龍成燕，仝超群，陳若霓，陳仕江，卿玉玲，秦少容，周澤揚，李春峰

(1.西南大學(xué)，家蠶基因組生物學(xué)國家重點實驗室，重慶 400715；2.重慶太極醫(yī)藥研究院有限公司，重慶 401147；3.重慶市中藥研究院，重慶 400065)

冬蟲夏草是中國傳統(tǒng)的名貴中藥材，是由冬蟲夏草菌(Ophiocordycepssinensis)寄生于蝙蝠蛾屬(Thitarodesspp.)昆蟲幼蟲后，形成菌核和子座的復(fù)合體[1-2]。目前，由于長期的過度采挖造成野生資源匱乏，環(huán)境破壞嚴重，因此快速規(guī)?；厝斯づ嘀捕x夏草迫在眉睫[3]。而在整個人工培育冬蟲夏草過程中，冬蟲夏草寄主蝙蝠蛾幼蟲是一種地棲昆蟲，易受到天敵及土壤中的病原微生物侵襲而導(dǎo)致死亡，如粉棒束孢[4-5]、綠僵菌[6-7]等，寄主昆蟲的存活率低下從而限制了冬蟲夏草的產(chǎn)量。昆蟲在病原侵染后會激活防御系統(tǒng)，如Toll通路、IMD通路及復(fù)雜的酚氧化酶原級聯(lián)系統(tǒng)等[8]。其中，酚氧化酶原級聯(lián)系統(tǒng)通過包囊[9]、結(jié)節(jié)及黑化等途徑殺滅入侵的寄生物是昆蟲普遍的一種免疫機制，在防御病原過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[10]。

酚氧化酶(PO，EC1.14.18.1)又名酪氨酸酶，廣泛分布于各種動植物及微生物機體中，是一種含銅的酶，其可將單酚羥化成二酚，再使二酚氧化為醌，醌在非酶促條件下，最終形成黑色素[11]。在昆蟲發(fā)育過程中，PO以酚氧化酶原(Prophenoloxidase,PPO)的形式存在，PPO通過級聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)的酚氧化酶原激活蛋白酶(Prophenoloxidase activating proteinase，PAP)，切割、激活為活性的PO，參與昆蟲表皮的鞣化、黑化、硬化、傷口愈合等，構(gòu)成昆蟲免疫及防御反應(yīng)系統(tǒng)[12]。

PPO作為酚氧化酶的前體，在亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)[13]、岡比亞按蚊(Anophelesgambiae)[14]、煙草天蛾(Manducasexta)[15-17]與家蠶(Bombyxmori)[18]等昆蟲的研究中，關(guān)于其結(jié)構(gòu)、功能、特性等已有大量報道，對其在免疫防御反應(yīng)中的作用也進行了廣泛研究。而蝙蝠蛾作為冬蟲夏草的寄主，其PPO基因的研究還未見相關(guān)報道。小金蝠蛾(ThitarodesxiaojinensisTu)是四川省阿壩藏族羌族自治州小金縣及周邊地區(qū)冬蟲夏草的主要寄主昆蟲[19],生長發(fā)育快，人工培育成蟲的繁殖能力強，目前正在對這一蟲種資源進行人工擴繁。因此，本研究從冬蟲夏草寄主小金蝠蛾幼蟲中克隆獲得其酚氧化酶原基因，對其進行生物信息學(xué)分析，檢測其組織表達譜，旨在為進一步揭示該基因的功能提供參考，同時為后續(xù)探究病原與昆蟲互作具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

小金蝠蛾(Thitarodesxiaojinensis)幼蟲由太極集團位于四川康定的冬蟲夏草培育基地 提供。

RNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司；HiFi DNA Polymerase、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自全式金公司；熒光定量PCR試劑盒購自Roche公司；pMDTM19-T Vector購自TaKaRa；GeneRacerTMKit購自Invitrogen公司；RIPA裂解液購自碧云天生物技術(shù)公司；IPTG、X-gal購自生工生物工程(上海)股份有限公司，引物合成、測序由上海生工完成；M.sextaPPO兔多克隆抗體由余小強教授惠贈。

1.2 試驗方法

1.2.1 小金蝠蛾幼蟲的RNA提取及cDNA合成 取4齡幼蟲，分別收集幼蟲頭部、表皮、脂肪體、中腸、血淋巴等5 種組織，經(jīng)液氮研磨后，按照RNA提取試劑盒中操作方法進行總RNA提取、濃度測定，經(jīng)由反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作方法合成cDNA第一鏈，于-80 ℃保存。

1.2.2 小金蝠蛾幼蟲PPO基因cDNA序列克隆 通過西南大學(xué)家蠶基因組生物學(xué)國家重點實驗室前期對粉棒束孢侵染蝙蝠蛾幼蟲轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果分析(未發(fā)表)，發(fā)現(xiàn)一條注釋為蝙蝠蛾幼蟲酚氧化酶原的序列，以此設(shè)計引物來克隆蝙蝠蛾幼蟲PPO基因cDNA片段，引物具體信息見表1。PCR擴增反應(yīng)體系(50 μL)如下：正向引物和反向引物各1 μL，cDNA 1 μL，HiFi DNA Polymerase 1 μL，dNTPs(10 mmol/L) 1 μL， 10×Buffer 5 μL，ddH2O 40 μL，PCR反應(yīng)條件為 95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 130 s，循環(huán)35 次；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠、回收PCR產(chǎn)物，與pMD19-T Vector于16 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)化至EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細胞，涂布在含氨芐青霉素/IPTG/X-gal的LB平板，37 ℃過夜培養(yǎng)。從平板上挑選白色菌落培養(yǎng)，以菌液為模板，采用上述PCR程序鑒定，陽性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司完成測序鑒定。

根據(jù)上述克隆所得的序列設(shè)計特異性引物3′-GSP-1，引物序列見表1。按照GeneRacerTMKit試劑盒說明書(InvitrogenTMLife technologies)進行3′RACE的PCR擴增。PCR產(chǎn)物的分離、純化、連接、轉(zhuǎn)化及測序均同上述操作。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 采用NCBI ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)分析基因的預(yù)測讀碼框；使用ProtParam軟件(http://us.expasy.org/tools/protparam.html)計算蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量及等電點；信號肽預(yù)測用SignalPV 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)；通過NCBI上的Blastp(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blastp)及ClustalW進行TxPPO與其他物種PPO的同源性分析及多重序列比對；利用MEGA 7軟件完成系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，并進行1 000次Bootstrap檢驗重復(fù)；采用MEME-CHIP分析蛋白的基序(Motif)結(jié)構(gòu)(http://meme.nbcr.net/meme/intro.html)；采用NCBI-CDD對目的蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)。

1.2.4 熒光定量PCR 根據(jù)TxPPO基因 cDNA的ORF序列，利用引物設(shè)計軟件Primer5.0設(shè)計特異引物，以蝙蝠蛾GAPDH作為內(nèi)參基因(GenBank登錄號為ANS59104.1)，PPO和GAPDH基因引物序列見表1。以各組織的 cDNA為模板，通過熒光定量PCR技術(shù)，利用2-△Ct方法分析該基因在不同組織中mRNA的表達差異，△Ct=Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參基因)，調(diào)查TxPPO基因在小金蝠蛾幼蟲各組織中的轉(zhuǎn)錄表達情況。

1.2.5 免疫印跡分析(Western blot) 取小金蝠蛾幼蟲數(shù)頭并解剖，得到頭、脂肪體、中腸、表皮、血淋巴5 種組織，液氮研磨為粉末，然后添加適量RIPA裂解液，冰浴30 min，12 000 r/min， 4 ℃離心15 min，取上清即總蛋白，進行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，50 g/L脫脂奶粉溶液封閉，將膜置于含M.sextaPPO抗體 (1∶500)的封閉液中4 ℃孵育過夜，用TBS-Tween(0.05%)洗膜3 次，每次10 min，然后將膜轉(zhuǎn)入含有羊抗兔二抗(1∶8 000)的封閉液中，室溫輕搖1 h，洗膜3 次，膜置于ECL系統(tǒng)中，覆蓋ECL顯影液進行底物顯色曝光。

表1 小金蝠蛾幼蟲PPO基因克隆及熒光定量PCR引物Table 1 Primers used for PCR amplification and real-time PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 小金蝠蛾幼蟲酚氧化酶原基因cDNA序列克隆

對小金蝠蛾幼蟲總RNA提取后進行電泳檢測，結(jié)果如圖1-A，后以RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA第一鏈為模板，利用PPO-F1/ PPO-R1引物經(jīng)PCR擴增，獲得與預(yù)期產(chǎn)物大小(約2 200 bp)一致的條帶，測序、鑒定獲得TxPPO的CDS全長序列及5′UTR部分序列(圖1-B)。接著，以 3′RACE引物與3′GSP引物進行3′RACE擴增，獲得一個約為750 bp的條帶，經(jīng)測序鑒定為TxPPO 部分編碼序列和3′UTR序列(圖1-C)。通過RT-PCR和3′RACE序列拼接，獲得小金蝠蛾幼蟲PPO基因序列，長度為2 654 bp，具體序列信息已上傳到NCBI(GenBank：MK069990)。

A. 總RNA電泳檢測 Detection of total RNA；B. RT-PCR擴增 RT-PCR amplification；C. 3′RACE擴增 3′RACE amplification；M1.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Trans8K DNA marker DNA marker Trans8K DNA marker；M2.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)2kPlus DNA marker 2kPlus；圖A中1為小金蝠蛾總RNA Total RNA；圖B中1為cDNA的擴增產(chǎn)物 Product of cDNA amplification；圖C中1為 3′RACE擴增產(chǎn)物 Product of 3′RACE amplification

圖1 小金蝠蛾酚氧化酶原基因克隆
Fig.1 Molecular cloning ofTxPPOgene

2.2 小金蝠蛾幼蟲PPO基因生物信息學(xué)分析

通過NCBI ORF Finder對克隆所得的TxPPO進行開放閱讀框分析，發(fā)現(xiàn)一個2 070 bp的開放閱讀框,其位置在84～2 153 bp，編碼一個由689 個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，經(jīng)預(yù)測，該蛋白質(zhì)分子質(zhì)量約為79.31 ku，理論等電點 pI=5.91。該預(yù)測蛋白具有與其他鱗翅目昆蟲PPO相似的絲氨酸蛋白酶酶切位點，處于N端第51和52位氨基酸殘基之間(即PPO激活位點)，切割后，產(chǎn)生一個分子質(zhì)量為73.50 ku的活性酶。此外，該蛋白質(zhì)含有2 個高度保守的銅離子結(jié)合位點，分別位于202～245、346～413處，有1個thiolester-like位點，位于582～589處(圖2)。

在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載其他昆蟲PPO氨基酸序列，采用MEGA 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3-A)。結(jié)果表明，小金蝠蛾幼蟲PPO與S.serrataPPO親緣關(guān)系相距較遠，同源性較低，但和其他鱗翅目昆蟲酚氧化酶原-2(PPO2)聚為一支，尤其是與云杉芽卷蛾(Choristoneurafumiferana) PPO2、草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda) PPO2、甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)PPO、大蠟螟(Galleriamellonella)PPO2及棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)PPO2同源性較高，相似度分別為63.61%、63.03%、62.59%、 62.50%、62.45%。通過將TxPPO蛋白與其他昆蟲PPO蛋白的結(jié)構(gòu)域進行比對分析，發(fā)現(xiàn)TxPPO蛋白具有與其他昆蟲一致的3個保守結(jié)構(gòu)域，即Hemocyanin-N/M/C(圖3-B)。同時，運用ClustalW軟件對與小金蝠蛾幼蟲PPO相距較近的其他昆蟲PPO進行保守結(jié)構(gòu)域的多重序列比對，發(fā)現(xiàn)Hemocyanin-M結(jié)構(gòu)域中CuA及CuB兩個銅結(jié)合位點的氨基酸序列及其內(nèi)部的6 個組氨酸殘基均高度保守(圖4)。此外，利用MEME-CHIP工具分析了上述下載的PPO蛋白序列的基序組成，共預(yù)測出20 個Motif(表2)，結(jié)果表明，在同一個目內(nèi)，大多數(shù)成員的Motif組成基本相同，不同目內(nèi)Motif組成有一定差異。TxPPO蛋白的Motif分布模式與亞洲玉米螟、煙草天蛾、家蠶等昆蟲的PPO2高度相似，基序組成也比較保守，但與鋸緣青蟹(Scyllaserrata)的PPO親緣關(guān)系相距較遠，基序組成的保守程度較低(圖3-C)。

圖中箭頭表示推測的Tx-PPO激活位點，下劃線標(biāo)示的是兩個銅離子結(jié)合位點，矩形框表示thiolester-like位點 Arrow showed a predicted cleavage site for proteolytic activation of the TxPPO; two copper binding sites were underlined; thiolester-like site was boxed

圖2 小金蝠蛾P(guān)PO基因cDNA推導(dǎo)的氨基酸序列
Fig.2 cDNA sequence and deduced amino sequence ofPPOgene ofThitarodesxiaojinensis

2.3 小金蝠蛾幼蟲TxPPO基因表達分析

通過熒光定量PCR分析TxPPO基因在小金蝠蛾幼蟲多個組織中的mRNA表達情況，結(jié)果如圖5-A所示，TxPPO基因在所檢測幼蟲的各個組織中呈差異表達，血淋巴中檢測到最高的轉(zhuǎn)錄水平，在中腸中檢測到最低的轉(zhuǎn)錄表達，且血細胞中mRNA表達水平分別相對于頭部、脂肪體、表皮、中腸中轉(zhuǎn)錄表達的719 倍、1 144 倍、 2 772倍、15 852倍。

2.4 小金蝠蛾幼蟲PPO蛋白分布

通過對小金蝠蛾幼蟲多個組織的總蛋白提取，后分別將總蛋白通過SDS-PAGE進行分離(圖5-B)，Western blot分析TxPPO在幼蟲上述不同組織中的蛋白水平分布情況，結(jié)果顯示，TxPPO主要在血淋巴和頭部分布，在表皮和中腸組織中也有分布，而在脂肪體中僅檢測到微弱的條帶(如圖5-C)。

3 討 論

酚氧化酶原(PPO)是一種含銅金屬酶，通常以無活性形式存在昆蟲體內(nèi)，主要通過特異性絲氨酸蛋白酶的級聯(lián)反應(yīng)活化為酚氧化酶(PO)[20]。各個物種的PPO基因有不同數(shù)量的亞型，多至10 個，但鱗翅目昆蟲如家蠶、煙草天蛾、小菜蛾(Plutellaxylostella)、大蠟螟的PPO都有2 個亞型，即PPO1和PPO2[18,21-24]。同源性分析表明，本研究克隆的蝙蝠蛾幼蟲PPO基因可能為PPO2。在蝙蝠蛾幼蟲中是否也存在PPO1基因，還有待進一步研究。

在PPO基因組織表達方面，PPO主要表達于昆蟲的血細胞、血漿中。有研究報道，岡比亞按蚊的中腸、斯氏按蚊(Anophelesstephensi)的脂肪體及亞洲玉米螟的體壁中都有PPO的分布，但在亞洲玉米螟(O.furnacalis)的脂肪體和體壁中未檢測到PPO基因轉(zhuǎn)錄水平的表達[14,25-26]。通過對蝗蟲(Locustamigratoria)、棉鈴蟲、亞洲玉米螟等昆蟲研究發(fā)現(xiàn)，PPO不但分布于血細胞中，也存在于血漿中；而蟑螂(Periplanetaamericana)的PPO主要存在于血細胞中，家蠶和煙草天蛾的PPO多存在于血漿中[27-29]。此外，家蠶PPO1基因僅在家蠶的血液中有表達，而PPO2基因在家蠶所有組織中均有表達，表達量從高至低順序為血液、頭部、中腸、表皮、精巢、卵巢和脂肪體[30]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蝙蝠蛾幼蟲PPO基因主要在血淋巴轉(zhuǎn)錄表達，在頭、脂肪體、表皮及中腸組織中也都有少量mRNA水平的表達，但在蛋白分布方面，蝙蝠蛾幼蟲PPO主要在頭、血淋巴中分布，在表皮和中腸組織中也檢測到其分布，但豐度比頭部及血淋巴中要低，而在脂肪體中蛋白分布最少，僅檢測到微弱的條帶。因此，本研究為進一步解析PPO基因在蝙蝠蛾幼蟲免疫反應(yīng)特別是黑化包被病原過程中的作用奠定基礎(chǔ)，也為后續(xù)研究冬蟲夏草菌在蝙蝠蛾幼蟲體內(nèi)長期增殖的互作機理提供參考。

A.系統(tǒng)發(fā)育樹 Phylogenetic tree；B.PPO蛋白保守結(jié)構(gòu)域 Conserved domains of PPO proteins；C.小金蝠蛾幼蟲及其他昆蟲PPO蛋白的保守基序分析(不同基序分別由20 個不同顏色的盒子表示，Motif具體序列見表2 Comparison of the conserved motifs ofThitarodesxiaojinensisPPO with those of other insects (The motifs,numbers 1-20,are displayed in different colored boxes. The sequence information for each motif is provided in Table 2.其他物種昆蟲PPO蛋白登錄號如下 PPO sequences of other insects are deposited in GenBank：Aedesaegypti(AaPPO1:AAG02219; AaPPO2:AAG02218)，Anophelesgambiae(AgPPO1: AAB94671; AgPPO2: AAB94672)，Bombyxmori(BmPPO1:AAG09304; BmPPO2:AAG09303)，Choristoneurafumiferana(CfPPO1: ABW16859; CfPPO2:ABW16862)，Culexquinquefasciatus(CqPPO:EDS44936)，Drosophilamelanogaster(DmPPO2:NP610443)，Doratiferapinguis(DpPPO2:ACM41728)，Galleriamellonella(GmPPO1:AAK64363; GmPPO2:AAQ75026)，Scyllaserrata(SsPPO: ABD90511)，Helicoverpaarmigera(HaPPO2:AAZ52554)，Heliothisvirescens(HvPPO1:ABH10016; HvPPO2: ABM65701)，Holotrichiadiomphalia(HdPPO1: BAC15602; HdPPO2: BAC15603)，Hyphantriacunea(HcPPO1: AAC34251; HcPPO2:AAC34256)，Locustamigratoria(LmPPO1:ACN81830;LmPPO2:ACN81829)，Manducasexta(MsPPO1: AAC05796;MsPPO2: AAC37243)，Muscadomestica(MdPPO:AAR84669)，Ostriniafurnacalis(OfPPO2: ABC59699)，Plodiainterpunctella(PiPPO: AAU29555)，Plutellaxylostella(PxPPO2:ACS36209)，Spodopteraexigua(SePPO: ABS59653)，Spodopterafrugiperda(SfPPO1: ABB92834; SfPPO2:ABB92835)，Spodopteralitura(SlPPO: AAW22859)，Tenebriomolitor(TmPPO: BAA75470)，Triboliumcastaneum(TcPPO1: AAX84204; TcPPO2: AAX84205)，Sarcophagabullata(SbPPO:AAD45526)

圖3 基于PPO氨基酸序列相似性構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹及PPO蛋白保守結(jié)構(gòu)域和保守基序分析
Fig.3 Construction of phylogenetic tree and analysis on conserved protein domains and motifs in insect PPO

3個保守結(jié)構(gòu)域分別為Hemocyanin-N/M/C，CuA及CuB代表兩個銅結(jié)合位點，紅色的“*”表示銅結(jié)合位點內(nèi)的6個保守組氨酸殘基 Three conserved domains are Hemocyanin-N/M/C,respectively. The two copper binding sites are CuA and CuB,and red asterisks “*” mark six conserved histidine residues.

圖4 PPO蛋白的3個保守結(jié)構(gòu)域氨基酸序列的多重序列比對Fig.4 Multiple sequence alignment of the three conserved domains of PPO proteins

A.熒光定量PCR Real-time quantitative PCR analysis of TxPPO transcripts；B.蝙蝠蛾幼蟲各組織總蛋白SDS-PAGE分析 SDS-PAGE analysis of total protein inT.xiaojinensis; C.Western Blot

圖5 小金蝠蛾幼蟲TxPPO基因的組織表達譜
Fig.5 Tissue expression analysis ofTxPPOgene fromThitarodesxiaojinensis