圍也相當(dāng)廣泛，能侵染粉虱、蚜蟲、小菜蛾等多種半翅目、雙翅目、鞘翅目等昆蟲[1-4]。黃振等[5]研究表明，玫煙色棒束孢與毗蟲琳等化學(xué)農(nóng)藥使用時(shí)能較好地發(fā)揮其聯(lián)合控制的效果。念曉歌等[6]用玫煙色棒束孢與化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行混配使用，驗(yàn)證其與高效氯氰菊酯的相容性最好，在常規(guī)使用濃度下，該農(nóng)藥對玫煙色棒束孢菌絲生長和孢子萌發(fā)影響極小。而目前國內(nèi)外對玫煙色棒束孢的研究報(bào)道主要為生物學(xué)、分類鑒定、致病力測定、致病機(jī)理、防治應(yīng)用等方面并且北美和歐洲已經(jīng)有真菌殺蟲劑產(chǎn)品登記注冊并用于害蟲的防治[7-8]。但是由于生防真菌受多種生態(tài)因子影響，對寄主昆蟲的致病過程復(fù)雜，實(shí)踐應(yīng)用防效不穩(wěn)定，在一定程度上限制了其應(yīng)用[9]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用基因工程等生物技術(shù)手段對菌株進(jìn)行改良以提高菌株的毒力和穩(wěn)定性成為目前的研究熱點(diǎn)。昆蟲病原真菌的侵染過程分為體表吸附階段、孢子萌發(fā)、體壁穿透階段和菌體在寄主體內(nèi)增殖等4個(gè)階段。而昆蟲在長期進(jìn)化過程中也建立了一套特殊的針對外來病原物的防御體系。在昆蟲寄主與病原物的互作過程中，有眾多的影響因素。隨著多種昆蟲生物防治菌株的測序完成[10]，給該研究帶來極大便利。

效應(yīng)因子也稱效應(yīng)子或效應(yīng)蛋白，廣義上是指能夠選擇性地結(jié)合其他目標(biāo)蛋白及調(diào)節(jié)其生物活性的一類小分子蛋白[11-13]。隨著研究的深入，效應(yīng)因子被認(rèn)為在病原物與寄主的互作過程中發(fā)揮著重要作用[11-16]。傳統(tǒng)效應(yīng)因子的驗(yàn)證是通過寄主互作的試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證[17-18]，這種方法效率較慢。隨著生物信息學(xué)的快速發(fā)展，已經(jīng)有越來越多的人選擇利用高通量的方法進(jìn)行快速篩選[19-20]。效應(yīng)分子一般具有以下特征：(1)含有N-端信號肽；(2)無跨膜結(jié)構(gòu)域；(3)定位于細(xì)胞質(zhì)；(4)序列具有特異性；(5)富含半胱氨酸；(6)重復(fù)元件多；(7)氨基酸殘基數(shù)量大約在50～300氨基酸[13-14]。運(yùn)用生物信息學(xué)的方法可以高效快速地找到靶標(biāo)。

本研究擬以玫煙色棒束孢全基因組的10061個(gè)蛋白序列作為研究序列，根據(jù)效應(yīng)因子的7個(gè)典型特征，利用生物信息學(xué)軟件對其候選效應(yīng)因子進(jìn)行預(yù)測，并對預(yù)測結(jié)果作初步分析，為玫煙色棒束孢效應(yīng)子的進(jìn)一步篩選與驗(yàn)證提供一定的理論依據(jù)，并為探究效應(yīng)子在昆蟲與病原菌互作過程中的作用奠定基礎(chǔ)，為玫煙色棒束孢的防治應(yīng)用提供新的依據(jù)和途徑。

1 材料與方法

1.1 玫煙色棒束孢全基因組序列

玫煙色棒束孢蛋白序列于NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=Isaria+fumosorosea)下載，共包含10 061個(gè)蛋白序列(GenBank ID：AZHB00000000.1)。

1.2 分泌蛋白的預(yù)測

利用SignalP v4.1進(jìn)行信號肽的預(yù)測[21]，利用TMHMM v2.0進(jìn)行跨膜層數(shù)的預(yù)測[22-23]，采用TargetP v1.1 和ProtComp v9.0在線分析軟件進(jìn)行細(xì)胞定位分析[24]，篩選出定位于細(xì)胞質(zhì)器中的分泌蛋白序列。

1.3 分泌組蛋白的半胱氨酸含量和多個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列分析

將“1.2”分析得到的蛋白序列進(jìn)行半胱氨酸(Cysteine)含量及多串聯(lián)重復(fù)序列(Multiple tandem repeats)進(jìn)行分析。半胱氨酸含量采用perl工具進(jìn)行計(jì)算。將具有高半胱氨酸含量的(≥6)的蛋白序列進(jìn)行多個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列分析。多個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列采用T-Reks (http://bioinfo.montp.cnrs.fr/?r= t-reks/)進(jìn)行預(yù)測。

1.4 病原寄主互作數(shù)據(jù)庫分析

將“1.3”所獲得的蛋白序列和PHI數(shù)據(jù)庫(Pathogen-Host interaction database，http://www.Phi-bas e.org/downloadLink.htm)進(jìn)行比對分析，篩選出具有致病功能的蛋白。

1.5 候選致病相關(guān)效應(yīng)因子的確定

將“1.4”獲得的蛋白序列進(jìn)行長度篩選，去除大于300個(gè)氨基酸的蛋白序列，剩余的為候選的效應(yīng)因子。

2 結(jié)果與分析

2.1 分泌蛋白的預(yù)測

玫煙色棒束孢全基因組共10 061個(gè)蛋白序列。利用SignalP v4.1進(jìn)行信號肽的分析，共得到1 112個(gè)蛋白具有信號肽；然后以1 112個(gè)蛋白進(jìn)一步應(yīng)用TMHMM v2.0進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)分析，得到1 030個(gè)跨膜數(shù)小于2的蛋白；將1 030個(gè)蛋白用TargetP v1.1進(jìn)行分析，得到1 001個(gè)定位為分泌途徑的信號肽(SP)；最后將這1 001個(gè)蛋白用ProtComp v9.0進(jìn)行定位分析，得到929個(gè)蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中(圖1)。以這929個(gè)蛋白作進(jìn)一步分析。

圖1 玫煙色棒束孢基因組分泌蛋白的鑒定Fig.1 Identification of secretome in Isaria fumosorosea

2.2 分泌組蛋白的半胱氨酸含量和重復(fù)性分析結(jié)果

將929個(gè)蛋白序列進(jìn)行半胱氨酸含量及多串聯(lián)重復(fù)分析。得到半胱氨酸含量大于等于6的蛋白序列共495個(gè)。含有半胱氨酸的個(gè)數(shù)為6～51。其中含有6個(gè)半胱氨酸的蛋白最多，有117個(gè)蛋白；含有7、8、9、10個(gè)的分別有68、86、38和55個(gè)；超過21個(gè)半胱氨酸個(gè)數(shù)的蛋白相對較少(圖2)。將495個(gè)蛋白序列進(jìn)一步進(jìn)行多串聯(lián)重復(fù)分析，最終得到146個(gè)多串聯(lián)重復(fù)大于或等于9的蛋白序列。

2.3 病原寄主互作數(shù)據(jù)庫分析比對結(jié)果

將富含半胱氨酸且多串聯(lián)重復(fù)性高的146個(gè)蛋白序列和PHI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。結(jié)果如下：共有137個(gè)蛋白在PHI數(shù)據(jù)中獲得注釋。其中，68個(gè)蛋白被證明缺失后會造成致病力減弱(Reduced virulence)，占總數(shù)的50.7%；2個(gè)蛋白缺失后會完全失去致病力(Loss of pathogenicity)，占總數(shù)的1.5%，推測其為致病因子；9個(gè)蛋白已被證明是效應(yīng)因子，占總數(shù)的6.7%；其中7個(gè)Mixed outcome蛋白序列里面有4個(gè)蛋白序列分別為失去致病力-毒性減弱和毒性減弱-失去致病力，歸為候選效應(yīng)因子，占總數(shù)的3.0%；剩余的41個(gè)蛋白則被認(rèn)為是不影響病原的致病力(Unaffected pathogenicity)，占總數(shù)的30.6%，2個(gè)蛋白會導(dǎo)致毒力增強(qiáng)，占總數(shù)的1.5%。通過與PHI數(shù)據(jù)庫比對后，作為候選效應(yīng)因子的基因共有91個(gè)，其中包括：效應(yīng)因子9個(gè)，致病力減弱基因68個(gè)，失去致病力基因2個(gè)，混合型基因4個(gè)，致死的有8個(gè)(表1)。

2.4 小分子蛋白的篩選結(jié)果

一般的效應(yīng)因子蛋白序列長度小于300。因此，將上述步驟獲得的137個(gè)基因序列進(jìn)一步進(jìn)行長度篩選。結(jié)果剩余19個(gè)基因序列，這19個(gè)基因序列則被認(rèn)為是候選致病相關(guān)效應(yīng)因子(表2)。

圖2 495個(gè)玫煙色棒束孢分泌基因的半胱氨酸含量分類Fig.2 Classification of cysteine content in 495 Isaria fumosorosea secretory genes

表1 137個(gè)玫煙色棒束孢候選效應(yīng)蛋白的基因功能的匯總Table 1 Summary of gene functions of 137 candidate effectors of Isaria fumosorosea

注：*混合型里面有4個(gè)蛋白序列分別為失去致病性以及效應(yīng)因子，歸為候選效應(yīng)因子。

Note: * Four protein sequnces in mixed outcome are loss of pathogenicities and effectors,it belongs to candidate effectors.

3 討 論

植物病原菌的分泌蛋白及效應(yīng)因子的研究相對較多。如曹友志[25]利用楊生褐盤二孢菌(Marssoninabrunnea)全基因組數(shù)據(jù)，預(yù)測出106個(gè)符合要求的候選效應(yīng)因子。李孟瓊[26]從稻瘟菌基因組中分析得到21個(gè)效應(yīng)因子。陳琦光等[20]從希金斯刺盤孢基因組中分析得到135個(gè)蛋白。在病原菌的生防真菌的預(yù)測主要集中在分泌蛋白。如枯草芽孢桿菌、粘綠木霉和哈赤木霉[27-29]。昆蟲病原真菌的效應(yīng)蛋白預(yù)測研究相對較少。而在效應(yīng)蛋白的預(yù)測上，前期分泌蛋白的預(yù)測方法相對較統(tǒng)一，后期的篩選由于使用方法的不一樣，導(dǎo)致獲得效應(yīng)因子的數(shù)量也有很大差別。本研究通過與PHI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，剔除了一些已經(jīng)證實(shí)與致病效果不相關(guān)的蛋白，有利于縮小范圍進(jìn)行后續(xù)功能驗(yàn)證試驗(yàn)的開展。最終得到19個(gè)候選效應(yīng)因子，16個(gè)為敲除后致病能力減弱的效應(yīng)因子，其他3個(gè)分別為失去致病力以及植物無毒性決定簇的效應(yīng)因子。其中15個(gè)基因的注釋均為假定蛋白，說明尚有許多基因尚未定名，而此15個(gè)候選的玫煙色棒束孢的效應(yīng)因子的功能需要進(jìn)一步的進(jìn)行驗(yàn)證。其余4個(gè)蛋白分別為細(xì)胞外膜蛋白，CFEM結(jié)構(gòu)域(Extracellular membrane protein,CFEM domain protein，OAA52920)、類胰蛋白酶絲氨酸蛋白酶(Trypsin-like serine protease，OAA57155)、細(xì)胞壁半乳甘露蛋白MP2/類過敏原F17蛋白(Cell wall galactomannoprotein Mp2/allergen F17-like protein，OAA57821)及藍(lán)藻抗病毒蛋白N(Cyanovirin-N，OAA72610)。有意思的是，其中CFEM結(jié)構(gòu)域蛋白在球孢白僵菌的效應(yīng)蛋白中也分析到該蛋白[30]。張騰飛等[31]在球孢白僵菌對小菜蛾的侵染相關(guān)基因分析中表明，胞外絲氨酸富集蛋白在其侵染過程中表達(dá)差異顯著，該蛋白在玫煙色棒束孢的致病過程中發(fā)揮何種作用尚需進(jìn)一步分析。

表2 19個(gè)玫煙色棒束孢候選致病相關(guān)效應(yīng)因子Table 2 19 candidate pathogenic effectors of Isaria fumosorosea

注：*基因編碼指玫煙色棒束孢基因組翻譯蛋白的NCBI序列號。

Note: * Gene code refers to the sequence number of translated protein ofIsariafumosoroseagenome in NCBI.

隨著更多的昆蟲病原真菌全基因組序列的公布，為進(jìn)一步利用生物信息學(xué)的方法對這些基因組進(jìn)行效應(yīng)因子分析提供了數(shù)據(jù)。預(yù)測得到的這些效應(yīng)蛋白液仍然需要進(jìn)一步進(jìn)行相應(yīng)的功能驗(yàn)證及與寄主互作的驗(yàn)證。本研究首次對玫煙色棒束孢全基因組的效應(yīng)因子進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的預(yù)測和分析，結(jié)果準(zhǔn)確。

4 結(jié) 論

本研究通過對玫煙色棒束孢全基因組的 10 061個(gè)蛋白序列進(jìn)行篩選，共獲得929個(gè)分泌蛋白；將940個(gè)蛋白序列進(jìn)行半胱氨酸含量及多個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列分析，共得到495個(gè)含有高半胱氨酸含量(≥ 6)的蛋白和146個(gè)含有多個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列(≥ 9)的蛋白；病原寄主互作數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，篩選到91個(gè)致病蛋白，去除>300的氨基酸序列，最終得到19個(gè)候選致病相關(guān)的效應(yīng)因子。本研究為進(jìn)一步深入研究玫煙色棒束孢效應(yīng)子的功能奠定一定理論基礎(chǔ)。