郭亞路,劉 征,嚴(yán) 婷,杜 羽,單衛(wèi)星

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西楊凌 712100;2. 西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

寄主誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)(host-induced gene silencing，HIGS)，指將連有病原菌目的基因片段的反義發(fā)卡結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)入寄主植物中，引發(fā)寄主植物產(chǎn)生與病原菌中目的基因同源的特異雙鏈 RNA(dsRNA)，植物識(shí)別 dsRNA 后通過核酸內(nèi)切酶將其切割成21～35個(gè)堿基的SiRNA，當(dāng)病原菌侵染寄主植物時(shí)，這些 siRNA被病原菌吸收，使病原菌中的特定序列產(chǎn)生雙鏈 RNA(dsRNA)，導(dǎo)致病原菌中的目的基因下調(diào)[1-2]。HIGS技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是靶向性高、通用性強(qiáng)和操作簡便快速，既可以鑒定病菌基因的功能，又可以控制病菌擴(kuò)展，提高植物抗病性。

HIGS技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用在寄生植物、真菌、線蟲、以及卵菌等病原系統(tǒng)中[3-12]。在卵菌的應(yīng)用中，利用HIGS技術(shù)將致病疫霉菌(Phytophthorainfestans)效應(yīng)基因PiAvr3a沉默，馬鈴薯植株表現(xiàn)出一定程度的抗病現(xiàn)象[13]。Jahan等[14]選取在致病疫霉菌侵染過程中起重要作用的PiGPB1、PiCESA2和PiPEC以及參與基礎(chǔ)細(xì)胞維持的PiGAPDH基因作為 HIGS靶標(biāo)，發(fā)現(xiàn)對比野生型的非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株，沉默PiGPB1降低了致病疫霉菌的生物定殖量，植物表現(xiàn)抗病表型，PiGPB1在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量下降，轉(zhuǎn)基因植物檢測出特異的siRNA，說明 HIGS技術(shù)是否成功高度依賴目標(biāo)基因的選擇。同樣，研究證明采用 HIGS技術(shù)提高了萵苣對霜霉病菌卵菌盤梗霉(Bremialactucae)的抗性[12]。以上研究表明，HIGS技術(shù)在植物-卵菌互作中可以有效利用。以上卵菌HIGS 研究均采用 RNAi 載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物，試驗(yàn)周期較長，工作量較大。病毒誘導(dǎo)的基因沉默(virus induced gene silencing，VIGS)技術(shù)可快速地在植物中實(shí)現(xiàn)瞬時(shí)沉默，已用于真菌 HIGS研究[15]，有潛力用于提高HIGS 研究效率。

本研究通過采用 VIGS技術(shù)在寄主植物中表達(dá)疫霉菌基因片段，研究其用于提高HIGS 效率鑒定疫霉菌致病關(guān)鍵基因的潛力。致病疫霉菌Pihmp1編碼吸器細(xì)胞膜特異蛋白，其沉默顯著減弱致病疫霉菌的致病性[16]；G蛋白偶聯(lián)受體蛋白基因GK4與致病疫霉菌的孢子萌發(fā)、菌絲生長發(fā)育以及毒性功能相關(guān)[17]；PcAvh1是辣椒疫霉菌的一個(gè) RXLR效應(yīng)蛋白基因，具有重要的毒性功能[18]；SGT1參與植物防衛(wèi)信號(hào)和抗病途徑[19]，其沉默導(dǎo)致植物表現(xiàn)更感病，植株生長矮小，葉片皺縮卷曲；PDS(八氫番茄紅素脫氫酶)參與植物類胡蘿卜素的合成，其沉默導(dǎo)致葉片出現(xiàn)白化現(xiàn)象[20]。本試驗(yàn)以GUS、GFP、PDS和SGT1作為報(bào)告基因，研究基于 VIGS基因瞬時(shí)沉默技術(shù)的 HIGS技術(shù)用于本氏煙草-疫霉菌互作的潛力。

1 材料與方法

1.1 材 料

培養(yǎng)基 LB、CA、RSA、抗生素卡那霉素、四環(huán)素、農(nóng)桿菌感受態(tài) C58C1、大腸桿菌感受態(tài) DH5α、辣椒疫霉菌(Phytophthoracapsici)菌株1112、致病疫霉菌(Phytophthorainfestans)菌株14-3-GFP、病毒載體 TRV1和 TRV2均為筆者所在實(shí)驗(yàn)室配制與保存。所用試劑主要有高保真 DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、rTaq DNA聚合酶、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒等。所用儀器主要有 Eppendorf 4308電擊儀、PCR儀(Bio Rad)、熒光顯微鏡(Olympus)、旋轉(zhuǎn)搖床及生化培養(yǎng)箱等。

1.2 方 法

1.2.1 載體構(gòu)建 試驗(yàn)所用引物見表1，克隆基因PcGK4(PITG_05519)、PcAvh1(EU282489.1)和Pchmp1(PITG_00375)，酶切目的基因與 TRV2載體片段，用 T4連接酶進(jìn)行連接，產(chǎn)物通過電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)在選擇培養(yǎng)基上，采用菌落 PCR方法檢測陽性克隆，測序確認(rèn)載體構(gòu)建成功。

1.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及農(nóng)桿菌注射 載體構(gòu)建成功后，電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 C58C1感受態(tài)。挑取陽性單菌落培養(yǎng)在帶有抗性的液體 LB培養(yǎng)基中至OD600為0.8～1.0，收集菌體，配制加有乙酰丁香酮(1×10-4mol/L)的 MES重懸液，重懸菌體 OD600為0.6，將 TRV1和 TRV2按體積比1∶1混合后室溫靜置1～3 h，用注射器注射3周左右本氏煙草的第1片和第2片真葉，選擇 TRV2-GUS，TRV2-SGT1作為對照，TRV2-PDS作為報(bào)告基因，每個(gè)試驗(yàn)組選取8棵植物，注射18 d后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.2.3 離體葉片接種致病疫霉菌及熒光觀察 致病疫霉菌中加入5 mL預(yù)冷的無菌蒸餾水，至菌絲完全浸潤，置于4 ℃，用2 h觀察游動(dòng)孢子的釋放，并于顯微鏡下計(jì)數(shù)。

取 TRV2-GUS和 TRV2-GFP葉片涮洗干凈，吸干多余水分用濕水脫脂棉包裹葉柄處，放于底部鋪有濕水濾紙的塑料托盤中，在葉子左右兩邊對稱位置各接種1 000個(gè)致病疫霉菌的游動(dòng)孢子(15～20 μL)，保鮮膜封閉后放置于16 ℃黑暗培養(yǎng)箱，3 d后觀察發(fā)病情況。

用刀片劃取小塊平整致病疫霉菌侵染的病斑區(qū)域置于載玻片上，用水浸潤后用蓋玻片壓片，用奧林巴斯熒光顯微鏡(BX-51TRF，濾光器 BP450-480)進(jìn)行初步觀察并進(jìn)行圖像采集。

1.2.4 離體葉片接種辣椒疫霉菌及病斑統(tǒng)計(jì) 參考 Fan等[21]的方法培養(yǎng)辣椒疫霉菌及誘孢，取 TRV2-GUS、 TRV2-Pchmp1、TRV2-PcGK4和 TRV2-PcAvh1葉片，在葉片左右兩邊對稱位置各接種辣椒疫霉菌的游動(dòng)孢子1 000個(gè)(10～12 μL)，放于25 ℃黑暗保濕培養(yǎng)，2 d后觀察發(fā)病情況，并測量病斑直徑計(jì)算病斑面積和顯著性分析(*代表P≤0.05，**代表P≤0.01)。

1.2.5 半定量測定辣椒疫霉菌的定殖量接種辣椒疫霉菌2 d后，用打孔器收取接種點(diǎn)周圍病斑組織，參考 Fan等[21]用CTAB 法提取組織 DNA，本氏煙草、辣椒疫霉菌內(nèi)參基因NbActin、PcActin(表1)引物序列參照 Fan等[21]和Zhang等[22]的研究。半定量 RT-PCR方法程序設(shè)置為：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，50 ℃退火，延伸80 s，28個(gè)循環(huán)，PCR產(chǎn)物電泳跑膠后用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(BIO-RAD)拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于 VIGS的本氏煙草-疫霉菌 HIGS體系的建立

為確定 VIGS載體是否可以成功應(yīng)用于疫霉菌 HIGS 研究，在 TRV2-GUS和TRV2-GFP的葉片上接種帶有GFP標(biāo)記的致病疫霉菌株，觀察致病疫霉菌菌絲中的GFP熒光。圖1顯示，對比對照 TRV2-GUS和TRV2-GFP病斑區(qū)域的綠色熒光明顯減弱，說明 TRV2-GFP成功沉默了致病疫霉菌菌絲中的GFP。表明本研究利用 VIGS技術(shù)在本氏煙草中可實(shí)現(xiàn)疫霉菌基因的沉默，為篩選和鑒定可以抑制辣椒疫霉菌侵染的靶標(biāo)基因提供依據(jù)。

在TRV2-GUS和TRV2-GFP葉片上接種致病疫霉菌14-3-GFP的游動(dòng)孢子GFPlabeledP.infestansisolate 14-3-GFP zoospores were inoculated with TRV2-GUSand TRV2-GFP；3 d后，使用奧林巴斯熒光顯微鏡(BX-51TRF，過濾器BP450-480)在白平衡處理4倍鏡下進(jìn)行觀察并拍照 After 3 days,Olympusfluorescencemicroscope(BX-51TRF, filter BP450-480)was used and pictures were taken under 4 times ocular with white balance

圖1 TRV2-GFP成功沉默了GFP 標(biāo)記的致病疫霉菌株中的GFP
Fig.1 Silencing of GFP in GFP labeledP.infestansby TRV2-GFP

2.2 基于 VIGS的候選基因同源 siRNA 的表達(dá)對植株生長表型的影響

本研究將對照基因GUS、GFP、SGT1和辣椒疫霉菌基因Pchmp1、PcGK4和PcAvh1構(gòu)建到 TRV2 載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化在本氏煙草上進(jìn)行表達(dá)，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化18 d后觀察植物表型，結(jié)果顯示報(bào)告基因 TRV2-PDS出現(xiàn)白化現(xiàn)象，TRV2-SGT1表現(xiàn)植株矮小，葉面卷曲，TRV2-Pchmp1、TRV2-PcGK4和 TRV2-PcAvh1對比對照 TRV2-GUS在植株大小、葉片顏色及形態(tài)方面沒有明顯變化(圖2)。

圖2 沉默候選基因18 d后本氏煙草的生長表型Fig.2 Morphology of N.benthamiana plants at 18 days after TRV treatment

2.3 表達(dá)TRV2- PcGK4的植物接種辣椒疫霉菌后的表現(xiàn)

對 TRV2-Pchmp1、TRV2-PcGK4和 TRV2-PcAvh1的離體葉片接種辣椒疫霉菌的游動(dòng)孢子，2 d后觀察病斑，結(jié)果顯示，與對照 TRV2-GUS相比， TRV2-PcGK4葉片上的病斑面積顯著減小(圖3-A，3-B)，植物表現(xiàn)抗病表型，表明PcGK4在辣椒疫霉菌侵染的過程中起關(guān)鍵作用。TRV2-Pchmp1和TRV2-PcAvh1的病斑面積與對照 TRV2-GUS無顯著差異，植物無明顯抗病表型(圖3)。

2.4 辣椒疫霉菌的定殖量在 TRV2- PcGK4中的表現(xiàn)

對辣椒疫霉菌侵染的 TRV2-GUS、TRV2-PcGK4、TRV2-Pchmp1和 TRV2-PcAvh1的葉片病斑進(jìn)行打孔收樣，用 CTAB法提取基因組 DNA，以本氏煙草和辣椒疫霉菌的內(nèi)參基因作為引物，通過半定量 RT-PCR測定辣椒疫霉菌生物量。結(jié)果顯示，本氏煙草內(nèi)參基因條帶在對照TRV-GUS以及TRV2-PcGK4、TRV2-Pchmp1、TRV2-PcAvh1植物樣品中亮度一致，而辣椒疫霉菌內(nèi)參基因條帶在TRV2-PcGK4樣品中比對照 TRV2-GUS亮度明顯減弱(圖4-A)，表明定殖在 TRV2-PcGK4中的辣椒疫霉菌生物量顯著降低。TRV2-Pchmp1和 TRV2-PcAvh1檢測出的辣椒疫霉菌內(nèi)參基因條帶與對照亮度無明顯差異，表明定殖在上述樣品中的辣椒疫霉菌生物量沒有變化(圖4-B，4-C)。

A、C、E為病斑面積統(tǒng)計(jì)情況 A,C and E represent statistical analysis of lesion area；B、D、F為接種辣椒疫霉菌2 d后的葉片 B,D and F represent leaves inoculated withP.capsiciafter 2 days。本氏煙草重復(fù)3次結(jié)果一致，每個(gè)柱形圖中用于分析的病斑面積來自于8片葉片，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，“**”表示P<0.01 The experiments were repeated three times with similar results(n ≥ 8; one-sided Student’sttest,“**” indicatingP<0.01

圖3 TRV-PcGK4植物表現(xiàn)出對辣椒疫霉菌的抗性
Fig.3 TRV-PcGK4plants are resistance toP.capsici

葉片接種辣椒疫霉菌1112，2 d后取樣病斑組織提RNA進(jìn)行辣椒疫霉菌的生物量檢測 RNAs from leaves at 2 days afterP.capsici1112 inoculation was used forP.capsicibiomass quantification；1和2使用辣椒疫霉菌內(nèi)參引物 1 and 2 using theP.capsiciinternal primer for amplification；3和4使用本氏煙草內(nèi)參引物 3 and 4 usingN.benthamianainternal primer for amplification；2 和4以TRV2-GUScDNA為模板 2 and 4 Using TRV2-GUSas template；1和3以 TRV-PcGK4，TRV-Pchmp1，TRV-PcAvh1cDNA為模板 1 and 3 using TRV-PcGK4or TRV-Pchmp1or TRV-PcAvh1as template；本氏煙草內(nèi)參基因條帶大小為600 bp，辣椒疫霉菌內(nèi)參基因條帶大小為179 bp The size of the band fromN.benthamianainternal gene is 600 bp, and fromP.capsiciinternal gene is 179 bp；該試驗(yàn)結(jié)果在3次生物學(xué)重復(fù)中表現(xiàn)一致 The experiment was repeated three times with similar result

圖4 病斑部位辣椒疫霉菌生物量檢測
Fig.4 The biomass ofP.capsiciin the infected area

3 討 論

VIGS 是利用植物對RNA 病毒防御機(jī)制發(fā)展起來的一項(xiàng)技術(shù)，目前應(yīng)用于卵菌HIGS的研究還未見報(bào)道。本研究將VIGS 技術(shù)應(yīng)用于疫霉菌HIGS 研究，通過在TRV2-GFP和對照TRV2-GUS的葉片上接種帶有GFP標(biāo)簽的致病疫霉菌，發(fā)現(xiàn)TRV2-GFP病斑區(qū)域的致病疫霉菌菌絲中的GFP顯著降低，證明VIGS 技術(shù)在卵菌HIGS 體系中可行。隨后成功篩選到在辣椒疫霉菌侵染過程中起關(guān)鍵作用的候選基因PcGK4。

在植物病原菌傳播和感染寄主的過程中，病菌孢子形成和發(fā)病機(jī)制由包括 g蛋白和磷脂信號(hào)的細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。卵菌 GPCR-PIPKs(GKs)蛋白家族由7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(7-TM)和磷脂酰肌醇磷酸酯激酶(PIPK)結(jié)構(gòu)域組成，在此基礎(chǔ)上GKs有可能連接g蛋白和磷脂信號(hào)通路。致病疫霉菌GK4是G蛋白偶聯(lián)受體，屬于GKS(GPCR-PIPKS)蛋白家族，GK4基因的沉默和過表達(dá)不僅參與孢子萌發(fā)和菌絲延伸，而且參與孢子囊的裂解和早期侵染，在致病疫霉菌的侵染過程中起重要作用[20]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)沉默辣椒疫霉菌PcGK4后可以顯著降低辣椒疫霉菌的致病力，說明PcGK4在辣椒疫霉菌侵染過程中起關(guān)鍵作用。

并不是所有的目標(biāo)基因沉默后都可以抑制病原菌侵染[13]，目標(biāo)基因的選擇直接決定沉默效率的高低。本試驗(yàn)篩選到的PcGK4能顯著抑制辣椒疫霉菌的侵染，Pchmp1和PcAvh1處理的植物對比對照沒有明顯的抗病表型。分析原因，可能是在辣椒疫霉菌中存在Pchmp1功能冗余基因或者該基因沒有成功被沉默。PcAvh1已被報(bào)道是辣椒疫霉菌中的一個(gè)重要的 RXLR毒性效應(yīng)分子，在辣椒上能夠引起嚴(yán)重的黃化褪綠現(xiàn)象[20]，但在本試驗(yàn)中沒有表型，可能是由于該基因在侵染初期高量表達(dá)，沒有被HIGS 有效沉默。

HIGS技術(shù)目前已應(yīng)用于多個(gè)病原菌系統(tǒng)中，但在卵菌系統(tǒng)中存在爭議，在Zhang等[22]的報(bào)道中，利用 HIGS技術(shù)以寄生疫霉菌的PnPMA1基因(內(nèi)源質(zhì)膜氫離子通道蛋白)和報(bào)告基因GFP為研究對象進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化dsGFP的擬南芥未干擾寄生疫霉菌中的GFP熒光信號(hào)，寄生疫霉菌的靶標(biāo)基因PnPMA1轉(zhuǎn)錄水平未受到影響，同樣從病原組織分離的疫霉菌中未檢測到同源靶基因 siRNA分子的存在。在之后 Sanju等[13]的報(bào)道中，以馬鈴薯為寄主植物，對致病疫霉菌Avr3a基因運(yùn)用 HIGS技術(shù)進(jìn)行沉默，對比非轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)基因植株Avr3a基因的表達(dá)量下降，致病疫霉菌的生物定殖量降低，轉(zhuǎn)基因植物特異地表達(dá) siRNA，證明 HIGS技術(shù)在馬鈴薯-致病疫霉菌系統(tǒng)中可以有效應(yīng)用。Jahan等[14]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化dsGFP的馬鈴薯成功沉默了致病疫霉菌菌絲中的GFP基因。與 Jahan等[14]研究結(jié)果類似，本研究利用 TRV載體在本氏煙草中也沉默了致病疫霉菌菌絲中的GFP信號(hào)。對比Zhang等[22]在擬南芥中的研究，筆者認(rèn)為可能是寄主植物的差異導(dǎo)致HIGS 技術(shù)在卵菌中的應(yīng)用上產(chǎn)生了差異。

HIGS技術(shù)應(yīng)用在辣椒疫霉菌研究中的報(bào)道比較少見，Vega-Arreguín等[23]利用HIGS技術(shù)對一個(gè)被煙草(N.tabacum)識(shí)別的效應(yīng)蛋白 PcAvr3a1進(jìn)行沉默，結(jié)果促進(jìn)了辣椒疫霉菌在非寄主煙草(N.tabacum)上的定殖，表明 HIGS技術(shù)在辣椒疫霉菌體系中應(yīng)用可行，但并沒有涉及抑制辣椒疫霉侵染的相關(guān)基因，本試驗(yàn)首次利用 HIGS技術(shù)篩選到抑制辣椒疫霉菌侵染的基因PcGK4，對辣椒疫病的防控有指導(dǎo)意義。

現(xiàn)階段，HIGS技術(shù)非常關(guān)鍵的科學(xué)問題是如何證明植物產(chǎn)生的 siRNA成功進(jìn)入病原菌細(xì)胞并且誘導(dǎo)了靶標(biāo)基因的沉默，siRNA是通過何種途徑向疫霉菌進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)和累積的，在這些方面未有成熟的機(jī)制闡述。本試驗(yàn)中雖然篩選到沉默PcGK4在植物中具有抗病表型，但沒有檢測候選基因是否成功進(jìn)行沉默，之后可以通過定量PCR，Northern blot和RNA測序的方法檢測疫霉菌中目標(biāo)基因的沉默，并且可以在辣椒疫霉菌真正的寄主植物辣椒上驗(yàn)證之前的結(jié)果，解析PcGK4參與辣椒疫霉菌侵染的機(jī)理。